專利名稱：一種可溶性b7-h1定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可定量檢測可溶性B7-H1的試劑盒，具體涉及利用兩株特異性抗人B7-H1單克隆抗體S111U0D7以及B7_HlIg融合蛋白研制用于定量檢測分析可溶性 B7-H1因子的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的方法，該定量檢測體系可應(yīng)用在肺癌鑒別診斷和預(yù)后判斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
已知有許多受體/配體相互作用都參與誘導(dǎo)、建立和調(diào)節(jié)抗原特異性免疫反應(yīng)。 為了有效地激活T細(xì)胞反應(yīng)，通常至少需要兩個信號。其中除T細(xì)胞抗原受體(TCR)識別抗原提呈細(xì)胞(APC)上的MHC-抗原復(fù)合物以提供第一信號即抗原特異性信號外，還必須獲得T細(xì)胞與APC表達(dá)的共刺激分子相互作用后產(chǎn)生的第二信號。第二信號即為共刺激信號或協(xié)同刺激信號。如果僅有抗原特異性信號而缺失共刺激信號，T細(xì)胞將表現(xiàn)為無反應(yīng)或免疫耐受狀態(tài)，甚至導(dǎo)致凋亡?？梢姡泊碳ば盘柺荰細(xì)胞克隆擴(kuò)增、分化和發(fā)揮生物效應(yīng)所必不可少的。因此，第一信號決定了 T細(xì)胞活化的特異性，而第二信號則決定T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能否有效進(jìn)行。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究，共刺激分子被不斷發(fā)現(xiàn)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)，這些共刺激分子可分為兩類一類是腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體超家族，包括 CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4_1BB/4_1BBL 和 Fas/FasL 等。另一類是免疫球蛋白超家族，如 B7/C擬8、LAF1/ICAM-1、IC0S-GL50、PD-1/B7-H1、BTLA/HVEM 和 CD2/LFA-3 等。 這些協(xié)同刺激分子以受體/配體相互作用的方式傳導(dǎo)信號。受體/配體一般表達(dá)在不同的免疫細(xì)胞表面，通常一個為持續(xù)性表達(dá)，一個呈誘導(dǎo)性表達(dá)的特征。在免疫應(yīng)答的不同階段，這些分子以各自獨特而又相關(guān)聯(lián)的方式參與信號傳導(dǎo)，共同調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)有效啟動、適度應(yīng)答和適時終止。PD-I (⑶279)是由288個氨基酸組成的免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，被認(rèn)為與細(xì)胞凋亡相關(guān)而命名為程序性死亡-1 (programmed death-l，PD-l)。研究發(fā)現(xiàn)，PD-I 分子主要在T、B、NK細(xì)胞表面呈誘導(dǎo)性上調(diào)表達(dá)，未成熟的T、B細(xì)胞在胸腺和骨髓內(nèi)發(fā)育的特定階段也有弱表達(dá)，PD-I分子C末端的酪氨酸殘基可與下游的SHP-l、SHP-2等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子作用而抑制免疫細(xì)胞的進(jìn)一步活化。B7-H1 (B7-H1，⑶274)是PD-I的兩個配體之一， 與B7家族其它成員一樣，在蛋白結(jié)構(gòu)上B7-H1分子包含有IgV樣區(qū)、IgC樣區(qū)、跨膜區(qū)和一個短而保守的胞漿區(qū)尾部。B7-H1胞外區(qū)有4個保守的半胱氨酸殘基，參與Ig樣結(jié)構(gòu)中二硫鍵的形成，保持正確的空間結(jié)構(gòu)。B7-H1的mRNA不僅表達(dá)在實質(zhì)器官組織，如心臟、肺、 肝和胎盤等，部分抗原遞呈細(xì)胞上也有適度表達(dá)，如活化的B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞；在胸腺上皮細(xì)胞和多種上皮性來源的腫瘤細(xì)胞株上B7-H1 mRNA呈高表達(dá)。蛋白水平上，B7-H1在活化的T、B、單核細(xì)胞和多種類型的腫瘤細(xì)胞(如肺癌、肝癌、乳腺癌和鱗狀細(xì)胞癌等)上誘導(dǎo)性表達(dá)。大量的研究表明，B7-H1與活化的T細(xì)胞上PD-I相互作用可顯著抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞的生物學(xué)功能，PD-I或B7-H1的表達(dá)改變導(dǎo)致PD-1/PD-L抑制途徑發(fā)生異常，進(jìn)而引
