監(jiān)測(cè)和分析代謝活性分布的方法及其診斷和治療用途
【專利摘要】提供一種測(cè)量細(xì)胞的代謝活性（MA）的方法。該方法包括獨(dú)立地測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由于以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布：（i）非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；（ii）非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；以及（iii）揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；其中，時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示細(xì)胞的代謝活性。還提供利用該試驗(yàn)的臨床方法。
【專利說明】監(jiān)測(cè)和分析代謝活性分布的方法及其診斷和治療用途
[0001]發(fā)明的領(lǐng)域和背景
[0002]本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及監(jiān)測(cè)和分析代謝活性分布的方法及其診斷或治療用途，或具體地涉及通過血液樣品的代謝活性監(jiān)測(cè)作出癌癥診斷。
[0003]疾病治療中的主要問題在于早期檢測(cè)和分期。早期檢測(cè)使得能夠從疾病的發(fā)作治療性處理，在許多情況下導(dǎo)致成功的治療。疾病的分期可以表明對(duì)于最佳治療可能是決定性的藥物療法的適當(dāng)方案。例如現(xiàn)今，數(shù)百萬人患有癌癥或已患過癌癥。在美國(guó)，癌癥是第二種最常見的死亡原因，其僅次于心臟病。在美國(guó)，每四例死亡中癌癥幾乎占I例。癌癥得到診斷和治療的越快，存活機(jī)會(huì)就越好。
[0004]用于檢測(cè)癌癥的所有已知的方法集中在主要鑒定惡性組織和/或分泌進(jìn)入循環(huán)的其病理癌癥生物標(biāo)志物。然而，遺憾地是，這些診斷方法僅在疾病的相對(duì)晚期階段有效。
[0005]瓦博格效應(yīng)是下面的觀察結(jié)果:大部分癌細(xì)胞主要通過高的糖酵解速率和之后的細(xì)胞溶質(zhì)中的乳酸生產(chǎn)η產(chǎn)生能量，而不是通過與大部分正常細(xì)胞一樣的比較低的糖酵解速率和之后的在線粒體中的丙酮酸的氧化來產(chǎn)生能量[Kim Jff, DangCV(2006)." Cancer' s molecular sweet tooth and the Warburg effect".CancerRes.66(18):8927 - 30]。其次，在20世紀(jì)20年代，Otto Warburg發(fā)現(xiàn)與正常的分化細(xì)胞不同，癌細(xì)胞19’2°主要依賴于有氧糖酵解而不是依賴于線粒體氧化磷酸化來產(chǎn)生ATP作為細(xì)胞過程所需的能量的燃料。這個(gè)歷史上的現(xiàn)象被稱為“瓦博格效應(yīng)”21。Otto Warburg假設(shè)代謝中的這種變化是癌癥的根本原因[Warburg 0(1956)." On the origin ofcancer cells".Science 123 (3191): 309 - 14],現(xiàn)在這個(gè)陳述被稱作瓦博格假說。大約50年之后，也在體外的活化淋巴細(xì)胞中觀察到瓦博格效應(yīng)，參見例如，Maclver等人2008J.Leukocyte Biology 84:1-9 ;以及 DeBerardinis Cell Metabolism 7:11-20。還在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)瓦博格效應(yīng)，在免疫系統(tǒng)中，活化T細(xì)胞22’23快速地超誘導(dǎo)糖酵解，例如通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)的過表達(dá)24。
[0006]瓦博格效應(yīng)具有重要的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，如臨床上利用惡性腫瘤的高有氧糖酵解以通過使用正電子發(fā)射斷層顯像(PET)對(duì)2-18F-2-脫氧葡萄糖(FDG)(放射性的且修飾的己糖激酶底物)的吸收進(jìn)行成像來診斷和監(jiān)測(cè)癌癥的治療反應(yīng)。還參見W02007/102146。然而，這些方法由于需要高科技設(shè)施或原位組織活檢而是繁瑣且昂貴的。
[0007]因此，需要用于早期和簡(jiǎn)單診斷的非侵入性方法。
[0008]發(fā)明概述
[0009]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種測(cè)量細(xì)胞的代謝活性(MA)的方法，該方法包括獨(dú)立地測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布(acidification profile):
[0010](i)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0011](ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0012](iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0013]其中，時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示細(xì)胞的代謝活性。[0014]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種在有此需要的受試者中診斷與改變的代謝活性相關(guān)的疾病的方法，該方法包括:
[0015](a)提供包括細(xì)胞的受試者的生物樣品；
[0016](b)獨(dú)立地測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布:
[0017]( i )非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0018](ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；以及
[0019](iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0020]其中，時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示細(xì)胞的代謝活性，并且其中與在相同條件下檢測(cè)的正常的未受影響的細(xì)胞樣品的代謝活性相比，所述代謝活性的轉(zhuǎn)變指示與改變的代謝活性相關(guān)的疾病。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種單獨(dú)地優(yōu)化疾病治療的方法，該方法包括:
[0022](a)使包括細(xì)胞的受試者的生物樣品與至少一種藥劑接觸；
[0023](b)獨(dú)立地測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布:
