專利名稱：用于嚴重急性呼吸綜合征診斷的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)相關(guān)的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)同種型(isoform)的鑒定，以及它們在SARS的篩選、診斷、預(yù)后、治療和藥物開發(fā)方面的用途。
背景技術(shù)：
SARS是2002年底爆發(fā)的人類傳染性疾病，又稱非典型肺炎，經(jīng)確認由一種新型的冠狀病毒SARS-CoV引起，其傳播迅速、感染性強、難以預(yù)料的臨床進展和高死亡率對全球公共衛(wèi)生造成嚴重威脅。所以及時的診斷、有效的治療該疾病對于減小其危害具有重要意義。
無論從臨床表現(xiàn)還是常規(guī)的檢驗項目都很難將早期SARS與一般肺炎區(qū)分開，所以嘗試新的檢測方法來解決。蛋白質(zhì)組作為新興的研究技術(shù)，針對直接執(zhí)行生理功能的蛋白質(zhì)進行系統(tǒng)分析，極大地促進了疾病相關(guān)研究。已有報道，Kang X.等人利用SELDI-TOF對健康、感冒、肺炎、早期SARS病人血清進行檢測分析，找到SARS特異的蛋白質(zhì)指紋數(shù)據(jù)。Chen J.等人利用雙向電泳對健康與早期SARS血清進行比較，結(jié)合臨床常規(guī)檢測指標，以期對SARS進行早期鑒別。這些報道都說明，早期SARS病人的血清蛋白質(zhì)水平確實發(fā)生了特異的變化，所以可以追蹤在進展期與恢復(fù)期SARS病人血清蛋白質(zhì)水平變化，了解疾病進程。臨床上SARS的診斷和預(yù)后主要依據(jù)于醫(yī)生經(jīng)驗對病人的臨床表現(xiàn)進行評估，但SARS的進展常常難以預(yù)料，所以結(jié)合檢驗手段來診斷以及評估預(yù)后是必要的。這些說明在SARS的診斷中需要鑒定血清標志物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了用于SARS的篩選、診斷、預(yù)后、以及用于監(jiān)測SARS治療有效性和用于藥物開發(fā)的方法和組合物。
發(fā)明的第一方面提供了用于SARS診斷的方法，包括通過雙向電泳(two-dimentional electrophoresis，2DE)對血漿或血清樣品進行分析，以檢測至少一種SARS診斷特征(SF)的水平，例如選自此處公開的SF其中一種。這些方法也適用于篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測治療效果和藥物開發(fā)。
發(fā)明的第二方面是提供了用于SARS診斷的方法，包括檢測血漿或血清樣品中至少一種SARS診斷蛋白質(zhì)同種型(SPI)的水平，例如選自此處公開的SPI其中一種。這些方法也適用于篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測治療效果和藥物開發(fā)。
以下詳述的發(fā)明包括用于哺乳動物受試者中SARS篩選、診斷、預(yù)后的方法和組合物，以及用于監(jiān)測治療效果的方法，用于藥物開發(fā)的方法。優(yōu)選地，受試者是人類；更優(yōu)選地，受試者是成年人。
為了公開清楚而不以任何方式限制，本發(fā)明將以血漿樣品的分析為例進行描述。但是，作為本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，此處所述的鑒定和技術(shù)可以應(yīng)用于其他類型的病人樣品，包括體液(例如血漿、呼吸道灌洗液、痰、尿液)、懷疑含有來源于SARS病變組織的樣品(例如肺穿刺活檢組織樣品)1、SARS診斷特征(SF)本發(fā)明的一個方面中，雙向電泳用于分析受試者血漿以測量一個或多個SARS診斷特征(SF)的豐度，可用于SARS篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測SARS的治療效果、藥物的開發(fā)。此處雙向電泳指一項包括等電聚焦和隨后的變性電泳在內(nèi)的技術(shù)。它可以產(chǎn)生分離的多蛋白質(zhì)的雙向膠(2D-gel)。根據(jù)生物分子的電泳遷移率和等電點在雙向膠中分離得到一個圖譜。由此圖譜可以產(chǎn)生一個計算機形成的數(shù)字圖像，代表雙向電泳圖譜中檢測的多種生物分子的特性、表觀分子量、等電點和相對豐度，因而能夠允許將來對多個生物樣品的圖譜進行計算機輔助的比較，以及其后的膠上目標蛋白切割。
