專利名稱：一種肺癌早期特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用檢測試劑技術(shù)領域,具體涉及一種肺癌早期特異性自身抗體 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
肺癌是常見的惡性腫瘤，也是威脅人類生命健康最為嚴重的惡性腫瘤，不同 種族發(fā)病率有所不同，根據(jù)中國國家衛(wèi)生局衛(wèi)生信息中心數(shù)據(jù)表明，2004年-2005 年肺癌病死率為30.61/10萬,均居男女惡性腫瘤的第1位。肺癌早期診斷和及時治 療是延長5年存活期的關鍵，但由于早期癥狀不明顯，超過50%的肺癌在明確診 斷時己經(jīng)處于中晚期，甚至發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)機會，因此探索肺癌早期診斷 和篩查方法非常重要。目前用于肺癌早期診斷的方法主要依靠影像學檢查，如X 線檢查、CT、支氣管鏡等方法，但是這些方法只能在肺癌組織足夠大的情況下， 依賴于相應設備完成，成本高，且給患者造成痛苦，難以用于普查。應用血清學 進行肺癌檢測的方法主要還依靠癌胚抗原(CEA)、 NSE、 Ca199， Ca125等単 一指標,缺乏敏感性和特異性，不能對多種組織類型肺癌進行早期診斷。因此尋 找新的流行病學早期篩査生物學標志,建立能適應多種組織類型肺癌的高通量特 異檢查方法是當務之急。
當腫瘤發(fā)生后，腫瘤細胞表面或分泌的特征抗原刺激機體產(chǎn)生抗體，而自身 抗體存在于尚無癥狀的早期腫瘤患者血清中。通過尋找肺癌特征抗原，利用它來 檢測患者血清中的特異性自身抗體，從而做為分子標志，可以早期發(fā)現(xiàn)肺癌，與 現(xiàn)行的其他方法相比,具有微創(chuàng)、簡單、經(jīng)濟、敏感度及特異度高等特點,方便用 于社區(qū)人群的篩査，從而達到早期檢測肺癌的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過尋找肺癌特征抗原，利用它來檢測患者血清中的特異 性自身抗體，可以早期發(fā)現(xiàn)肺癌。本發(fā)明提供一種肺癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。 本發(fā)明的肺癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，由固相載體和含有肺癌抗
原肽I (SMMU-EPI I )、肺癌抗原肽II (SMMU-EPI II )、肺癌抗原肽III (SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV (SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPI V)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)的六個重組噬菌體液各100-200"(滴度 為108--1015pfu/L，用0.5。/。-2。/。BSA按1:2—1: 8稀釋)，2°C—6。C搖床2h-4h,
等量分別包被到固相載體上不同的酶標孔中所組成。 所述重組肺癌特異抗原肽是利用T7噬菌體將肺癌CDNA文庫展示到噬菌體 表面,并經(jīng)親和篩選和血清學分析從中篩選出的，它具有檢測肺癌病人血清中由 于腫瘤刺激所產(chǎn)生的自身抗體的能力。將篩選出的多個抗原肽經(jīng)過并聯(lián)，從而達
到早期檢測和篩選肺癌病人的目的。
所述特異性抗原肽為肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I )、肺癌抗原肽II(SMMU-EPI II)、腫癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV (SMMU-EPIIV)、肺癌抗原 肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)，它們的編碼核苷酸序列和 氨基酸序列分別見本發(fā)明說明書的核苷酸及其對應氨基酸序列表。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述肺癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