[0024]( i )非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0025](ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；以及
[0026](iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0027]其中，時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示細(xì)胞的代謝活性，并且其中細(xì)胞的代謝活性朝向在相同條件下檢測(cè)的正常的健康的細(xì)胞樣品的代謝活性的轉(zhuǎn)變指示用于疾病的有效藥劑。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種在受試者中監(jiān)測(cè)疾病治療的方法，該方法包括:
[0029](a)對(duì)受試者施用至少一種針對(duì)所述疾病的藥劑；
[0030](b)在施用之后，取回包括受試者的細(xì)胞的生物樣品；
[0031](C)獨(dú)立地測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布:
[0032]( i )非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0033](ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；以及
[0034](iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0035]其中，時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示細(xì)胞的代謝活性，并且其中細(xì)胞的代謝活性朝向在相同條件下檢測(cè)的正常的健康的細(xì)胞樣品的代謝活性的轉(zhuǎn)變指示疾病的有效治療。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種在有此需要的受試者中的疾病治療的方法，該方法包括:
[0037](a)根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法診斷受試者中的疾病的存在；
[0038](b)根據(jù)診斷對(duì)受試者進(jìn)行治療。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了一種鑒定能夠改變細(xì)胞的代謝活性的試劑的方法，該方法包括:
[0040](a)使細(xì)胞經(jīng)受試劑；
[0041](b)根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在(a)之后并任選地在(a)之前測(cè)量細(xì)胞的代謝活性，其中酸化分布的轉(zhuǎn)變指示能夠改變細(xì)胞的代謝活性的試劑。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞外環(huán)境包括具有校準(zhǔn)的緩沖能力的限定的溶液。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，緩沖液包括磷酸鹽緩沖鹽水。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞包括白細(xì)胞。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞包括癌細(xì)胞。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案,疾病包括癌癥。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，生物樣品包括血液樣品。
[0049]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，疾病選自由以下組成的組:癌癥、病原感染和自身免疫疾病。
[0050]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，測(cè)量使用選自由以下組成的組的無毒膜不透性探針來實(shí)現(xiàn):pH探針、CO2探針和NH3探針以及乳酸鹽探針。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案,pH探針包括測(cè)比pH探針(ratiometric pH probe)。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，pH探針包括HPTS。
[0053]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，非揮發(fā)性代謝物包括乳酸鹽。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，揮發(fā)性代謝物包括NH3和CO2。
[0055]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，測(cè)量(i )的酸化分布在暴露于空氣的腔室中實(shí)現(xiàn)。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，測(cè)量(ii)的酸化分布在氣密性的腔室中實(shí)現(xiàn)。
[0057]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，測(cè)量酸化分布在恒溫下實(shí)現(xiàn)。
[0058]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，恒溫包括37 °C。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法還包括在測(cè)量酸化分布之前或者與之同時(shí)使細(xì)胞經(jīng)受刺激物或抑制物。
[0060]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，刺激物或抑制物包括細(xì)胞。
[0061 ] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，刺激物或抑制物包括無細(xì)胞抗原。
[0062]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，刺激性細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞且細(xì)胞包括關(guān)于淋巴細(xì)胞的非同系淋巴細(xì)胞。
[0063]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，測(cè)量酸化分布在商業(yè)熒光多孔板掃描儀中實(shí)現(xiàn)。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，MA測(cè)試背景測(cè)量值的信噪過濾通過k_均值聚類分析來進(jìn)行。
[0065]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，對(duì)代謝活性的診斷決策進(jìn)行至少兩個(gè)決策樹模型(decision tree model)。