此處所用術(shù)語“SARS診斷特征(SF)”指生物樣品經(jīng)雙向電泳后可檢出的特征(例如雙向電泳中特定位置的一個點)，它以不同的方式表現(xiàn)在一個樣品與另外的相關(guān)樣品中。例如，當用于檢測特征的方法(雙向電泳或免疫分析)顯示第一個樣品中與第二個樣品中的特征豐度不同時，則此處所用的術(shù)語“特征”是相對于第二個樣品而言，不同的存在于第一個樣品中。
優(yōu)選地，特征在多個樣品中的相對豐度是通過兩個步驟來確定的。首先，參照一個適當?shù)谋尘皡?shù)將依賴于樣品中所發(fā)現(xiàn)特征而得到的信號進行標準化，例如，參照分析樣品中的總蛋白質(zhì)(例如上樣到膠條上的總蛋白質(zhì))。其次，一個或一組樣品中已標準化的信號與另一個或一組樣品的標準化信號比較。
通過優(yōu)選的方法，鑒定出相對于非SARS健康受試者血清，在患SARS受試者血清中明顯變化的SF。這些SF可以用表觀分子量(molecular weight，M.W.)和等電點(pI)表述如下表1SARS不同期的診斷特征SF

作為熟練的技術(shù)人員應(yīng)當容易理解，一個給定特征或蛋白質(zhì)同種型的測定分子量和等電點會根據(jù)具體實驗規(guī)程而在一定范圍內(nèi)變動。當按照參考規(guī)程，樣品以雙份平行或更多數(shù)目平行測定時，測得的SF平均等電點的偏差小于±1％，平均分子量偏差小于±5％。
SF可用于SARS的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或藥物開發(fā)。SF在SARS進展期與恢復(fù)期的變化是不同的，定量的檢測這些SF的水平相對正常的變化倍數(shù)，提示SARS的存在和臨床進程狀態(tài)，指導(dǎo)診斷治療。
2、SARS診斷蛋白質(zhì)同種型(SPI)本發(fā)明的另一方面是分析受試者血清，以定量檢測一個或多個SARS診斷蛋白的同種型(SPI)，這些SPI可用于SARS的篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測治療效果或藥物開發(fā)。此處所用術(shù)語“SARS診斷蛋白質(zhì)同種型”是指不同的存在于SARS患者血清與非SARS受試者血清中的蛋白質(zhì)同種型。本領(lǐng)域公知，單基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物可能表達成變構(gòu)體(同種型)(1)不同的翻譯后修飾的結(jié)果(如糖基化、磷酸化、乙?；?，以至于具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)可以有不同的等電點、分子量或兩者皆不同；(2)氨基酸組成不同(如另外的mRNA剪接)通過部分氨基酸測序，已鑒定相對于非SARS正常受試者血清，SARS患者血清發(fā)生明顯變化的SPI。這些SPI的分子量、等電點和部分氨基酸序列列于表，如下表2SARS診斷蛋白同種型SPI


本發(fā)明的SPI可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的任何方法加以分析。在實施方案中，SPI由于其分子量和等電點而在雙向膠中得到分離，通過對凝膠染色而顯現(xiàn)出來。
另外，SPI可以用分析方法測定，例如免疫分析方法，而用于SARS的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或藥物開發(fā)。在實施方案中，在能夠產(chǎn)生免疫特異結(jié)合的條件下，與來自要檢測的受試者的樣品與一種抗-SPI的抗體接觸，然后檢測或測量所有被抗體免疫特異性結(jié)和的量。優(yōu)選地，抗-SPI抗體優(yōu)先結(jié)合SPI，而不是同一蛋白質(zhì)的其他同種型。
可以使用的免疫分析方法包括但不限于競爭和非競爭系統(tǒng)，使用技術(shù)例如western印跡、放射免疫分析、ELISA、夾心式免疫分析、免疫沉淀、沉淀素反應(yīng)、凝集分析、熒光免疫分析等，此處僅指出其中一些。


圖1是由正常人血清的雙向電泳得到的圖像，顯示鑒定出了27個SARS診斷特征SF。
具體實施例方式
結(jié)合臨床資料評估，從10例SARS進展期患者(發(fā)病20天內(nèi))、10例SARS恢復(fù)期患者(發(fā)病30天后)和9例非SARS健康受試者的血清中，使用下面的參考試驗規(guī)程，用等電聚焦以及隨后的SDS-PAGE進行分析，每個樣品重復(fù)3次。樣品制備部分優(yōu)選地，可以預(yù)先將血清中的白蛋白和免疫球蛋白G進行去除。
1、樣品制備血清樣品首先進行總蛋白定量(Bio-Rad DC protein Assay)，按相當于總蛋白300μg進行等量分裝，待后續(xù)分析。
2、雙向電泳分析膠內(nèi)溶脹上樣樣品和溶脹液1(尿素7M，硫脲2M，CHAPS 2％，DTT 20mM，IPG buffer 0.5％，痕量溴酚藍)共350μl。溶脹和IEF的操作參數(shù)見表

等電聚焦完成后，將IPG膠條分放入10ml平衡液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.80.5ml，尿素3.6g，甘油3ml，SDS 0.2g，痕量溴酚藍)中，其中DTT濃度為20mM，振蕩15min。然后將膠條放入等量平衡液中烷基化15分鐘，其中加入100mM/LIAA。二相有兩種運行方案，一種利用Protean II垂直電泳單元，配制大小為200×200×1mm3，12.5％的均一膠。將平衡后的IPG膠條移至凝膠的上方，用0.5％的瓊脂糖/電泳緩沖液封閉。電泳緩沖液為Tris-Glycine-SDS系統(tǒng)(500ml，5×，7.5g Tris堿，2.5g SDS，36g甘氨酸)。在14-15℃時，以每一膠條20mA恒流運行40min，再加大電流至每塊膠30mA恒流運行至溴酚藍前沿到玻璃板下緣為止。另一種在Ettan DALTsix運行，采用Ettan預(yù)制膠體系(12.5％均一膠)。下槽為4.5升Tris-Glycine-SDS緩沖液，上槽為0.8升2×Tris-Glycine-SDS緩沖液，先以2.5W每塊膠運行30分鐘，再以15W每塊膠運行5-8小時。電泳完成后，立即將凝膠從電泳槽移出進行染色。熒光染料采用SYPRO Ruby(MolecularProbe)的使用說明進行操作。
3、凝膠成像分析染色后利用ImageScanner光學掃描儀，在256色灰度和300dpi的分辨率下，掃描并備份凝膠圖像。凝膠點的檢測(Spot detection)，背景消減(Backgroundsubstraction)、分子量和等電點校正、歸一化處理(Volume normalization)等分析用ImageMaster 2D Elite 3.01來完成。構(gòu)成一個膠內(nèi)蛋白質(zhì)點的所有象素點強度值的總和被定義為該蛋白質(zhì)點的絕對量，將整塊膠中每個點的絕對量累加，每一個蛋白點的量占累加值的百分含量(％Vol)可代表該蛋白質(zhì)點的相對豐度。
在每一個樣品組中，分析圖形以鑒定和選擇至少50％以上的圖形中存在的那些特征。然后比較每組間差別在2倍以上的那些特征，作為SARS診斷特征(SF)。對每一個SF，使用方差分析比較各組間統(tǒng)計學意義。
4、目標蛋白的鑒定將掃描后的凝膠圖像分析后，選取要作進一步鑒定的蛋白質(zhì)點。利用EttanSpotpicker(AB)自動切膠儀將蛋白點從電泳膠上切下并轉(zhuǎn)移至96孔板(Vitagene，杭州)中相應(yīng)的位置。采用經(jīng)優(yōu)化后的膠內(nèi)酶切條件，首先，膠粒用100μl 50％乙腈/25mM碳酸氫銨浸泡至少半個小時，用50μl純乙腈脫水，吸出乙腈后，在室溫放置10分鐘，待膠粒完全干燥。在每一個樣品孔中加入10μl10ng/μl測序級胰蛋白酶，于4℃放置30分鐘使膠粒充分溶脹。用不干膠片(Vitagene)密封96孔板后放于37℃水浴中酶切過夜。用8μl 0.1％TFA/50％ACN超聲提取(KQ-250B，昆山超聲儀器有限公司，江蘇)20分鐘后準備點靶用于質(zhì)譜分析。
5、結(jié)果與健康血清比較，SARS進展期血清展示了8個明顯降低的特征，個19明顯升高的特征；SASR恢復(fù)期血清展示了2明顯個降低的特征，9個明顯升高的特征。這些SF的詳細資料列于表1。通過表1的SF可以特異的篩選、診斷SARS，結(jié)合表1的SF，可以選取SF作為監(jiān)測SARS治療效果的標志或用于藥物開發(fā)。
這些SF中不同存在的SPI的部分氨基酸序列已鑒定出，詳細資料見表2。通過單獨或組合檢測SPI可以特異的篩選、診斷SARS；通過單獨或組合檢測SPI可以監(jiān)測SARS治療效果或用于藥物開發(fā)。
參考文獻1Kang X，Xu Y，Wu X，Liang Y，Wang C，Guo J，Wang Y，Chen M，Wu D，Wang Y，Bi S，QiuY，Lu P，Cheng J，Xiao B，Hu L，Gao X，Liu J，Wang Y，Song Y，Zhang L，Suo F，Chen T，Huang Z，Zhao Y，Lu H，Pan C，Tang H.Proteomic fingerprints for potential application to early diagnosis ofsevere acute respiratory syndrome.Clin Chem.2005 Jan；51(1)56-64.
2Chen JH，Chang YW，Yao CW，Chiueh TS，Huang SC，Chien KY，Chen A，Chang FY，WongCH，Chen YJ.Plasma proteome of severe acute respiratory syndrome analyzed by two-dimensionalgel electrophoresis and mass spectrometry.Proc Natl Acad Sci USA.2004 Dec7；101(49)17039-44.
3Ren Y，He QY，F(xiàn)an J，Jones B，Zhou Y，Xie Y，Cheung CY，Wu A，Chiu JF，Peiris JS，Tam PK.The use of proteomics in the discovery of serum biomarkers from patients with severe acuterespiratory syndrome.Proteomics.2004 Nov；4(11)3477-84.
權(quán)利要求
1.一種用于人類受試者中SARS的篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測向人類受試者施用的治療SARS藥物或治療效果的方法，包括a)用雙向電泳分析受試者血清或血漿樣品，以產(chǎn)生特征的電泳圖譜；b)對于強度與SARS的存在與否或進展相關(guān)的至少兩個所選特征，將所選特征中的每一個特征在樣品中的強度與對照血清或血漿中的特征的強度比較。其中，依賴樣品所選特征的強度對SARS進行診斷。
2.一種用于人類受試者中SARS的篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測向人類受試者施用的治療SARS藥物或治療效果的方法，包括a)用雙向電泳分析受試者血清或血漿樣品，根據(jù)等電點和電泳遷移率分離多種蛋白；b)定量檢測至少一種下列SARS診斷特征(SF)SF-1、SF-2、SF-3、SF-4、SF-5、SF-6、SF-7、SF-8、SF-9、SF-10、SF-11、SF-12、SF-13、SF-14、SF-15、SF-16、SF-17、SF-18、SF-19、SF-20、SF-21、SF-22、SF-23、SF-24、SF-25、SF-26、SF-27。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于(b)步驟包括定量檢測至少一種下列SARS診斷特征(SF)SF-1、SF-2、SF-3、SF-4、SF-5、SF-6、SF-15、SF-16、SF-17、SF-18、SF-19、SF-20、SF-21、SF-22、SF-26、SF-27。
4.一種用于人類受試者中SARS的篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測向人類受試者施用的治療SARS藥物或治療效果的方法，包括在受試者血漿或血清中樣品中，定量檢測至少一種下列SARS診斷蛋白同種型(SPI)SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5、SPI-6、SPI-7、SPI-8、SPI-9、SPI-10、SPI-11、SPI-12、SPI-13、SPI-14、SPI-15、SPI-16、SPI-17、SPI-18、SPI-19、SPI-20、SPI-21、SPI-22、SPI-23、SPI-24、SPI-25、SPI-26、SPI-27。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于包括定量檢測至少一種下列SARS診斷蛋白同種型(SPI)SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4、SPI-5、SPI-6、SPI-15、SPI-16、SPI-17、SPI-18、SPI-19、SPI-20、SPI-21、SPI-22、SPI-26、SPI-27。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于其中定量檢測的步驟包括檢測至少一個樣品等份，所述檢測步驟包括a)將針對預(yù)選SPI的免疫特異性抗體與等份樣品接觸；且b)檢測是否樣品等份中至少一種成分與抗體之間發(fā)生結(jié)合
7.權(quán)利要求2定義的一個或多個SF在人類受試者中的SARS篩選、診斷、預(yù)后中的用途，或用于監(jiān)測抗SARS藥物的作用中的用途
8.權(quán)利要求4定義的一個或多個SPI在人類受試者中的SARS篩選、診斷、預(yù)后中的用途，或用于監(jiān)測抗SARS藥物的作用中的用途
9.免疫特異性針對權(quán)利要求4定義的一個或多個SPI的一種或多種抗體在人類受試者中的SARS篩選、診斷、預(yù)后中的用途，或用于監(jiān)測抗SARS藥物的作用中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于嚴重急性呼吸綜合征(SARS)篩選、診斷、預(yù)后、監(jiān)測SARS治療效果和藥物開發(fā)的方法，描述了可以使用雙向電泳分析血清或血漿來測定的SARS診斷特征，以及SARS診斷蛋白質(zhì)同種型SPI、針對SPI的免疫特異性抗體。
文檔編號G01N33/569GK1932502SQ20051010247
公開日2007年3月21日 申請日期2005年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月14日
發(fā)明者賀福初, 錢小紅, 萬佳, 孫薇, 李曉海, 應(yīng)萬濤, 姜穎 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所