肺癌代謝標(biāo)志物在肺癌診斷和治療中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及腫瘤的診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥仍然是對(duì)人類(lèi)健康的最致命威脅之一。實(shí)體瘤對(duì)大多數(shù)上述死亡負(fù)有責(zé)任。 雖然某些癌癥的醫(yī)學(xué)治療中已經(jīng)取得了重大進(jìn)步，但是所有癌癥的總體5年存活率在最近 20年里只改進(jìn)了約10%。癌癥（或稱(chēng)作惡性腫瘤）以不受控制的方式快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，使 得及時(shí)檢測(cè)和治療極端困難。近30年來(lái)，隨著大氣污染和吸煙等外部因素的影響，我國(guó)肺 癌發(fā)病率也日趨增_，在上海、北點(diǎn)和天津等的確，占各種惡性腫瘤的首位。而治療的如提 又基于對(duì)診斷的明確，肺癌的早期診斷是一項(xiàng)艱巨而重大的任務(wù)。
[0003] 目前對(duì)肺癌的診斷方法可以分為兩類(lèi)，一種為無(wú)創(chuàng)診斷，主要包括影像學(xué)檢查和 痰液細(xì)胞學(xué)檢查，另一類(lèi)是有創(chuàng)診斷，主要為氣管鏡檢查和外科診斷方法。其中影像學(xué)檢查 主要為X射線、CT、MRI等。而外科診斷方法包括支氣管活檢（TBLB)、經(jīng)皮穿刺（NB)、縱膈 鏡檢查、電視胸腔鏡以及淋巴結(jié)活檢等。雖然，最近有研究發(fā)現(xiàn)超氧化歧化酶、單胺氧化酶 聯(lián)合酶檢測(cè)對(duì)肺癌診斷有一定意義，肺癌患者血清S0D活性明顯低于肺良性病變及正常健 康人，但是由于其評(píng)價(jià)指標(biāo)單一，準(zhǔn)確性低，需要結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行診斷。肺癌作為嚴(yán)重危 害人類(lèi)健康和生命的惡性腫瘤，篩選出具有肺癌早期診斷和預(yù)后判斷價(jià)值的新型腫瘤代謝 標(biāo)志物，用于肺癌患者的早期診斷和治療，從而提高肺癌患者的生存率是肺癌診斷和治療 過(guò)程中亟待解決的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本申請(qǐng)的目的在于提供一種肺癌早期診斷以及術(shù)后愈后效果評(píng)價(jià)的的血液檢測(cè) 方法。
[0005] 本申請(qǐng)研究方案：
[0006] (1)肺癌數(shù)據(jù)庫(kù)建立、樣品采集處理與檢測(cè)
[0007] ①建立和整理肺癌病人以及健康對(duì)照人群的血樣標(biāo)本庫(kù)；
[0008] ②建立肺癌術(shù)后隨訪系統(tǒng)和隨訪數(shù)據(jù)庫(kù)，收集和整理病人的病理檔案、術(shù)后治療 方案及效果、術(shù)后生存情況等數(shù)據(jù)；
[0009] ③樣品采集及與處理：收集健康正常體檢者和肺癌患者手術(shù)前及術(shù)后7天空腹 血標(biāo)本各5ml于無(wú)菌促凝BD真空采血管中，2500r/min，4°C離心5min，取上層血清，保存 于-80°C冰箱中待用。
[0010] ④LC-Q-T0F/MS檢測(cè)
[0011] ⑤GC/MS檢測(cè)
[0012] ⑵研究肺癌病人血清代謝標(biāo)志物與肺癌診斷及療效監(jiān)測(cè)的關(guān)系
[0013]①運(yùn)用主成分分析（PCA)、最小二乘判別分析（PLS-DA)和正交最小二乘分析 (0PLS)等多變量統(tǒng)計(jì)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；
[0014] ②差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定；
[0015] ③血清代謝標(biāo)志物與肺癌診斷及療效監(jiān)測(cè)的關(guān)系。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1 :正常對(duì)照組（a)、肺癌術(shù)前組（b)和肺癌術(shù)后組（c)高效液相色譜-四級(jí) 桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析（LC-Q-T0F/MS)總尚子流圖
[0017] 圖2 :正常對(duì)照組（a)、肺癌術(shù)前組（b)和肺癌術(shù)后組（c)氣相色譜-質(zhì)譜分析 (GC/MS)總離子流圖
[0018] 圖3 :基于高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-T0F/MS)的正常對(duì)照組 (A)、肺癌術(shù)前組（B)和肺癌術(shù)后組（C)主成分分析（PCA)得分圖
[0019] 圖4 :基于高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-T0F/MS)的正常對(duì)照組 (A)、肺癌術(shù)前組（B)和肺癌術(shù)后組（C)最小二乘判別分析（PLS-DA)得分圖
[0020] 圖5 :基于高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-T0F/MS)的正常對(duì)照組 (A)、肺癌術(shù)前組（B)和肺癌術(shù)后組（C)正交最小二乘分析（0PLS)得分圖
[0021]圖6 :基于氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS)的正常對(duì)照組（A)、肺癌術(shù)前組⑶和肺癌術(shù) 后組（C)主成分分析（PCA)得分圖
[0022] 圖7 :基于氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS)的正常對(duì)照組（A)、肺癌術(shù)前組⑶和肺癌術(shù) 后組（C)最小二乘判別分析（PLS-DA)得分圖
[0023] 圖8 :基于氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS)的正常對(duì)照組（A)、肺癌術(shù)前組⑶和肺癌術(shù) 后組（C)正交最小二乘分析（0PLS)得分圖