[0066]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，決策樹模型選自以下的組:C5、C&R Tree和CHAID。
[0067]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法還包括將細(xì)胞與細(xì)胞外環(huán)境分離。
[0068]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，在離心作用下通過ficoll分離完成分離。
[0069]除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的普通人員所通常理解的相同的含義。雖然與本文描述的內(nèi)容類似或等同的方法和材料可以被用于本發(fā)明的實(shí)施方案的實(shí)施或測(cè)試中，但是下文描述了示例性的方法和/或材料。在有沖突的情況下，以包括定義在內(nèi)的專利說明書為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)例僅是說明性的而非旨在必然進(jìn)行限制。
[0070]附圖簡(jiǎn)要說明
[0071]在此僅以實(shí)例的方式參照附圖描述本發(fā)明的一些實(shí)施方案?，F(xiàn)在具體詳細(xì)參照附圖，要強(qiáng)調(diào)的是所示的具體內(nèi)容是通過實(shí)例的方式且目的用于本發(fā)明的實(shí)施方案的示例性討論。在這方面，結(jié)合附圖的說明使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員明了可以如何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案。
[0072]在附圖中:
[0073]圖1是氧化磷酸化、無氧糖酵解和有氧糖酵解(又稱作“瓦博格效應(yīng)”)之間的差異的示意圖。
[0074]圖2是示出了 8-羥基芘-1,3，6-三磺酸(HPTS)的pH相關(guān)的吸收光譜的圖。
[0075]圖3A-D是示出了在2mM和IOmM磷酸鹽緩沖鹽水和在I μ M HPTS下的工作溶液的PH和酸度校準(zhǔn)的圖。打開:在37°C不密封下監(jiān)測(cè)酸化步驟。關(guān)閉:在37°C下在多孔板被密封之后監(jiān)測(cè)酸化步驟。
[0076]X軸:比率:(在Ex.403nm處的熒光強(qiáng)度)/ (在Ex.455nm處的熒光強(qiáng)度)。
[0077]右側(cè)Y軸(三角形):如通過連續(xù)添加IN HCl獲得的HCl的累積量(μ mol/ml)。
[0078]左側(cè)Y軸(圓形):如通過pH玻璃電極測(cè)得的合適的pH值。圖3A-B——具有2mM磷酸鹽緩沖鹽水的工作溶液。圖3C-D——具有IOmM磷酸鹽緩沖鹽水的工作溶液。
[0079]圖4A-B是示出了在IOmM磷酸鹽緩沖鹽水下，在I μ M和10 μ M的HPTS濃度下的校準(zhǔn)曲線的圖。
[0080]X軸:比率:(在Ex.403nm處的熒光強(qiáng)度)/ (在Ex.455nm處的熒光強(qiáng)度)。
[0081]右側(cè)Y軸(三角形):如通過連續(xù)添加IN HCl獲得的HCl的累積量(μ mol/ml)。
[0082]左側(cè)Y軸(圓形):如通過pH玻璃電極測(cè)得的合適的pH值。(圖4A)HPTS的最終濃度為I μ M。(圖4Β) HPTS的最終濃度為10 μ Μ。
[0083]圖5A-D示出了 HPTS參考速率值的k_均值聚類分析。圖5A_C——x軸指從“打開”獲取的探針的標(biāo)準(zhǔn)值，以及I軸指從“關(guān)閉”測(cè)量獲取的探針的標(biāo)準(zhǔn)值。圖5A——在聚類分析之前，來自所有測(cè)試供體(N=730個(gè)觀察值)的所有值的檢測(cè)。圖5B——探針數(shù)據(jù)的k-均值聚類分析指示在用不同的顏色表示的26個(gè)聚類上。五個(gè)聚類被發(fā)現(xiàn)較小(觀察值< 6)，并因此被丟棄(異常值)。圖5C-D——來自730個(gè)觀察值的34個(gè)觀察值(4.66%)被排除(紅色)。剩余的696個(gè)觀察值(95.34%)(藍(lán)色)展示于圖5B中的21個(gè)單獨(dú)的聚類中。然后，對(duì)于每個(gè)供體重新計(jì)算“打開”狀態(tài)的平均值和“關(guān)閉”狀態(tài)的平均值。
[0084]圖6A-C是對(duì)于遞增葡萄糖濃度，對(duì)典型的健康供體和癌癥供體獲得的MA分布，X軸:葡萄糖濃度(mM)，y軸:圖6B-C的y軸是單位為皮摩爾H+/μ I/小時(shí)/2500PBMC的hPBMC的代謝活性速率，以及圖6C的j軸是單位為皮摩爾H+/ μ I/小時(shí)的hPBMC的代謝活性速率。在37°C溫育I小時(shí)期間測(cè)量酸化動(dòng)力學(xué)。在30分鐘期間的多孔板的“打開”狀態(tài)循環(huán)。在這種狀態(tài)下存在CO2和NH3的氣體通風(fēng)，從而使得只有乳酸生產(chǎn)(包括其他非揮發(fā)性有機(jī)酸)有助于每個(gè)孔內(nèi)的等價(jià)酸性累積。在30分鐘期間的相同多孔板的“關(guān)閉”狀態(tài)循環(huán)。在這種氣密地封閉狀態(tài)下，CO2和NH3在平衡時(shí)與水反應(yīng)形成碳酸和銨離子。酸度水平由乳酸和碳酸陰離子在PH為7.3左右產(chǎn)生。此處評(píng)估NH4+堿性陽離子以滴定酸度水平?！瓣P(guān)閉“打開”=C02+ (-NH3))。(圖6A)MA測(cè)試的對(duì)照記錄包括探針HPTS和葡萄糖，但不帶有細(xì)胞。(圖6B)代表典型的健康供體的45歲女性的MA分布(類似于針對(duì)不同年齡和性別所獲得的分布)。(圖6C)患有2期乳腺idc癌的37歲女性和治療之前的MA分布。注意至IJ，在健康樣品和患病樣品之間的所誘導(dǎo)的MA變化可能已經(jīng)在基礎(chǔ)狀態(tài)(沒有刺激物的對(duì)照樣品)下被檢測(cè)到。
[0085]圖7A-D是示出了對(duì)于遞增葡萄糖，患有乳腺癌的65歲女性與69歲的健康男性相比所獲得的MA分布的隨訪病例研究的圖。黑色關(guān)閉”;紅色打開”;藍(lán)色-“C-0”= “關(guān)閉“打開”。圖7A——69歲的健康男性的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的MA分布。圖7B-D示出了患有乳腺idc癌的65歲女性的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的三個(gè)隨訪MA分布。X軸:葡萄糖濃度(mM)。Y軸:單位為皮摩爾/ μ I/小時(shí)/2500 PBMC的PBMC的代謝活性速率。(圖7Β)隨訪患者的第一 MA測(cè)試，通過測(cè)試結(jié)果已經(jīng)疑為患有癌癥(時(shí)間=0)。(圖7C)時(shí)間=+10.5個(gè)月一剛好在常規(guī)的乳房X線照相術(shù)由醫(yī)生診斷患有3期乳腺idc癌之后的第二MA測(cè)試。(圖7D)時(shí)間=+14.5個(gè)月——在外科手術(shù)切除左乳中2.2x2.4cm的腫瘤之后并在兩個(gè)月的三次化療治療之后進(jìn)行第六MA測(cè)試。
[0086]圖8A-D是示出了對(duì)于遞增PSA濃度，典型的健康供體、乳腺癌患者和乳腺癌恢復(fù)的供體所獲得的MA分布的圖。
[0087]圖8A——包括探針HPTS和PSA的MA測(cè)試的對(duì)照記錄，但不帶有細(xì)胞。(圖8B-D)三個(gè)不同供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的MA分布。X軸:PSA濃度(μ g/ml)。Y軸:圖9B-D的Y軸是單位為皮摩爾H+/ μ I/小時(shí)/2500 PBMC的PBMC的代謝活性速率以及圖8Α的Y軸是單位為皮摩爾H+/μ I/小時(shí)的PBMC的代謝活性速率。在37°C溫育I小時(shí)期間測(cè)量酸化動(dòng)力學(xué)。黑色-“關(guān)閉”;紅色-“打開”;藍(lán)色-“C-0”= “關(guān)閉“打開”。(圖8A)表示典型的健康供體的59歲女性的MA分布。(圖8B)患有2期乳腺idc癌的37歲女性和任何治療之前的MA分布。(圖8C)在MA測(cè)試之前的18年從乳腺癌恢復(fù)的50歲女性的MA分布。
[0088]圖9A-D示出了用于MA測(cè)試結(jié)果的模型構(gòu)建和分類評(píng)估。
[0089]圖9A-B——年齡在40歲以上(n=42)的第一組供體。圖9C-D——年齡在22至81歲之間的第二組供體。圖9A、C——兩個(gè)表呈現(xiàn)了具有最佳分類的最佳切割點(diǎn)的最佳模型?！癘”指的是“打開”狀態(tài)，“C”指的是“關(guān)閉”狀態(tài)以及“C-0”指的是“關(guān)閉-打開”狀態(tài)。TP指的是真陽性，F(xiàn)N指的是假陰性，TN指的是真陰性以及FP指的是假陽性。圖9B、D——通過累積增益圖表評(píng)估和比較模型性能的兩幅圖。y軸示出了通過患有癌癥的模型進(jìn)行分類的供體的百分比。這是全部供體(健康供體和癌癥患者)的百分比。X軸示出了分類為患有癌癥的患者的百分比，其是用于第一組的42個(gè)全部供體以及用于第二組的67個(gè)全部供體的比例。呈現(xiàn)的是能夠以高精確度對(duì)健康供體和癌癥患者進(jìn)行分類的四個(gè)最佳模型。第四個(gè)模型是來自回歸模型族的邏輯回歸模型。黑線指的是隨機(jī)響應(yīng)率(如果隨機(jī)分類X%供體，那么獲得X%癌癥患者)。天藍(lán)色線指的是理論最佳模型。紅線指的是CHAID模型，綠線指的是C5算法，黃線指的是C&R tree模型以及藍(lán)線指的是邏輯模型。
[0090]圖10A-D呈現(xiàn)了使用30%的供體的驗(yàn)證集的MA測(cè)試的評(píng)估模型結(jié)果。圖10A-B——年齡在40歲以上(n=42)的第一組供體。圖10C-D——年齡在22至81歲之間的第二組供體。(a，c)使用Clementine軟件V13.0將圖9中所述的數(shù)據(jù)劃分成“訓(xùn)練”和“測(cè)試”兩組。圖1OA—包括用于第一組的70%的供體的驗(yàn)證集。圖1OC—包括用于第二組的70%的供體的驗(yàn)證集。圖10A、C——在隨機(jī)數(shù)據(jù)劃分之后通過累積增益圖表制成的評(píng)估和比較模型性能的兩幅圖。y軸示出了通過患有癌癥的模型進(jìn)行分類的供體的百分比。這是全部供體(健康供體和癌癥患者)的百分比。X軸示出了分類為患有癌癥的患者的百分t匕?！坝?xùn)練”組用于在70%的供體上構(gòu)建數(shù)據(jù)挖掘模型。剩余的30%供體在之后被用于使用在訓(xùn)練組中產(chǎn)生的模型(CHAID、Logistic、C5、C&R tree)評(píng)估在“測(cè)試”組上的分類結(jié)果。如圖9中所描述的，天藍(lán)色線指的是理論最佳模型，紅線指的是CHAID模型，綠線指的是C5算法，黃線指的是C&R tree模型，藍(lán)線指的是邏輯模型以及黑線指的是隨機(jī)模型。圖10B、D——兩個(gè)表呈現(xiàn)了在隨機(jī)數(shù)據(jù)劃分之后的具有最佳分類的最佳切割點(diǎn)的最佳模型?！癘”指的是“打開”狀態(tài)，“C”指的是“關(guān)閉”狀態(tài)以及“c-ο”指的是“關(guān)閉-打開”狀態(tài)。TP指的是真陽性，F(xiàn)N指的是假陰性，TN指的是真陰性以及FP指的是假陽性。在“測(cè)試”組中，兩組供體C5的性能最佳，而在“訓(xùn)練”組中，C&R tree的性能最佳。
[0091]圖11描述了工作假設(shè):類似腫瘤發(fā)展的鏡像的hPBMC的代謝活性分布。癌癥發(fā)展被認(rèn)為與可能反映在hPBMC的不同的代謝活性(MA)分布中的免疫系統(tǒng)的生理功能的變化相關(guān)。Y軸呈現(xiàn)代謝途徑的兩個(gè)臂，即氧化磷酸化對(duì)有氧糖酵解。X軸呈現(xiàn)腫瘤發(fā)展從健康到轉(zhuǎn)移癌癥的階段。靜止細(xì)胞(Q)具有氧化磷酸化的主要基本速率。在腫瘤發(fā)展的初始階段下，存在Q的相關(guān)組織特異性子群(Qi) “克隆擴(kuò)增”成抗腫瘤效應(yīng)子殺傷細(xì)胞(Eki)，其在后續(xù)階段可能轉(zhuǎn)變成促腫瘤效應(yīng)子喂養(yǎng)細(xì)胞(Efi)。伴隨地，免疫耐受和無反應(yīng)性屈服于轉(zhuǎn)移階段，其中組織特異性效應(yīng)子子群可以被耗竭，包括其各自的靜止子群(Qi )。本結(jié)果揭示了從健康供體的hPBMC優(yōu)先的主要氧化磷酸化到在局部腫瘤發(fā)展階段(1-3期)的各個(gè)癌癥患者的hPBMC優(yōu)先的主要有氧糖酵解(“瓦博格效應(yīng)”)的代謝轉(zhuǎn)變。朝向有氧糖酵解的轉(zhuǎn)變可能與主要的Efi子群相關(guān)以及也可能與Eki子群相關(guān)。癌癥的組織特異性早期檢測(cè)(O期)的能力將通過隨訪的方案進(jìn)行檢驗(yàn)。預(yù)期將揭示與健康供體所獲得的代謝活化進(jìn)行比較，在組織特異性抗原的刺激下增強(qiáng)的/降低的代謝活化。在早期的轉(zhuǎn)移癌癥(4期)中，朝向主要氧化磷酸化的逐漸向后轉(zhuǎn)變是所期望的，產(chǎn)生用于適當(dāng)治療的診斷工具。特征性的代謝活性分布的以上示意性描述由條紋的橙色線呈現(xiàn)，其與MA測(cè)試的差異“關(guān)閉-打開”結(jié)果相關(guān)，這表明hPBMC的瓦博格效應(yīng)轉(zhuǎn)變。
[0092]圖12是MA測(cè)試方案和分析框架的流程圖。MA測(cè)試框架的順序階段A-E符合以下的實(shí)施例部分的實(shí)施例1中所詳細(xì)描述的。
[0093]圖13A-1是對(duì)于遞增葡萄糖濃度，對(duì)典型的健康、癌癥和自身免疫性狼瘡供體所獲得的MA分布。X軸:葡萄糖濃度(禮)。Y軸:單位為皮摩爾H+/ul/小時(shí)/2500細(xì)胞的PBMC的代謝活性速率。在37°C溫育I小時(shí)期間測(cè)量酸化動(dòng)力學(xué)。
[0094]圖13A、D、G——“關(guān)閉”；圖 13B、E、H——“打開”；圖 13C、F、I——“C-0”= “關(guān)閉打開”。圖13A-C—典型的健康供體的代表性MA分布。圖13D-F——典型的癌癥患者的代表性MA分布。圖13G-1——患有系統(tǒng)性狼瘡(自身免疫疾病)的患者的MA分布。
[0095]發(fā)明的具體實(shí)施方案的說明
[0096]本發(fā)明在其一些實(shí)施方案中涉及監(jiān)測(cè)和分析代謝活性分布的方法及其診斷或治療用途，或具體地涉及通過血液樣品的代謝活性監(jiān)測(cè)作出癌癥診斷。
[0097]在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)該理解的是本發(fā)明在其應(yīng)用中并不必需限于以下說明中闡述的細(xì)節(jié)或?qū)嵤├纠募?xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其它實(shí)施方案或能夠以各種方式實(shí)施或進(jìn)行。[0098]如今，迫切需要高通量方法用于各種疾病的早期檢測(cè)和分期。例如，癌癥被發(fā)現(xiàn)和治療的越快，存活機(jī)會(huì)就越好。此外，鑒定疾病的階段確保適當(dāng)?shù)闹委煛?br> [0099]本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，與分析與疾病相關(guān)的各種原位參數(shù)或相關(guān)的循環(huán)標(biāo)志物允許在相對(duì)晚期階段的疾病檢測(cè)的用于疾病檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法不同，免疫系統(tǒng)可能在疾病發(fā)作時(shí)已經(jīng)反映疾病狀態(tài)。由于免疫系統(tǒng)天然負(fù)責(zé)對(duì)抗已經(jīng)在早期階段的疾病發(fā)展，鑒定相關(guān)的免疫反應(yīng)的特性分布將會(huì)是有益的。免疫系統(tǒng)的代謝活性的這種分布連同疾病發(fā)展的變化可能也對(duì)疾病分期有用。例如，在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中，免疫系統(tǒng)活性應(yīng)該得到很好控制；活動(dòng)過度與自身免疫疾病相關(guān)，而癌癥發(fā)展可能與免疫系統(tǒng)的活動(dòng)過少相關(guān)。這些相反的路徑可以由響應(yīng)于各種營(yíng)養(yǎng)物和刺激物的一般的和更專門的MA分布來指示。
[0100]因此，本發(fā)明人設(shè)計(jì)了一種用于定量測(cè)量相關(guān)細(xì)胞群的代謝活性的獨(dú)創(chuàng)的、面向臨床的方法，作為疾病的指示劑。通過使用PH敏感的不透性熒光探針監(jiān)測(cè)細(xì)胞外酸化，該試驗(yàn)測(cè)量微升細(xì)胞樣品的代謝活性的速率。
[0101]正如以下實(shí)施例部分所闡明的，使用代謝活性(MA)分析，本發(fā)明人揭示了在從癌癥患者和健康供體獲得的PBMC上監(jiān)測(cè)到的不同的代謝途徑之間的顯著轉(zhuǎn)變?？梢圆捎迷撧D(zhuǎn)變作為診斷工具，用于通過監(jiān)測(cè)PBMC的代謝活性的特征性變化來明確區(qū)分健康和癌癥患者(圖6-10、13)。這些顯著的初步發(fā)現(xiàn)是通過比較“打開”對(duì)“關(guān)閉”(氣密性的)孔中的MA測(cè)試結(jié)果而獲得的。兩種記錄使得能夠測(cè)量可溶性對(duì)揮發(fā)性代謝產(chǎn)物(乳酸對(duì)于CO2和NH3)的累積，從而區(qū)別開三種代謝途徑一氧化磷酸化、無氧糖酵解以及有氧糖酵解，如以下所解釋的。
[0102]非活化T細(xì)胞(原初T細(xì)胞)，像大多數(shù)正常分化細(xì)胞一樣，主要依賴于線粒體氧化磷酸化來有效地產(chǎn)生用于細(xì)胞過程所需的能量的ATP，以及揮發(fā)性的CO2產(chǎn)物。在氧氣不存在時(shí)，它們必須依賴于ATP生產(chǎn)的更加低效的代謝途徑，其與稱為無氧糖酵解的乳酸生產(chǎn)相關(guān)。相反，大部分癌癥細(xì)胞18被發(fā)現(xiàn)依賴于有氧糖酵解，這類似于無氧糖酵解，盡管氧氣存在。Otto Warburg最初發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象與癌細(xì)胞相關(guān)，并稱為“瓦博格效應(yīng)”。本發(fā)明人揭示“瓦博格效應(yīng)”在癌癥患者的新鮮PBMC中的存在。不限于理論，“瓦博格效應(yīng)”的免疫代謝合理性，即癌癥患者的新鮮PBMC中的原初淋巴細(xì)胞和活化淋巴細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)變，可能與腫瘤細(xì)胞附近的活化T細(xì)胞的積極而有效的生理機(jī)能的需要相關(guān)，其中在血管生成之前的早期階段可能缺氧。這種想法與以下事實(shí)一致:腫瘤細(xì)胞通過“瓦博格效應(yīng)”最初適于缺氧。
[0103]按照上述代謝途徑，終產(chǎn)物即CO2和乳酸直接導(dǎo)致MA測(cè)試檢查到的酸化。
[0104]此外，被認(rèn)為在MA測(cè)試中扮演重要角色的另一種終產(chǎn)物是氨(NH3)。細(xì)胞能量的主要來源之一是蛋白質(zhì)分解代謝，其是將蛋白質(zhì)分解為氨基酸的過程。氨基被從氨基酸上去除并被轉(zhuǎn)化為氨。細(xì)胞的NH3生產(chǎn)的另一來源是通過構(gòu)成兩組含氮堿基的嘌呤和嘧啶的代謝途徑。在本測(cè)量系統(tǒng)中，如在體內(nèi)，活細(xì)胞必須通過代謝酸性和堿性產(chǎn)物如乳酸、碳酸和銨堿的分泌將細(xì)胞質(zhì)保持在約為7.2-7.4的恒定pH。
[0105]這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)確保，通過與免疫系統(tǒng)進(jìn)行通信，面向生理的MA分析對(duì)于開發(fā)新的途徑來檢測(cè)、診斷和治療癌癥以及其他疾病可以具有重要的意義。
[0106]因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了一種測(cè)量細(xì)胞的代謝活性(MA)的方法。該方法包括獨(dú)立地(即，單獨(dú)地)測(cè)量細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布:[0107](i)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0108](ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0109](iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；
[0110]其中，時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示細(xì)胞的代謝活性途徑。
[0111]如本文所使用的“代謝活性途徑”是指線粒體氧化磷酸化、無氧糖酵解、有氧糖酵解以及NH3+生產(chǎn)對(duì)能量生產(chǎn)的相對(duì)貢獻(xiàn)。
[0112]該分布可以具有尖峰構(gòu)形或單調(diào)的飽和性態(tài)。
[0113]尖峰分布通常反映代謝活性的受體介導(dǎo)的刺激，其被預(yù)期與濃度相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)反應(yīng)相比更具體。后一反應(yīng)通常是單調(diào)的飽和分布。