3發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫功能亢進(jìn)/低下性疾病。Dong H等研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的激發(fā)型抗⑶3單抗與B7_HlIg聯(lián)合應(yīng)用可有效刺激 T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)IL-IO的分泌，這種正性刺激作用呈IL-2依賴性，對小鼠B7-H1的研究也獲得了類似的結(jié)果。但后來更多的研究表明，B7-H1能與其負(fù)性受體PD-I相互作用抑制 T細(xì)胞的增殖和活化，尤其能顯著降低IL-2、IFN- γ和IL-IO的分泌。B7-H1對T細(xì)胞功能的影響主要依賴于TCR和⑶觀信號的強度，在亞適量TCR信號刺激下，B7-H1對T細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，而在最適量TCR信號時，僅在沒有CM8協(xié)同刺激信號的條件下才對T細(xì)胞增殖發(fā)揮促進(jìn)作用，PD-1/B7-H1抑制途徑所介導(dǎo)的效應(yīng)可被⑶觀信號或IL-2逆轉(zhuǎn)。因此，PD-1/B7-H1負(fù)性信號可顯著抑制T細(xì)胞的活化增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。PD-1/PD-L相互作用后抑制Bcl_xL的表達(dá)，對效應(yīng)性T細(xì)胞多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)產(chǎn)生抑制，如GATA-3、Tbet和Eomes。體外應(yīng)用轉(zhuǎn)染PD-I或Fc γ R II -PD-I融合蛋白基因的B淋巴瘤細(xì)胞系的研究表明，PD-I可抑制B細(xì)胞受體的刺激性信號，從而降低B細(xì)胞活化。BCR與PD-I交聯(lián)后可抑制Ca2+內(nèi)流及下游信號激活分子如syk、PII、磷脂酶-3和 vav的酪氨酸殘基的磷酸化。有趣的是，這種抑制效應(yīng)并不需要PD-I胞漿區(qū)N端位于ITIM 活化抑制基序內(nèi)的酪氨酸殘基參與，而是由C端的酪氨酸殘基與SHP-2酪氨酸磷酸酶結(jié)合的結(jié)果。此外，PD-I也可抑制更下游的信號激活分子一絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)的酪氨酸殘基磷酸化而抑制B淋巴瘤細(xì)胞系的增殖。另外，以Jurkat細(xì)胞株為模型的研究結(jié)果也表明TCR與PD-I的交聯(lián)可引起SHP-2的磷酸化并向PD-I的胞漿區(qū)募集。PD-1/B7-H1抑制途徑與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織組成性高表達(dá)B7-H1，如肺癌、肝癌、乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌及卵巢癌。PD-1/B7-H1抑制途徑對CD8+ T細(xì)胞的活化增殖有明顯的抑制作用，腫瘤細(xì)胞可通過此途徑逃避CTL殺傷作用，減弱機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答。用阻斷型抗B7-H1單抗阻斷PD-1/B7-H1信號可以通過上調(diào)IFN- y、IL-2、IL-IO的分泌有效逆轉(zhuǎn)⑶4+和⑶8+ T細(xì)胞的增殖受抑，同時T細(xì)胞的活化程度和殺傷能力增強。這提示PD-1/B7-H1途徑可能是腫瘤細(xì)胞逃避免疫識別和免疫清除的原因之一。另外，腫瘤微環(huán)境因子可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)B7-H1，該分子的出現(xiàn)和上調(diào)有利于腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步生長和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)浸潤的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞凋亡。Dong H等動物模型研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了 B7-H1基因的P815腫瘤細(xì)胞系在體外可抵制特異性CTL的裂解，將其接種小鼠體內(nèi)后具有更強的致瘤性和侵襲性。然而，這些生物學(xué)特性均可通過阻斷B7-H1 而逆轉(zhuǎn)。因此，可制備特異性抗B7-H1單抗或PD-I可溶性抑制因子，通過阻斷PD-1/B7-H1 信號對該抑制途徑的作用進(jìn)行封閉，增強CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，有效抑制腫瘤的形成和生長。這為腫瘤免疫治療開辟了新途徑。更為重要的是，最新研究表明B7-H1的表達(dá)強度可以作為腫瘤患者預(yù)后的臨床判斷指標(biāo)。PD-1/PD-L途徑作為重要的細(xì)胞周期檢查點，發(fā)揮著特異性的抗原依賴性負(fù)性調(diào)控作用，是藥物干涉機(jī)體以及抗腫瘤免疫治療的靶分子之一，具有潛在的應(yīng)用價值。