[0024] 圖9 :基于高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-T0F/MS)的正常對(duì)照組 (A)、肺癌術(shù)前組（B)和肺癌術(shù)后組（C)的差異最大代謝標(biāo)志物箱式圖
[0025]圖10 :基于氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS)的正常對(duì)照組（A)、肺癌術(shù)前組⑶和肺癌術(shù) 后組（C)的差異最大代謝標(biāo)志物箱式圖
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)驗(yàn)例：
[0027] 1、一般資料：2012年1月至2013年1月在湖州市中心醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確 診的肺癌患者30例，年齡43-76歲，平均63. 9歲；其中男21例，女9例；腺癌15例，鱗癌 12例，大細(xì)胞肺癌3例。對(duì)照組30例，均為湖州市內(nèi)健康正常體檢者，年齡39-78歲，平均 60.4歲；其中男19例，女11例。本研究經(jīng)湖州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受檢者均 知情同意參加此項(xiàng)研究。
[0028] 2、標(biāo)本采集：收集健康正常體檢者和肺癌患者手術(shù)前空腹血標(biāo)本各5ml于無(wú)菌促 凝BD真空采血管中，2500r/min，4°C離心5min，取上層血清，保存于-80°C冰箱中待用。
[0029] 3、LC-Q-T0F/MS血清樣本預(yù)處理：將低溫保存的血清樣本置室溫解凍搖勻，取 100yL的樣本加入300yL甲醇，渦漩震蕩30s，4°C靜置20min;所有樣本進(jìn)行冷凍離心 (12000r/min，4°C，15min)，取200iiL上清液，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶，進(jìn)行LC-Q-T0F/MS檢測(cè)分析。
[0030]4、GC/MS血清樣本預(yù)處理：將低溫保存的血清樣本置室溫下解凍，取100i!L的樣 本加入300iiL冷HPLC級(jí)乙醇，渦漩震蕩30s，4°C靜置20min，冷凍離心。加入80iiL冰冷 HPLC級(jí)甲醇，渦漩震蕩30s。取出后，冷凍離心（12000rpm，4°C，15min)，取150iiL上清液， 轉(zhuǎn)入玻璃衍生小瓶，加入10UL的內(nèi)標(biāo)溶液（二氯苯丙氨酸，濃度為0. 02mg/mL)，置4°C溫 和氮?dú)庀麓蹈?；向玻璃衍生小瓶中加?0yL的20mg/mL甲氧胺鹽酸吡啶溶液，強(qiáng)烈震蕩 30s，于37°C肟化反應(yīng)90min;取出后加入30iiL的BSTFA(含1 %TMCS)的衍生試劑，于70°C 反應(yīng)60min。取出樣本，室溫放置30min，進(jìn)行GC/MS代謝組學(xué)分析。
[0031 ] 5、液相/質(zhì)譜（LC-MS)分析條件：采用高效液相-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜 (Agilent, 1290InfinityLC，6530UHDandAccurate-MassQ-T0F/MS)技術(shù)分析肺癌患者和 健康正常體檢者血清代謝圖譜。
[0032] (1)色譜條件：AgilentC1S 色譜柱（lOOmmX2. 1mm，1. 8iim),流速 0? 4ml/min,柱 溫為40°C，流動(dòng)相A:0. 1 %甲酸-水，B:0. 1 %甲酸-乙腈，進(jìn)樣量為4yl，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度 4°C。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。
[0033] 表1色譜梯度洗脫程序
[0034]
[0035] (2)質(zhì)譜條件：ESI離子源，采用正離子掃描模式，以氮?dú)庾鳛殪F化、錐孔氣。毛細(xì) 管電壓4kV、錐孔電壓35kV、離子源溫度KKTC;脫溶劑氣溫度350°C、反向錐孔氣流50L/h、 脫溶劑氣600L/h、萃取錐孔4V。離子掃描時(shí)間0. 03s，掃描時(shí)間間隔0. 02s，數(shù)據(jù)采集范圍： 50-1000m/z〇
[0036] 6、氣相/質(zhì)譜（GC/MS)分析條件：采用氣相色譜-質(zhì)譜（Agilent7890A/5975CGC/ MS)技術(shù)分析肺癌患者和健康正常體檢者血清代謝圖譜。毛細(xì)管色譜柱為AgilentJ&W Scientific公司的HP-5ms(30mX0. 25mmX0. 25urn)。儀器參數(shù)設(shè)定為：進(jìn)樣 口溫度 280°C， EI離子源溫度230°C，四極桿溫度150°C，高純氦氣（純度大于99. 999% )作為載氣，不分流 進(jìn)樣，進(jìn)樣量1. 〇PL。升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0°C，維持2min，10°C/min的速度升至320°C， 并維持6min。采用全掃描模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)范圍為50-550 (m/z)。
[0037] 7、LC-Q-TOF/MS數(shù)據(jù)處理：米用AgilentMassHunter工作站（Qualitative AnalysisVB03. 01，Agilent,USA)記錄每個(gè)血清樣本的總離子流色譜圖（TIC)進(jìn)行可視化 檢查。在R軟件平臺(tái)下采用自寫(xiě)的程序代碼提取原始數(shù)據(jù)信號(hào)（峰識(shí)別和積分），然后進(jìn) 行保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和反卷積分析（質(zhì)譜碎片歸屬），最后在Excel軟件中進(jìn)行后期編 輯，將結(jié)果組織為二維數(shù)據(jù)矩陣，包括變量（保留時(shí)間Rt，質(zhì)荷比m/z)、觀察量（樣本）和 積分面積。差異性代謝物的定性方法為：搜索代謝物二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（METLIN)，比較質(zhì)譜 的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass。