膽道閉鎖及淤膽型嬰兒肝炎綜合征的microRNA血清標(biāo)志物檢測及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一類可用于區(qū)分膽道閉鎖及齡 膽型嬰兒肝炎綜合征患兒的microRNA血清標(biāo)志物的檢測W及用途。本發(fā)明還涉及檢測所 述microRNA標(biāo)志物的芯片和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽道閉鎖是W肝內(nèi)外膽管閉鎖和梗阻性黃痘為特點的小兒外科常見崎形，其發(fā)病 率為1/5000-1/8000。是一種發(fā)生于兒童，W進(jìn)行性硬化性膽管炎癥，各級膽管梗阻和破壞， 肝纖維化和肝硬化形成為基本病理特點的疾病。許多患兒往往在確診膽道閉鎖時即已存在 嚴(yán)重的肝臟纖維化，并且很快發(fā)展成為肝硬化，最終導(dǎo)致肝功能衰竭。因此，膽道閉鎖的盡 早診斷就愈發(fā)顯得迫切。
[0003] 基因作為生命的遺傳介質(zhì)，在生物體的生、老、病、死中處于基礎(chǔ)內(nèi)因的地位。絕大 部分基因通過轉(zhuǎn)錄生成核糖核酸，再翻譯生成蛋白質(zhì)而發(fā)揮生物學(xué)功能。
[0004] microRNA(微小RNA)是一類在較高等的真核生物體內(nèi)廣泛存在的，長度約21到 23個堿基的單鏈RNA分子。它可W通過堿基配對原則特異性地與一些mRNA上的祀位點相 結(jié)合，引起祀mRNA降解或翻譯抑制，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平對祀基因進(jìn)行調(diào)控。從而抑制轉(zhuǎn)錄 后基因表達(dá)，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞周期、生物體發(fā)育時序等方面起重要作用。在動物中，一 個微RNA通常可W調(diào)控數(shù)十個基因。
[0005]microRNA來源于長度約為lOOObp的長鏈RNA初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（Pri-microRNA)， Pri-microRNA分子在細(xì)胞核中經(jīng)化osha酶剪切形成長度約60-8化t的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 microRNA前體。microRNA前體轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)后，被Dicer酶進(jìn)一步切割成長約22nt的雙鏈 microRNA。雙鏈microRNA解開后，成熟的microRNA進(jìn)入RNA誘導(dǎo)基因沉默復(fù)合物，與互補 mRNA完全或不完全配對，降解祀mRNA或阻遏其表達(dá)。
[0006] 盡管microRNA在細(xì)胞總RNA中所占的比重很小，但由于它可W高效地對所有具有 祀位點的mRNA產(chǎn)生調(diào)控作用，microRNA在生物體的發(fā)育乃至疾病的發(fā)生、發(fā)展過程所起的 作用仍不可小視。然而，迄今為止，本領(lǐng)域?qū)τ谂c膽道閉鎖相關(guān)的microRNA了解甚少，因 此本領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步地分離各種microRNA,尤其是與疾病的發(fā)生、預(yù)后或檢測有關(guān)的 microRNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一類新的、可用于區(qū)分膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征患 兒的microRNA標(biāo)志物及其在制備相關(guān)疾病檢測制劑中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的另一目的就是提供所述microRNA標(biāo)志物的檢測方法，該方法比現(xiàn)有檢 測技術(shù)省時、靈敏度與準(zhǔn)確度更高、成本更低、和/或更高效。
[0009]本發(fā)明提供了hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429在 制備膽道閉鎖診斷制劑中的應(yīng)用。
[0010]例如，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 作為區(qū)分膽 道閉鎖或者齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒的microRNA血清標(biāo)志物。又如，將hsa-miR-150、 hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429作為治療或者輔助治療膽道閉鎖或者齡 膽型嬰兒肝炎綜合征的藥劑的篩藥祀標(biāo)。
[0011]試驗表明，膽道閉鎖血清中，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化表達(dá)量 高于齡膽型嬰兒肝炎綜合征，而hsa-miR-4429表達(dá)量下降。表達(dá)量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義上 的顯著性差異。
[0012] 本發(fā)明提供 了檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和 hsa-miR-4429的表達(dá)的方法：
[0013] (1)米用microRNA芯片技術(shù)檢測膽道閉鎖血清中hsa-miR-150、hsa-miR-4689、 hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的表達(dá)；
[0014] 或者
[0015] (2)采用英光定量PCR技術(shù)檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、 hsa-miR-4429的表達(dá)情況。
[0016]所述的檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的表 達(dá)所用的探針，包括：
[0017]CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG(沈Q ID N01);
[0018]UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(沈Q ID N02);
[001 引UUGAGGAGACAUGGUGGGGGCC(SEQID N03);
[0020] AAAAGCUGGGCUGAGAGGCG(SEQID N04)。
[0021] 本發(fā)明提供了一種芯片，該芯片偶聯(lián)檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、 hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的探針。
[0022] 上述芯片，可W用于檢測樣品中hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和 hsa-miR-4429的表達(dá)；檢測方法包括步驟：
[002引 （1)提供分離的血清RNA樣品，在所述的RNA上設(shè)置標(biāo)記物；
[0024]似將（1)的RNA與所述的芯片接觸，使所述的RNA與固相載體上的寡核巧酸探針 發(fā)生雜交反應(yīng)，從而在固相載體上形成"寡核巧酸探針-RNA"二元復(fù)合物；
[002引 做檢測似形成的二元復(fù)合物的標(biāo)記物，從而確定血清RNA樣品中 hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的表達(dá)。
[0026]所述的檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的表 達(dá)所用的探針，包括：
[OOW] CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG(沈Q ID N01);
[0028] UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(沈Q ID N02);
[002引 UUGAGGAGACAUGGUGGGGGCC(SEQID N03);
[0030]AAAAGCUGGGCUGAGAGGCG(SEQID N04)。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒。
[0032] 所述的試劑盒含有上述芯片，或者含有檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、 hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429 的探針。
[0033]所述的檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和hsa-miR-4429的表 達(dá)所用的探針，包括：
[0034] CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG(沈Q IDN01);
[00巧]UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU(沈Q IDN02);
[003引 UUGAGGAGACAUGGUGGGGGCC (SEQ IDN03);
[0037] AAAAGCUGGGCUGAGAGGCG (SEQ IDN04)。
[0038] 所述的試劑盒中可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑。
[0039]所述的試劑盒可W包括檢測hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和 hsa-miR-4429的引物對。
[0040]所述的試劑盒還可W包括hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化和 hsa-miR-4429的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0041] 所述的試劑盒能夠用于檢測區(qū)分膽道閉鎖或者齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒的 microRNA血清標(biāo)志物。
[0042] 具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒的 差異表達(dá)microRNA可作為診斷標(biāo)志物。
[0043]本發(fā)明中，多方面試驗表明hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、 hsa-miR-4429可作為膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征的分子標(biāo)志及其藥物篩選祀標(biāo)：
[0044] 1，利用microRNA芯片（Agilent human miRNA8*60K V18. 0)比較了膽道閉鎖及 齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒血清的microRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖血清中，hsa-miR-150、 hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化表達(dá)量高于齡膽型嬰兒肝炎綜合征，而hsa-miR-4429表達(dá) 量下降（p<0.005,差異大于2倍)。
[0045] 2,利用英光定量PCR技術(shù)，對差異表達(dá)的microRNA進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)膽道閉鎖血 清中，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化表達(dá)量高于齡膽型嬰兒肝炎綜合征，而 hsa-miR-4429 表達(dá)量下降（p<0. 01)。
[0046] 3,利用英光定量PCR技術(shù)，通過雙盲檢查，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用hsa-miR-150、 hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-4429區(qū)分膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征患 兒的靈敏度和特異性均大于90%。
[0047]本發(fā)明的試驗結(jié)果表明，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、 hsa-miR-4429在膽道閉鎖及齡膽型嬰兒肝炎綜合征患兒血清中表達(dá)明顯差異，聯(lián)合應(yīng)用可 作為具有較高靈敏度與準(zhǔn)確度的診斷標(biāo)志物，有效地提高膽道閉鎖的診斷水平。
[004引在第二方面，本發(fā)明提供了用于檢測的hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-4429檢測芯片、檢測試劑盒、基因診斷用的英光定量PCR 試劑盒。所述試劑盒中，其包括基于hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、 hsa-miR-4429的特異性探針與引物對。
[0049]本發(fā)明經(jīng)實驗證實，hsa-miR-150、hsa-miR-4689、hsa-miR-92a-化、hsa-miR-4429可作為一種有效的診斷標(biāo)志物。具體的，hsa-miR-150、hsa-miR-