作為負(fù)性協(xié)同刺激信號，B7-H1在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中無論廣度還是深度均扮演著重要的角色，參與淋巴細(xì)胞活化，在免疫耐受和免疫損傷方面發(fā)揮著無可替代的作用。PD-I/ B7-H1的相互作用，有效降低了 IFN-Y和TNF-α的表達(dá)，為移植排斥、自身免疫病和過敏癥等的治療提供了一些新的思路。一方面，通過增強PD-I抑制信號以降低機(jī)體免疫細(xì)胞的過度活化、增殖，減輕淋巴細(xì)胞對自身組織的損傷和自身抗原的持續(xù)應(yīng)答，也可以通過增強該負(fù)性信號以減輕宿主免疫系統(tǒng)對移植物的排斥反應(yīng)，提高移植物的存活率；另一方面，通過特異性阻斷PD-1/B7-H1抑制信號使機(jī)體中失能的效應(yīng)性細(xì)胞恢復(fù)生物學(xué)功能，促進(jìn)腫瘤和病毒特異性CD8+ T細(xì)胞的活化增殖與細(xì)胞因子的分泌，增強淋巴細(xì)胞對腫瘤抗原、外來入侵的病毒等的殺傷力，提高機(jī)體免疫力及時清除腫瘤細(xì)胞和病毒。PD-1/PD-L有望成為腫瘤免疫治療的有效靶分子，也為HIV和HBV等慢性病毒性感染的治療提供一個新的策略。2006年，美國FDA已批準(zhǔn)了一株人源化抗人PD-I單抗，用于腫瘤和傳染病等方面的臨床治療研究。隨著研究的不斷深入，PD-1/PD-L在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和各類臨床疾病的研究、預(yù)防、診斷與治療中的作用將得以徹底闡明。 肺癌的發(fā)病率和病死率在西方國家和我國大城市中均已居各類惡性腫瘤的首位。 2008年中國衛(wèi)生部頒布的第三次全國死因調(diào)查情況表明惡性腫瘤位列城市人口死亡原因的首位，肺癌上升幅度最大，達(dá)465%。肺癌局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相對隱匿、導(dǎo)致早期診斷和預(yù)防困難。因此，臨床治療主要是面對中晚期肺癌人群，長期以來5年生存率僅在10-15%左右。隨著腫瘤分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的快速發(fā)展，人們認(rèn)識到肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個多階段、多步驟、多基因參與調(diào)控的復(fù)雜生物學(xué)過程，且與患者機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。 當(dāng)今研究除了需研發(fā)有效的分子檢測技術(shù)對肺癌患者做出臨床早期診斷外，還需對在肺癌發(fā)生、發(fā)展和免疫逃逸中起重要作用的信號途徑及靶分子進(jìn)行深入研究。在惡性腫瘤患者體內(nèi)，進(jìn)入淋巴管或血管的瘤細(xì)胞只有某些瘤細(xì)胞亞群得以優(yōu)勢生長，獲得轉(zhuǎn)移表型。這些具有高轉(zhuǎn)移潛能的瘤細(xì)胞如何逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視、抵御抗原特異性T細(xì)胞殺傷作用的機(jī)制尚未完全闡明。近年來，分子診斷和靶向治療已成為肺癌治療領(lǐng)域的研究熱點，其中，針對表皮生長因子受體(EGFR)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的靶向治療藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)和抗VEGF抗體等在肺癌臨床得到廣泛應(yīng)用，在有選擇性的肺癌人群中取得了明顯生存獲益。隨著對機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)機(jī)制和腫瘤發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識逐步深入，我們發(fā)現(xiàn)負(fù)性協(xié)同刺激分子B7-H1在肺癌等多種上皮腫瘤異常高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，有望成為臨床肺癌個體化防治的重要靶點之一，并有可能成為肺癌危險度、療效及預(yù)后評估的實驗室基礎(chǔ)。
研究發(fā)現(xiàn)，許多協(xié)同刺激分子能分別以細(xì)胞膜型和可溶性兩種形式存在，包括CD40、 0X40L、4-1BBL、⑶86、⑶30和CTLA-4等。可溶性分子可以通過蛋白水解酶裂解細(xì)胞上的膜型分子而形成，例如B7-H3和S4-1BBL ；也可以由專一的mRNA編碼產(chǎn)生，例如s⑶86 和sCTLA-4。許多可溶性協(xié)同刺激分子的表達(dá)水平具有臨床診斷價值，例如，可溶性CD40L (s⑶40L)是活化的⑶4+ T細(xì)胞和血小板表面膜型⑶40L分子裂解而來，s⑶40L水平在某些自身免疫疾病的血清中異常升高，原發(fā)性血小板增多癥和動脈硬化患者的血清中SCD40L 水平也較高。可溶性⑶30分子在某些腫瘤和艾滋病(AIDS)患者的血清中也呈現(xiàn)高水平表達(dá)。業(yè)已表明，機(jī)體中可溶性分子和膜表面的分子一樣具有相應(yīng)的生物學(xué)功能，一方面，細(xì)胞膜上的分子能夠通過直接的受體/配體相互作用介導(dǎo)協(xié)同刺激信號；另一方面，可溶性蛋白因子能夠像細(xì)胞因子一樣參與血液循環(huán)在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，它們既能夠影響鄰近細(xì)胞又能夠和遠(yuǎn)端細(xì)胞表面的受體相互結(jié)合，從而參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，其發(fā)揮作用的廣度和深度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過細(xì)胞膜表面的分子。