[0114]如本文所使用的“細(xì)胞”是指可以測(cè)量上述代謝活性的原核或真核細(xì)胞。細(xì)胞可以是細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)具體的實(shí)施方案，細(xì)胞是人類細(xì)胞。將意識(shí)到的是，細(xì)胞可以指單個(gè)細(xì)胞，但也可以指多個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞可以是分離的細(xì)胞(沒有組織結(jié)構(gòu))或在組織或組織碎片中的細(xì)胞。根據(jù)具體的實(shí)施方案，當(dāng)細(xì)胞是PBMC時(shí)，對(duì)IO3-1Oki個(gè)細(xì)胞完成試驗(yàn)。根據(jù)具體的實(shí)施方案，細(xì)胞的數(shù)量是106_107。
[0115]細(xì)胞可以是分化細(xì)胞、未分化細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)或去分化細(xì)胞。
[0116]根據(jù)具體的實(shí)施方案，細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，即是白血細(xì)胞(B卩，白血球)。實(shí)例包括嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞或B細(xì)胞)、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。
[0117]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)胞是任何組織的病原或病變細(xì)胞如癌細(xì)胞。下面提供了根據(jù)本教導(dǎo)可被檢測(cè)到的其他疾病和醫(yī)學(xué)病癥。
[0118]可以根據(jù)本教導(dǎo)進(jìn)行分析的其他細(xì)胞包括但不限于胚胎細(xì)胞(如用于IVF鑒定)、紅血細(xì)胞、血小板、受細(xì)菌感染的細(xì)胞、受真菌感染的細(xì)胞以及受病毒感染的細(xì)胞。
[0119]因此，細(xì)胞可以指分離的細(xì)胞群，該分離的細(xì)胞群包括高度純化的特定細(xì)胞亞群，即，同質(zhì)的細(xì)胞群(例如，>80%純度)，例如，T細(xì)胞，或非同質(zhì)細(xì)胞群，該非同質(zhì)細(xì)胞群包括各種類型的免疫細(xì)胞，如外周血白細(xì)胞(PBL)或單核細(xì)胞。
[0120]細(xì)胞可以是未培養(yǎng)的、培養(yǎng)的原代細(xì)胞或克隆細(xì)胞(例如，細(xì)胞系)。
[0121]細(xì)胞可以是貼壁細(xì)胞或懸浮的細(xì)胞。
[0122]根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，細(xì)胞可以是未遺傳修飾的或遺傳修飾的。
[0123]如本文所使用的“獨(dú)立測(cè)量”是指條目(i )、(ii)以及可能(iii)的單獨(dú)的測(cè)量。盡管將意識(shí)到的是，根據(jù)具體的實(shí)施方案，(iii)是從(ii)減去(i )的結(jié)果。這些單獨(dú)的測(cè)量可以在相同的但單獨(dú)的細(xì)胞樣品上并行地、同時(shí)執(zhí)行，或依次地在單個(gè)細(xì)胞樣品上執(zhí)行(如下面的實(shí)施例部分中所描述的)。
[0124]因此，通過校準(zhǔn)的酸化曲線(表I)執(zhí)行測(cè)量細(xì)胞外酸化分布。
[0125]通過計(jì)算“打開”和“關(guān)閉”狀態(tài)下在細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境(例如，pmol/ul/小時(shí)/2500細(xì)胞)中的與熒光測(cè)量的pH變化相關(guān)的累積酸化來執(zhí)行代謝活性的測(cè)量。將意識(shí)到的是，根據(jù)具體的實(shí)施方案，只在細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境而不是細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行該測(cè)量。細(xì)胞外PH測(cè)量是有利的，因?yàn)樵诩?xì)胞外環(huán)境中存在持久性的酸性累積，而由于體內(nèi)平衡的生理調(diào)節(jié)瞬態(tài)的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)中存在相對(duì)小的平均變化；細(xì)胞外探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)過程沒有生理干擾；存在細(xì)胞外的測(cè)比熒光探針的比較高的信噪比；相對(duì)于細(xì)胞操作，熒光介質(zhì)(校準(zhǔn)的緩沖能力)制備的簡(jiǎn)單；與細(xì)胞內(nèi)探針的嚴(yán)重泄漏相比，不存在背景熒光；不需要滲透化過程進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，從而允許活細(xì)胞的實(shí)時(shí)分析；存在與猝滅和氧化作用相關(guān)的問題最少；并且，最后實(shí)現(xiàn)同時(shí)高通量動(dòng)力學(xué)測(cè)量，而沒有上述問題。
[0126]如本文所使用的細(xì)胞的“細(xì)胞外環(huán)境”是指自然環(huán)境，例如，血液或血漿，或者人工
環(huán)境如培養(yǎng)基。
[0127]根據(jù)具體的實(shí)施方案，MA測(cè)試在具有校準(zhǔn)的緩沖能力的限定的溶液(所有組分是已知的)中實(shí)現(xiàn)。
[0128]將意識(shí)到的是，緩沖能力應(yīng)該確保生理pH的較小變化。
[0129]根據(jù)具體的實(shí)施方案，緩沖液為磷酸鹽緩沖液(例如，磷酸鹽緩沖鹽水1-1OmM或IOmM磷酸鹽緩沖液)。將意識(shí)到的是，在低細(xì)胞濃度下的酸化測(cè)量要求低緩沖液濃度。根據(jù)具體的實(shí)施方案，對(duì)2.5xl06細(xì)胞/ml使用IOmM磷酸鹽緩沖鹽水。
[0130]因此，在培養(yǎng)期間通過HPTS熒光校準(zhǔn)的緩沖能力的較小酸化方法監(jiān)測(cè)代謝活性的動(dòng)力學(xué)。
[0131]圖3A-D和4A-D分別描述了工作溶液校準(zhǔn)和探針校準(zhǔn)。
[0132]根據(jù)具體的實(shí)施方案，在恒定溫度例如20_40°C下或具體地在最佳生長(zhǎng)溫度下如對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞為37°C，執(zhí)行測(cè)量酸化分布。
[0133]如本文以上所述，細(xì)胞外酸化分布指示細(xì)胞分泌的各種代謝產(chǎn)物的身份。
[0134]如圖1所示，腫瘤或增生性組織(例如，活化T細(xì)胞)優(yōu)先地使用有氧糖酵解，其特征主要是乳酸鹽分泌到介質(zhì)中。相反，分別取決于氧氣的可獲得性，分化組織將采用氧化磷酸化或無氧糖酵解，并因此將分泌CO2或乳酸鹽。
[0135]根據(jù)具體的實(shí)施方案，時(shí)間相關(guān)的酸化分布由于非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物主要為乳酸鹽的分泌而在暴露于空氣的腔室中執(zhí)行。在這種狀態(tài)(“打開”)下，存在CO2和NH3的氣體通風(fēng)，使得只有乳酸生產(chǎn)(包括其他非揮發(fā)性有機(jī)酸)有助于每個(gè)孔內(nèi)的等效酸性累積。
[0136]根據(jù)具體的實(shí)施方案，時(shí)間相關(guān)的酸化分布由于非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物的分泌而在氣密性腔室中實(shí)現(xiàn)。在氣密地封閉狀態(tài)(“關(guān)閉”)下，CO2和NH3在平衡時(shí)與水反應(yīng)形成碳酸和堿性銨離子。然而，在這種狀態(tài)下，NH4+堿性陽離子將乳酸和碳酸陰離子產(chǎn)生的酸度水平滴定為PH7左右。
[0137]根據(jù)具體的實(shí)施方案，在多孔板的空氣“打開”和“關(guān)閉”狀態(tài)的30分鐘順序內(nèi)測(cè)
量酸化動(dòng)力學(xué)。
[0138]通過酸化(+ )和堿性滴定(_)的適當(dāng)速率(V)，在打開狀態(tài)(Vopen)和關(guān)閉狀態(tài)(Vclosed)下的酸化的總測(cè)量速率由耦合方程來描述:
[0139]Vopen=V (乳酸)。
[0140]Vclose=V (乳酸)+V (碳酸)-V (銨堿)。
[0141]使用這種配置，時(shí)間相關(guān)的酸化分布由于揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物的分泌而通過
(ii)- (i)的分布的減法來計(jì)算。
[0142]使用無毒膜不透性探針執(zhí)行測(cè)量細(xì)胞外酸化的動(dòng)力學(xué)。實(shí)例包括但不限于測(cè)比pH探針、CO2探針、NH3探針、乳酸鹽探針以及它們的組合。根據(jù)具體的實(shí)施方案，在pH緩沖條件下，高靈敏度要求測(cè)比技術(shù)。
[0143]根據(jù)本教導(dǎo)可以使用的具體探針的實(shí)例包括但不限于HPTS、CFDA和羧基熒光素。這些探針是商業(yè)上可獲得的，如購自Molecular Probes。
[0144]根據(jù)具體的實(shí)施方案，使用測(cè)比pH探針8-羥基芘-1，3，6-三磺酸(HPTS)實(shí)現(xiàn)測(cè)
量酸化。
[0145]HPTS是在含水緩沖液中pKa為?7.3的低成本、無毒性、高水溶性不可透膜的pH指示劑。HPTS表現(xiàn)出pH相關(guān)的吸收轉(zhuǎn)變，允許測(cè)比pH測(cè)量作為在455nm和403nm處的激發(fā)下隨后測(cè)量的513nm處的熒光強(qiáng)度之間的比率的函數(shù)。該方法是pH為7左右的生理范圍內(nèi)的較小PH變化的本靈敏測(cè)量的關(guān)鍵。
[0146]根據(jù)具體的實(shí)施方案，熒光探針被附接到納米顆粒如納米傳感器，以便擴(kuò)大各種代謝產(chǎn)物的比例度量的特定光學(xué)監(jiān)測(cè):C02、NH3、乳酸等。細(xì)胞內(nèi)的熒光測(cè)量在刺激的生理機(jī)制的基礎(chǔ)研究中非常有用，例如，對(duì)于鈣動(dòng)員和膜去極化。然而，在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞反應(yīng)下，這些細(xì)胞內(nèi)的刺激信號(hào)變得短暫。因此，它們被認(rèn)為與記錄在MA測(cè)試中的持續(xù)累積的細(xì)胞外酸化相比，較不適合PBL刺激的靈敏監(jiān)測(cè)。這種細(xì)胞外監(jiān)測(cè)可以通過將測(cè)比分子光學(xué)探針附接到納米顆粒來更好地幫助。細(xì)胞外監(jiān)測(cè)是生物相容的，將細(xì)胞內(nèi)的探針測(cè)量共有的負(fù)面影響最小化，指向細(xì)胞外的方法的優(yōu)點(diǎn)不僅用于基礎(chǔ)研究，而且用于不同的細(xì)胞類型中的各種臨床應(yīng)用。
[0147]酸化分布由H2O-H+等價(jià)物的分泌速率來呈現(xiàn)，單位為皮摩爾/ μ I/小時(shí)/2500細(xì)胞(參見圖6-8、13)。
[0148]以上酸化分布中的任一個(gè)可被用作細(xì)胞的代謝活性的指示劑?？商鎿Q地，所測(cè)量的分布中只有一個(gè)指示細(xì)胞的代謝活性。
[0149]如所提到的，可以在暴露于不同濃度的刺激物或抑制物的原初細(xì)胞或活化/效應(yīng)子細(xì)胞中測(cè)量細(xì)胞的代謝活性。
[0150]如本文所使用的“刺激物”或“抑制物”是指增加、降低或改變響應(yīng)于其的細(xì)胞的代謝途徑的實(shí)體。
[0151]例如，如果細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，那么刺激物是被TCR或BCR識(shí)別并導(dǎo)致克隆擴(kuò)增或抗體產(chǎn)生的抗原。具體的刺激物或抑制物列于下表I中。
[0152]表I
[0153]
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)量細(xì)胞的代謝活性(MA)的方法，所述方法包括獨(dú)立地測(cè)量所述細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布: (i)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物； (ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；以及 (iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物； 其中，所述時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示所述細(xì)胞的代謝活性。
2.一種在有此需要的受試者中診斷與改變的代謝活性相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括: (a)提供包括細(xì)胞的所述受試者的生物樣品； (b)獨(dú)立地測(cè)量所述細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布: (i)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物； (ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；以及 (iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物； 其中，所述時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示所述細(xì)胞的代謝活性，并且其中與在相同條件下檢測(cè)的正常的未受影響的細(xì)胞樣品的代謝活性相比，所述代謝活性的轉(zhuǎn)變指示與改變的代謝活性相關(guān)的疾病。`
3.一種優(yōu)化疾病治療的方法，所述方法包括: (a)使包括細(xì)胞的受試者的生物樣品與至少一種藥劑接觸； (b)獨(dú)立地測(cè)量所述細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布: (i)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物； (ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；以及 (iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物； 其中，所述時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示所述細(xì)胞的代謝活性，并且其中所述細(xì)胞的所述代謝活性朝向在相同條件下檢測(cè)的正常的健康的細(xì)胞樣品的代謝活性的轉(zhuǎn)變指示用于所述疾病的有效藥劑。
4.一種在受試者中監(jiān)測(cè)疾病治療的方法，所述方法包括: Ca)對(duì)所述受試者施用至少一種針對(duì)所述疾病的藥劑； (b)在所述施用之后，取回包括所述受試者的細(xì)胞的生物樣品； (C)獨(dú)立地測(cè)量所述細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中由以下的分泌導(dǎo)致的時(shí)間相關(guān)的酸化分布: (i)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物； (ii)非揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物；以及 (iii)揮發(fā)性可溶代謝產(chǎn)物； 其中，所述時(shí)間相關(guān)的酸化分布中的至少一個(gè)指示所述細(xì)胞的代謝活性，并且其中所述細(xì)胞的所述代謝活性朝向在相同條件下檢測(cè)的正常的健康的細(xì)胞樣品的代謝活性的轉(zhuǎn)變指示所述疾病的有效治療。
5.一種在有此需要的受試者中的疾病治療的方法，所述方法包括: Ca)根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法診斷所述受試者中的所述疾病的存在； (b)根據(jù)所述診斷對(duì)所述受試者進(jìn)行治療。
6.一種鑒定能夠改變細(xì)胞的代謝活性的試劑的方法，所述方法包括:(a)使細(xì)胞經(jīng)受試劑； (b)根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法在(a)之后并任選地在(a)之前測(cè)量所述細(xì)胞的代謝活性，其中所述酸化分布的轉(zhuǎn)變指示能夠改變細(xì)胞的代謝活性的試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述測(cè)量(i)的酸化分布在暴露于空氣的腔室中實(shí)現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述測(cè)量(ii)的酸化分布在氣密性的腔室中實(shí)現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述細(xì)胞外環(huán)境包括具有校準(zhǔn)的緩沖能力的限定的溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述緩沖液包括磷酸鹽緩沖鹽水。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述細(xì)胞包括白細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述細(xì)胞包括癌細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求2-5所述的方法，其中，所述疾病包括癌癥。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述生物樣品包括血液樣品。
15.根據(jù)權(quán)利要求2-5所述的方法，其中，所述疾病選自由以下組成的組:癌癥、病原感染和自身免疫疾病。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述測(cè)量使用選自由以下組成的組的無毒膜不透性探針來實(shí)現(xiàn):pH探針、CO2`探針和NH3探針以及乳酸鹽探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述pH探針包括測(cè)比pH探針。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述pH探針包括HPTS。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述非揮發(fā)性代謝物包括乳酸鹽。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述揮發(fā)性代謝物包括NH3和C02。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，其中，所述測(cè)量酸化分布在恒溫下實(shí)現(xiàn)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述恒溫包括37°C。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的方法，還包括在測(cè)量所述酸化分布之前或者同時(shí)使所述細(xì)胞經(jīng)受刺激物或抑制物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述刺激物或抑制物包括細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述刺激物或抑制物包括無細(xì)胞抗原。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述刺激性細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞且所述細(xì)胞包括關(guān)于所述淋巴細(xì)胞的非同系淋巴細(xì)胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-26所述的方法，其中，所述測(cè)量酸化分布在商業(yè)熒光多孔板掃描儀中實(shí)現(xiàn)。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-27所述的方法，其中，對(duì)所述代謝活性的代謝活性測(cè)量值進(jìn)行至少兩個(gè)決策樹模型。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-27所述的方法，其中，所述代謝活性的代謝活性測(cè)量值、MA測(cè)試背景測(cè)量值的信噪過濾通過k-均值聚類分析來進(jìn)行。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，所述決策樹模型選自以下的組:C5、C&RTree和 CHAID。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-27所述的方法，還包括將所述細(xì)胞與所述細(xì)胞外環(huán)境分離。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方`法，其中，所述分離是在離心作用下通過ficoll分離。
【文檔編號(hào)】G01N33/50GK103518133SQ201280022396
【公開日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月6日
【發(fā)明者】魯文·蒂洛希, 費(fèi)爾南多·帕托爾斯基, 哈吉特·佩雷茨-索羅卡 申請(qǐng)人:雷蒙特亞特特拉維夫大學(xué)有限公司