迄今為止，因缺乏有效的檢測方法，國內(nèi)外尚未有對可溶性B7-H1 (sB7-Hl)的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種可定量檢測可溶性B7-H1的試劑盒。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種可定量檢測可溶性B7-H1 的試劑盒，包括辣根過氧化物酶標(biāo)記、反應(yīng)底物四甲基聯(lián)苯胺、牛血清白蛋白、酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品蛋白、洗液和終止液，所述試劑盒還包括包被抗體和檢測抗體，其中，所述包被抗體為鼠抗人B7-H1單克隆抗體，其重鏈具有如序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，或序列表中SEQ ID NO :5所示氨基酸序列，其輕鏈具有如序列表中SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，或序列表中SEQ ID NO :6所示氨基酸序列；所述檢測抗體為鼠抗人B7-H1單克隆抗體，其重鏈具有如序列表中SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，或序列表中SEQ ID NO :7所示氨基酸序列， 其輕鏈具有如序列表中SEQ ID NO :4所示核苷酸序列，或序列表中SEQ ID NO :8所示氨基酸序列。優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述包被抗體為鼠抗人B7-H1單克隆抗體aill，由保藏號為的CGMCC No. 1637的雜交瘤細(xì)胞株Slll (抗PD-Ll)制備的單克隆抗體；所述檢測抗體為鼠抗人B7-H1單克隆抗體10D7，由保藏號為CGMCC No. 4802的分泌小鼠抗人PD-Ll分子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株SIPD-Ll (10D7)制備的單克隆抗體。上述技術(shù)方案中，雜交瘤細(xì)胞株Slll (抗PD-L1)的保藏信息為保藏號CGMCC No. 1637，建議的分類命名雜交瘤細(xì)胞，保藏日期2006年03月08日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號， 中國科學(xué)院微生物研究所；雜交瘤細(xì)胞株SIPD-Ll (10D7)的保藏信息為保藏號=CGMCC No. 4802，建議的分類命名分泌小鼠抗人PD-Ll分子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏日期2011年4月27日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所。上述技術(shù)方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)品蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品蛋白B7-Hllg蛋白，即為普通的現(xiàn)有技術(shù)中的B7-Hllg蛋白。上述技術(shù)方案中，所述洗液選自含體積分?jǐn)?shù)0. 029Γ0.洲的吐溫20(TWeen-20)的 0. 002M咪唑鹽溶液或者PH7. 4的PBS溶液，優(yōu)選為含體積分?jǐn)?shù)0. 02%吐溫20 (Tween-20) 的PH7. 4的PBS溶液。上述技術(shù)方案中，所述終止液選自2M的硫酸或者1%HC1溶液；優(yōu)選為2M的硫酸。所描述的試劑盒除包括本發(fā)明的抗細(xì)胞表面B7-H1分子的單克隆抗體外，還可包括血液樣品收集裝置以及相關(guān)溶劑、緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)品等。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種鼠抗人B7-H1單克隆抗體S111，所述單克隆抗體的重鏈如序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO :5所示氨基酸序列；所述單克隆抗體的輕鏈如序列表中SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO 6所示氨基酸序列。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種鼠抗人B7-H1單克隆抗體10D7，所述單克隆抗體的重鏈如序列表中SEQ ID NO 3所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO 7所示氨基酸序列；所述單克隆抗體的輕鏈如序列表中SEQ ID NO :4所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO :8所示氨基酸序列。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株為分泌小鼠抗人 B7-H1單克隆抗體Slll的雜交瘤細(xì)胞株Slll (抗PD-L1)，其保藏號為CGMCC No. 1637。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株為分泌小鼠抗人 B7-H1單克隆抗體10D7的雜交瘤細(xì)胞株SIPD-Ll (10D7)，其保藏號為CGMCC No. 4802。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點
1.本發(fā)明所述可定量檢測可溶性B7-H1的試劑盒具有良好的特異性，可以精確地定量分析人細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿和胸水等液體中的可溶性B7-H1蛋白因子的濃度。2.本發(fā)明所述可定量檢測可溶性B7-H1的試劑盒具有良好的靈敏度，可在 0. 195 12. 5ng/ml的sB7_Hl濃度范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系。


雜交瘤細(xì)胞株Slll (抗PD-Ll)的保藏信息為保藏號CGMCC No. 1637，建議的分類命名雜交瘤細(xì)胞，保藏日期2006年03月08日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所；雜交瘤細(xì)胞株SIPD-Ll (10D7)的保藏信息為保藏號CGMCC No. 4802，建議的分類命名分泌小鼠抗人PD-Ll分子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏日期2011年4月27 日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所。圖1為實施例一中抗體鑒定圖2、3為實施例一中抗體的特異性分析； 圖4為實施例一中抗原表位競爭實驗結(jié)果圖5為實施例二中人可溶性B7-H1 ELISA試劑盒的特異性分析的結(jié)果圖； 圖6A 6B為實施例二中人可溶性B7-H1 ELISA試劑盒線性檢測范圍的分析圖及試劑盒定量分析時所得濃度和OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖7為實施例二中人可溶性B7-H1 ELISA試劑盒可用于測定基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中的SB7-H1的結(jié)果圖8為實施例三中應(yīng)用試劑盒定量分析時所得濃度和OD值的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 圖9為實施例三中定量分析不同腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清中SB7-H1的表達(dá)水平的結(jié)果
圖10為實施例四中定量分析不同病理類型和分期的肺癌患者外周血SB7-H1的表達(dá)水平的結(jié)果圖11為實施例四中定量分析不同腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移級別肺癌患者外周SB7-H1表達(dá)水平的結(jié)果圖12為實施例四中定量分析肺癌患者外周血中SB7-H1動態(tài)變化與臨床療效的關(guān)系的結(jié)果圖13為實施例四中定量分析SB7-H1與各腫瘤標(biāo)志物之間關(guān)系的ROC曲線；圖14為實施例五中分析可溶性B7-H1檢測體系分析該因子在不同年齡段健康志愿者外周血中的表達(dá)特性的結(jié)果圖15為實施例五中應(yīng)用實施例三所述試劑盒分析可溶性B7-H1在肺癌患者外周血清中的表達(dá)水平的結(jié)果圖16為實施例五中應(yīng)用實施例三所述試劑盒分析可溶性B7-H1在肺癌患者胸水中的表達(dá)水平的結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實施例一
(1)試劑和材料小牛血清Hyclone公司(美國);每升RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基(Gibco， 美國)中添加小牛血清100ml、L-谷氨酰胺0. 15g、NaHCO3 2. Og、丙酮酸鈉0. llg、葡萄糖3. 6g、HEPES 4. 766g、2_巰基乙醇10. Oml ；HAT、HT選擇培養(yǎng)基將50倍濃度的HAT、HT 選擇培養(yǎng)基(Sigma，美國)，用RPMI1640或DMEM完全培養(yǎng)基稀釋為工作濃度；福氏佐劑 (Freund，adjuvant，Sigma，美國)；細(xì)胞融合劑聚乙二醇(PEGlSOO)Jrotein G親和層吸柱 (PharmaciaJi^W)Pristane (Sigma，美國)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶、板(Nunc，丹麥);C02 培養(yǎng)箱、離心機(jī)(Jouan，法國)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)，流式細(xì)胞儀(Coulter，美國)；轉(zhuǎn)人B7-H1 基因細(xì)胞株LM9/B7-H1 (本人構(gòu)建)。所有細(xì)胞株經(jīng)檢測，均無支原體污染；6、周齡的雌性Balb/c小鼠(上海實驗動物中心)。(2)細(xì)胞株的培養(yǎng)采用含10% FCS的RPMI1640培養(yǎng)基，基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株定期用抗性篩選藥物kocin (50(^g/ml)加壓培養(yǎng)，以保持目的基因產(chǎn)物的穩(wěn)定高表達(dá)。L929/ Β7-Η1和L^9/moCk細(xì)胞為貼壁性生長，傳代時用0. 25%的胰酶消化；其它細(xì)胞為懸浮性生長，間隔2 3天換液。(3)動物免疫收集生長良好的L^9/B7_H1細(xì)胞，用PBS洗滌二遍后，加入絲裂霉素溶液(50μβ/100μ 1/1X107)，混勻，置于37°C，45min，PBS洗滌三遍后，再用0. 3 0. 4ml 的生理鹽水重新懸浮，與等量的IFA充分乳化，分別于頸部皮下多點及腹腔注射(IX IO7/ 只)；并于初次免疫后第三周、第五周再行免疫，將細(xì)胞數(shù)量改為8X106/只，細(xì)胞的預(yù)處理及注射的部位同上，于融合前4飛天，再次腹腔注射5X IO6/只以加強免疫。(4)骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備融合前1(Γ14天，復(fù)蘇小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，用含10% FCS的DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛、形態(tài)良好，且細(xì)胞活力大于95%方可用于融合。融合前對 3他用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為3 X 105/ml。(5)飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備于融合前1天，取Balb/c小鼠，摘除眼球致死，自來水沖洗后置于75%酒精中l(wèi)Omin，然后固定于解剖架上，沿胸骨打開小鼠胸腔，剪下胸腺，置于200 目的鋼絲網(wǎng)中，將篩網(wǎng)移入盛有IOml基礎(chǔ)培養(yǎng)基的平皿中，研磨胸腺，使其成為單個細(xì)胞而懸于培養(yǎng)基中；吸取少許細(xì)胞懸液計數(shù)，lOOOrpm，離心8min，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3 4X 105/ml，于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入0. Iml細(xì)胞懸液(相當(dāng)于3^4 X IO4/孔)，CO2 培養(yǎng)才苜中培養(yǎng)ο(6)免疫小鼠脾臟細(xì)胞的制備取加強免疫后的小鼠按上述方法處死，處理小鼠， 打開腹腔，在左后腹部取出脾臟，經(jīng)研磨獲取單個脾臟細(xì)胞。用苔盼藍(lán)液作活細(xì)胞有核計數(shù)，離心(IOOOrpmX 8min)，洗滌兩遍后將沉淀細(xì)胞懸于20ml RPMI1640中，置于培養(yǎng)箱中(7)細(xì)胞的融合及選擇性培養(yǎng)將RPMI1640或DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PEG溶液置于 37°C水浴中預(yù)溫。收集2 X IO7個生長良好的SP2/0細(xì)胞，與1 X IO8個脾臟細(xì)胞混合于50ml 透明塑料離心管中，用RPMI1640洗滌兩遍，IOOOrpm離心Smin后棄盡上清，用手指彈擊管底，使兩種沉淀細(xì)胞充分混勻成糊狀。將塑料管置于37°C保溫杯中，吸取PEG溶液lml，將尖頭吸管輕輕插入細(xì)胞懸液底部，在Imin內(nèi)勻速加完，且邊加邊輕輕攪拌，然后在水浴中靜置90s。再加入40ml 37°C預(yù)溫的無血清DMEM，室溫靜止5min，離心(800rpmX IOmin),棄上清。將沉淀細(xì)胞輕輕重懸置于40ml含2%HAT、15%FCS的DMEM培養(yǎng)中?；靹蚝蟮渭釉诤酗曫B(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，ΙΟΟμΙ/孔，37°C,5%C02培養(yǎng)，3、天半量換液，10天后改用HT 培養(yǎng)基，2周后轉(zhuǎn)用含15%FCS的DMEM培養(yǎng)基。(8)雜交瘤細(xì)胞的篩選待細(xì)胞克隆布滿1/3 1/4培養(yǎng)孔時，即可吸取上清用間接免疫熒光標(biāo)記法進(jìn)行篩選。將生長良好的Li^9/B7-Hl細(xì)胞用PBS洗滌后，分加于流式管中 (5X IO5/管)，加入雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清(50μ1/管)。于4°C反應(yīng)30min，用含1%小牛血清的PBS洗滌兩遍，加入PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，再于4°C反應(yīng)30min，洗滌后用FACS分析，同時以L^9/mock、L929/B7. U L929/PD-L2細(xì)胞作為陰性對照細(xì)胞株。穩(wěn)定表達(dá)人B7-H1的L9^/B7_H1基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行鑒定，將復(fù)測為陽性的克隆連續(xù)3次克隆化培養(yǎng)，最終獲得2株能持續(xù)分泌特異性抗人B7-H1分子的雜交瘤細(xì)胞株，命名為Slll和10D7，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，該單抗能特異性識別人B7-H1，而不與mock、 B7. 1和PD-L2等基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)合(圖1)。(9)雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法，將抗體反應(yīng)陽性孔細(xì)胞準(zhǔn)確計數(shù)后，用HAT選擇培養(yǎng)基梯度稀釋為50個/ml和10個/ml細(xì)胞，加ΙΟΟμΙ/孔于含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中。使每孔平均含有5個和1個細(xì)胞，37°C、5%C02培養(yǎng)。適時換液并根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)及時按已建立的陽性克隆的篩選方法進(jìn)行復(fù)篩。選擇抗體效價高、呈單個克隆生長、形態(tài)良好的細(xì)胞繼續(xù)克隆，直至抗體分泌陽性率大于95% ；擴(kuò)大培養(yǎng)并及時液氮凍存。(10)單克隆抗體的制備采用腹水體內(nèi)誘生方法生產(chǎn)單克隆抗體。取6、周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔注入I^ristane 0. 5ml/只。一周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1 X IO7/只， 同時另一側(cè)腹腔再次注入Pristane和福氏半佐的等體積混合物0. 2ml/只，輕輕按摩小鼠腹部，使雜交瘤細(xì)胞分散于腹腔中。5 10天后收獲腹水，離心取上清分裝后-80°C保存。(11)抗體純化將腹水解凍，離心去除凝塊，取上清液按50%飽和度加入等體積飽和(NH4)2SO4溶液，混勻后置4°C 4 6小時，離心棄上清。取沉淀加PH7. 4的PBS復(fù)溶。透析去除(NH4)2SO4,樣品經(jīng)ftOtein G親和層吸柱再用PH2. 8甘氨酸-鹽酸洗脫。收集蛋白洗脫峰用PH9. 0的Tris-Base調(diào)節(jié)PH至7. 0，PBS透析后用紫外分光光度計測定抗體蛋白的含量，其濃度的計算公式為抗體蛋白含量(mg/ml) =OD^OXl. 55-0D260X0. 76。結(jié)果 單克隆抗體ZHll和10D7濃度分別為2. 16mg/ml和1. 93mg/ml。(12)單克隆抗體效價測定將生長良好的L^9/B7_H1細(xì)胞分于流式管中，5X105/ 管。分別加入雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清、腹水和純化的抗體蛋白梯度稀釋液(20μ1/管)，于 4V反應(yīng)30min，PBS洗滌后加入羊抗鼠IgG-PE，再于4V反應(yīng)30min。洗滌后用流式細(xì)胞儀
9分析，以出現(xiàn)同樣陽性率及熒光強度時的最大稀釋倍數(shù)為抗體的效價。結(jié)果顯示兩株抗體的效價均達(dá)1:10000以上。(13)單抗隆抗體的類型鑒定取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清1:50、腹水1:20000稀釋。 取0.2ml稀釋液加于含有亞類定性試劑的小試管中，室溫放置lmin，待其自然溶解后輕輕混勻，將亞類定性試紙條輕輕插入管中，5 10min后，試紙的一面出現(xiàn)與mAb重鏈名稱相對應(yīng)的蘭色蛋白顯色條帶，此即該抗體所屬的小鼠Ig亞類；而另一面出現(xiàn)與mAb輕鏈名稱相對應(yīng)的蘭色蛋白條帶，此即該mAb的輕鏈類型。對上述兩單克隆抗體進(jìn)行測序，測序結(jié)果見核苷酸/氨基酸序列表的SEQ ID No:廣8，其中，鼠抗人B7-H1單克隆抗體Slll的重鏈具有如序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO :5所示氨基酸序列；其輕鏈具有如序列表中SEQ ID NO 2所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO 6所示氨基酸序列；鼠抗人B7-H1單克隆抗體IOD的重鏈具有如序列表中SEQ ID NO 3所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO :7所示氨基酸序列；其輕鏈具有如序列表中SEQ ID NO :4所示核苷酸序列，或如SEQ ID NO 8所示氨基酸序列。(14)單克隆抗體的特異性鑒定將 L9^/mock、L929/B7-H1、L929/PD-L2、L929/ B7. 1 和 L929/B7. 2 等細(xì)胞裂解液或人 IgG, B7_HlIg、PD_L2Ig、Β7· IIg 和 CD28Ig 蛋白用碳酸鹽緩沖液(0. 01M,PH9. 3)調(diào)整為0. 2μ g/ml包被ELISA檢測板，4°C過夜。洗滌2次后用 2% BSA 37°C封閉lh，洗滌2次后加入研制獲得的鼠抗人B7-H1單抗，37°C反應(yīng)lh，洗滌后加入HRP-羊抗鼠186二抗(1:1000，10(^1/孔)，371繼續(xù)反應(yīng)lh，PBS洗滌6次，再加入新鮮配制的底物 TMB (100μ l，Sigma，美國)，37°C反應(yīng) 15min，用 2mol/L H2SO4 (50μ1/孔) 終止酶與底物的反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定0D45(i。將L929/mock、L929/B7-H1、L929/PD-L2、L929/B7. 1 和 L929/B7. 2 等細(xì)胞裂解液包被ELISA板，檢測結(jié)果顯示，研制獲得的Slll和10D7單抗可特異性識別細(xì)胞裂解液中 B7-H1蛋白(圖2)；同樣，這兩株單抗也可特異性識別商品化B7-Hllg重組蛋白(圖3)。(15)生物素標(biāo)記單抗取待標(biāo)記的抗人B7-H1單抗(10D7) 200μβ，加入含有Iml 的0.01Μ ΡΗ=9. 3碳酸緩沖液透析袋中，于4°C下透析平衡過夜后，加入濃度為lmg/ml的 BNHS-DMS0溶液40μ1，室溫避光反應(yīng)4小時，再于4°C下在PH7. 2 PBS中透析72小時，分裝后-20°C保存。(16)抗體競爭實驗將L^9/B7_H1細(xì)胞(5X IO5/管)用PBS洗滌后分別加入不同濃度的單克隆抗體(每管0. 016 l(^g)，4°C孵育30min，洗滌后加入Biotin標(biāo)記的單抗(每管lPg)，再4°C孵育30min，洗滌后加入str印tavidine-PE，4°C孵育30min并洗滌后用流式細(xì)胞儀分析，同時設(shè)陽性和陰性對照組。以L929/B7-H1為競爭靶細(xì)胞對獲得的單抗Slll和10D7所識別的抗原位點進(jìn)行分析，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記的競爭抑制實驗，結(jié)果顯示，不同濃度的10D7均不能有效阻斷 Biotin標(biāo)記的Slll與L^9/B7-H1的結(jié)合。因此，10D7識別的抗原表位不同于Slll (圖4)。將上述兩雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行保藏，雜交瘤細(xì)胞株Slll (抗PD-L1)的保藏信息為 保藏號CGMCC No. 1637，建議的分類命名雜交瘤細(xì)胞，保藏日期2006年03月08日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所；雜交瘤細(xì)胞株SIPD-Ll (10D7)的保藏信息為保藏號CGMCC No. 4802，建議的分類命名分泌小鼠抗人PD-Ll分子單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏日期2011年4月27日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所。
實施例二
一種可定量檢測可溶性B7-H1的試劑盒，包括以下組分
權(quán)利要求
1.一種核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一種核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.一種核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4.一種核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
5.一種鼠抗人B7-H1單克隆抗體S111，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈如序列表中SEQ ID NO :1所示核苷酸序列所示，或如SEQ ID NO :5所示氨基酸序列所示；所述單克隆抗體的輕鏈如序列表中SEQ ID NO 2所示核苷酸序列所示，或如SEQ ID NO 6所示氨基酸序列所示。
6.一種鼠抗人B7-H1單克隆抗體10D7，其特征在于，所述單克隆抗體的重鏈如序列表中SEQ ID NO 3所示核苷酸序列所示，或如SEQ ID NO 7所示氨基酸序列所示；所述單克隆抗體的輕鏈如序列表中SEQ ID NO :4所示核苷酸序列所示，或如SEQ ID NO :8所示氨基酸序列所示。
7.一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞株為分泌小鼠抗人B7-H1單克隆抗體Slll的雜交瘤細(xì)胞株Slll (抗PD-Ll )，其保藏號為CGMCC No. 1637。
8.一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞株為分泌小鼠抗人B7-H1單克隆抗體10D7的雜交瘤細(xì)胞株SIPD-Ll (10D7)，其保藏號為CGMCC No. 4802。
9.一種可定量檢測可溶性B7-H1的試劑盒，包括辣根過氧化物酶標(biāo)記、反應(yīng)底物四甲基聯(lián)苯胺、牛血清白蛋白、酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品蛋白、洗液和終止液，所述試劑盒還包括包被抗體和檢測抗體，其特征在于，所述包被抗體為權(quán)利要求5所述鼠抗人B7-H1單克隆抗體；所述檢測抗體為權(quán)利要求6所述鼠抗人B7-H1單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可定量檢測可溶性B7-H1的試劑盒，包括本辣根過氧化物酶標(biāo)記、反應(yīng)底物四甲基聯(lián)苯胺、牛血清白蛋白、酶標(biāo)板、洗液和終止液，所述試劑盒還包括包被抗體、標(biāo)準(zhǔn)品蛋白和檢測抗體，其中，所述包被抗體為鼠抗人B7-H1單克隆抗體，其重鏈具有如序列表中SEQIDNO1所示核苷酸序列，其輕鏈具有如序列表中SEQIDNO2所示核苷酸序列；所述檢測抗體為鼠抗人B7-H1單克隆抗體，其重鏈具有如序列表中SEQIDNO3所示核苷酸序列，其輕鏈具有如序列表中SEQIDNO4所示核苷酸序列。本發(fā)明所述可定量檢測可溶性B7-H1的試劑盒具有良好的特異性，可以精確地定量分析人細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿和胸水等液體中的可溶性B7-H1蛋白因子的濃度。
文檔編號C12R1/91GK102250911SQ20111014489
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者張學(xué)光, 施敏驊, 王勤, 胡振華, 陳永井 申請人:蘇州大學(xué)