的制備方法。
一、 制備重組肺癌特異抗原肽 1)構(gòu)建肺癌噬菌體展示肽庫
抽提30例新鮮肺癌組織總RNA ,等量混合成1mg后抽提mRNA ,應用隨機引物反 轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA水端進行平齊，加Ecol I/Hind III接頭，用Ecol I和Hind
ni兩種限制性內(nèi)切酶依次進行酶切反應后，去除小片斷，接入T7噬菌體雙臂，進 行體外包裝，從而構(gòu)建成肺癌噬菌體展示肽庫(見圖l)，并測定構(gòu)建的噬菌體
展示肽庫庫容量為3Xl06pfu，重組率為60%，符合篩選后期試驗要求；
2)親和篩選肺癌特異抗原肽
為了富集可以和肺癌自身抗體結(jié)合的特異展示肽，進行了正反向的5輪親和篩選 (見圖2)，取10u 1A/G的瓊脂糖珠于一 1.5ml離心管中，PBS(PH7.4)500u 1洗2次，1 %BSA4 。C封閉1 h。瓊脂糖珠分別與15 u 1肺癌患者及對照患者 的血漿4。C孵育過夜。PBS 500u l洗滌3次后，用10" 1PBS溶解富集到的 抗體。10管肺癌的抗體及10管非肺癌的抗體各自合并成一管。取噬菌體庫擴增 液20u 1 ，先與20u 1的非肺癌抗體孵育l h，未結(jié)合的上清再與20u l肺癌 抗體結(jié)合，保留結(jié)合到瓊脂糖珠上的噬菌體，并 1 %SDS洗脫，將其轉(zhuǎn)染細菌至擴增，此為一輪篩選，如此反復5輪；
3)血清學篩選肺癌早期檢測分子標志
①混合血樣初篩
篩選后的肽庫用LB液體培養(yǎng)基1:10S稀釋后，取100yl噬菌體液、250ul新 搖好的BLT5403細菌，3ml保溫55"C的頂層瓊脂，混勻后立刻倒入鋪有LB的平皿 中，冷卻后，37'C溫箱孵育4小時。可見有單個的噬菌體形成。每1個1.5ml離心 管中，加入新?lián)u好的細菌BLT5403 1ml,用消毒的牙簽隨機挑取1個單個的、邊 界清晰的噬菌體于1個1.5ml離心管中，并按順序編號。挑好的噬菌體置37'C恒溫 振蕩器搖4小時以上，直至每一管液體均變澄清為止。共隨機挑選噬菌體5000個， 挑選好的噬菌體置4'C保存。用T7引物進行PCR反應，擴增所挑選噬菌體的插入 片段，挑取擴增片段200bp以上的噬菌體進行ELISA實驗進一步篩選(見圖3)，
將T7tailerfiber抗體(NOVAGEN)，用PBS (PH7.4)按1: 1000來稀釋，取 100lU包被于96孔酶標板，4'C搖床輕搖過夜。用洗滌液(上海科華生物技術(shù)公 司)洗板，每孔150"1，洗四次，每次約1分鐘，拍干。200ul2%BSA/PBS室 溫(24°C)封閉2小時。)洗板同前，加入用1。/。BSA1: 5稀釋的噬菌體100nl， 每個標本加4孔。每次試驗均加入沒有插入片段的50號空噬菌體作為陰性對照4 孔和空白對照2孔。室溫孵育2小時。棄去孔內(nèi)液體，拍干。每個噬菌體標本加 入100M1。/。BSA1: 500稀釋的肺癌組混合血漿、對照組混合血漿各2孔。所用 肺癌組、對照組的混合血漿的患者信息同親和篩選所用的患者。例如:某待測的 噬菌體包被六孔，其中兩孔加肺癌患者混合血清，兩孔加對照混合血清，兩孔不 加任何血清作空白對照。同時包被空噬菌體四孔，每兩孔分別加肺癌患者混合血 清和對照混合血清，作前面四孔相應的陰性對照。室溫孵育1小時。洗板后每孔 加入1: 10000稀釋的HRP (辣根過氧化物酶)耦聯(lián)的山羊抗人IgG，室溫孵育1 小時，洗板后每孔加入溫度至室溫的顯色劑A和顯色劑B (上?？迫A生物技術(shù)公 司)各1滴，混勻后，37t:孵育20分鐘，加入終止液25ul，
立刻用酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白對照調(diào)零，然后讀取各孔的 OD值，并記錄結(jié)果。每次進行ELISA按下列公式計算并判斷結(jié)果用空白孔調(diào) 零后，樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值》2. 0，判斷為陽性結(jié)果； 樣品OD值/陰性對照平均OD值，比值<2. 0，判斷為陰性結(jié)果。找出與肺癌混 合血清反應為陽性，而與對照混合血清反應為陰性的噬菌體，作為可能有篩選意義的克隆進行后續(xù)研究，共篩選出22個有意義克隆，其PCR產(chǎn)物經(jīng)天根公司進 行測序，得到了其核酸序列，其中有相同序列，共13個不同克隆，將其13個序 列與NCBI庫進行比對。
這些噬菌體克隆表面所展示的抗原具有診斷肺癌的潛能，后將應用其對肺癌 病人和對照血清進行ELISA試驗篩選，以確定其在臨床中檢測早期肺癌的可行性。
②獨立血樣篩選
將初篩后的有意義噬菌體應用30例肺癌病人血清單獨進行ELISA,方法同 前，不同在于篩選所有的血清為獨立的，而不是混合血清。實驗方法為，包被某 待測噬菌體四孔，兩孔加入某例肺癌病人的血清，兩孔不加血清作空白對照，另 包被空噬菌體兩孔，同樣加前肺癌病人血清作陰性對照，其他實驗方法同上。用 空白孔調(diào)零后，樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值》2. 0，判斷為陽 性；統(tǒng)計這13個噬菌體將肺癌患者血清正確判斷為陽性的能力，見下表。
表一 噬菌體篩選陽性率匯總表
噬菌體編號陽性率
42/10799
7216
9117
9616
151/365/37812
25216
286/30620
28912
290/354/379/206517
310/318/36913
3228
33613
35714
從中挑選出7個陽性率偏高的噬菌體72、 91、 96、 252、 286/306、 290/354/379/2065、 357來進行血清學驗證。
③血清學驗證
將這七個噬菌體分別與49例肺癌患者血清和35例對照血清進行反應，方法 同獨立樣本篩選。根據(jù)得出的樣品孔OD值/對應的陰性對照OD值的比值，繪制 ROC曲線。由于357號噬菌體ROC曲線圖中，曲線下面積較小，為0.690篩選效果不佳，將其舍去。為使得整個試劑盒具有較高的敏感度和特異度，在確定單個
克隆恰當?shù)腃Ut-off值時保證特異度高于80。/。，而適當放低敏感度，再通過不同克
隆并聯(lián)檢測，提高敏感度。確定的cut-off值見下表，其ROC曲線(見圖4 -圖9 )。 表二檢測用噬菌體cut-off值匯總表
噬菌體編號
名稱
cut—off
ROC曲線下面積
72 91 96 252 286/306 290/354/379/2065
SMMU-EPI
I
SMMU-EPI
II
SMMU-EPI
III
SMMU-EPI
IV
SMMU-EPI
V
SMMU-EPI
VI
1.4 1.53 1.43 1.76 1.56
1.4
0.806 0.799 0.793 0,726 0.85 0.746
二、制備試劑盒
應用篩選出的帶有肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I )、肺癌抗原肽II (SMMU-EPI II )、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)、肺癌抗原肽IV (SMMU-EPIIV)、 肺癌抗原肽V (SMMU-EPI V )和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)的六個重組噬菌體 液各100-200iU (滴度為108—1015pfu/L,用0.5。/。-2。/。BSA按1:2—1: 8稀釋)，2
°C-6'C搖床2h-4h,等量分別包被到固相載體上不同的酶標孔中。 所述固相載體為96孔聚苯乙烯酶標板。
所述肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I )、肺癌抗原肽II(SMMU-EPI 11)、肺癌 抗原肽III(SMMU-EPim)、肺癌抗原肽IV (SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V (SMMU-EPI V)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)這六個重組噬菌體根據(jù)其cut-off
值來并聯(lián)檢測,只要一種一個噬菌體判斷為陽性，則該結(jié)果為陽性。從而判斷49例
肺癌患者血清和35例對照血清結(jié)果匯總?cè)缦?br> ELISA檢測結(jié)果匯總表 ELISA
_ 陽性陰'〖￥— 合計
肺癌 ^ ^~
對照 7 28 35合計49 35 84
由此計算該ELISA檢測方法的敏感度為85.7。/。、特異度為80%、正確率為 83.3。/。,Kappa指數(shù)為65.7。/。，這6個噬菌體克隆并聯(lián)檢測肺癌患者血清為早期肺癌
患者提供了有效的檢測手段。


圖1 :肺癌噬菌體展示肽庫原始庫。
圖2 :親和篩選的原理。 圖3 :隨機挑選噬菌斑PCR擴增。 圖4 :SMMU-EPI I噬菌體ROC曲線圖。 圖5: SMMU-EPIII噬菌體ROC曲線圖。 圖6: SMMU-EPIin噬菌體ROC曲線圖。 圖7: SMMU-EPIIV噬菌體ROC曲線圖。 圖8: SMMU-EPIV噬菌體ROC曲線圖。 圖9 : SMMU-EPIVI噬菌體ROC曲線圖。
具體實施例方式
試劑盒的組成 實施例1
將T7 tail fiber抗體，按1: 1000稀釋度，每孔用100ulPBS (PH7.4)包被 于96孔酶標板，4'C搖床輕搖過夜。每孔150iU洗液，洗四次，每次約1分 鐘，拍干。2%BSA/PBS 200ul室溫(24°C)封閉2小時。) 每孔加150ul洗液，洗四次，每次約1分鐘，拍干。共設置12孑L，每兩孔 重復，設置為副孔，第一孔和第二孔加入1%BSA 1: 5稀釋的肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I ) 100ul、第三孔和第四孔加入1%BSA 1: 5稀釋的肺癌抗 原肽II(SMMU-EPIII)100ti I、肺癌抗原肽m(SMMU-EPIin)、肺癌抗原肽IV (SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI) 各100 ti I也同理依次加入剩下8 L，另加入沒有插入片段的50號噬菌體作為 陰性對照和空白對照各2孔，共16孔。室溫孵育2小時。棄去孔內(nèi)液體，拍 干。此時腫瘤特異抗原從而由于抗原抗體反應而成功的固定在酶標板上。實施例2
將T7tailfiber抗體，按1: 1000稀釋度，每孔用100wlPBS (PH7.4)包被 于96孔酶標板，4'C搖床輕搖過夜，每孔加150ul洗液，洗四次，每次約1 分鐘，拍干。2%BSA/PBS 200ul室溫(24'C)封閉2小時。) 每孔加150iU洗液，洗四次，每次約1分鐘，拍干。共設置12孔，每兩孔重 復，設置為副孔，第一孔和第二孔加入1%BSA1: 4稀釋的肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I ) 100pI、第三孔和第四孔加入1%BSA 1: 5稀釋的肺癌抗 原肽II(SMMU-EPIII)100iil、肺癌抗原肽III(SMMU-EPIin)、肺癌抗原肽IV (SMMU-EPIIV)、肺癌抗原肽V(SMMU-EPIV)和肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI) 各200 u I也同理依次加入剩下8孔，另加入沒有插入片段的50號噬菌體作為 陰性對照和空白對照各2孔，共16孔。室溫孵育2小時。棄去孔內(nèi)液體，拍 干。此時腫瘤特異抗原從而由于抗原抗體反應而成功的固定在酶標板上.
ELISA檢測肺癌病人 實施例3
每個噬菌體標本加入100ul1。/。BSA1: 500稀釋的肺癌病人血漿，室溫孵育1 小時。洗液洗板，每孔150Pl，洗四次，每次約1分鐘，拍干。每孔加入100 ul1: 10000稀釋的HRP耦聯(lián)的山羊抗人lgG，室溫孵育1小時。洗液洗板， 每孔150nL，洗四次，每次約1分鐘，拍千。每孔加入溫度平衡至室溫的顯 色劑A、 B各1滴，混勻后，37。C孵育20分鐘，加入終止液25"1。立刻用 酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白孔調(diào)零，然后讀取各孔的OD值，并記 錄結(jié)果。
結(jié)果判斷
每次進行ELISA按下列公式計算并判斷結(jié)果用空白孔調(diào)零后，樣品OD值 /陰性對照平均OD值，比值》cut-off值，判斷為陽性結(jié)果；樣品OD值/陰 性對照平均OD值，比值<2. 0，判斷為陰性結(jié)果。
6個噬菌體中任何一個噬菌體為陽性，則將其結(jié)果判斷為陽性。該試劑盒則將 待測血清判斷可能為肺癌早期患者血清。核苷酸及其對應氨基酸序列表
<110>第二軍醫(yī)大學
<120> —種肺癌早期特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
<160>6
<210> 1
<211> 267
<212> DNA
<213>肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I )重組T7噬菌體 <220> <221> gene <222> (6)…(262)
<223>來源于人類基因組中的HLA-B基因的CDS <■> 1
aat tea age get tga attctcctgc agggatatcc cgggagctcg tcgacaagct tggctgtcct 65 Asn Ser Ser Ala 1 4
agcagttgtg gtcatcggag ctgtggtcgc tgctgtg atg tgt agg agg aag agt 120 Met Cys Arg Arg Lys Ser 1 5
tea ggt gga aaa gga ggg age tac tct cag get gcg tgc age gac 165 Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gin Ala Ala Cys Ser Asp 10 1520
3gt gcc cag ggc tct g3t gtg tct etc aca get tg3 a33gcctg3g 211 Ser Ala Gin Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala 25 30 31
acagctgtct tgtgagggac tgag atg cag gat ttc ttc acg cct ccc etc aag ct 267 Met Gin Asp Phe Phe Thr Pro Pro Leu Lys 1 5 9
<210> 2 <211>420 <212> DNA
<213>肺癌抗原肽11 (SMMU-EPIII)重組T7噬菌體 <400> 2
3at tea age gtc cc3 get act egg gag get gag gca gga gaa tgg 45 Asn Ser Ser Val Pro Ala Thr Arg Glu Ala Glu Ala Gly Glu Trp 1 5 15
15tgt gaa cct ggg agg egg agc'ttg tag tgagccgaga tcgcsccact gsactcgsgc 102 Cys Glu Pro Gly Arg Arg Ser Leu 20 23
ctgggtgaca gagegagact ccatctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaactt ggggcccccc 162 cccaataaat tatttacccc ctggggcccc caaagggggc tgggagggta 3aaaagtacc 222 gggggggggc cgcgtttttt tttttttttt tttttagaga gggactctct ctctcacagg gggggg 288 at9 999 ggg a9a t3t 3gc get cgt etc egg gcc cc3 ctt etc tgt gcc 333 Met Gly Gly Arg Tyr Ser Ala Arg Leu Arg Ala Pro Leu Leu Cys Ala 1 5 15
ccc cct ctt tgg ggg ggg ggg aga aag ggg gtg ttt ttt ccc ccc 378 Pro Pro Leu Trp Gly Gly Gly Arg Lys Gly Val Phe Phe Pro Pro 20 25 30
ccc ccc ccc ccc caa aa3 333 c33 ca3 3ca caa ac3 gat 420 Pro Pro Pro Pro Gin Lys Lys Gin Gin Thr Gin Thr Asp 35 40 43
<210> 3 <211>342 <212> DNA
《13〉肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)重組T7噬菌體 <220>
<221> rRNA <222> (6)…(337)
<223>來源于核糖體RNA的28S <400> 3
aat tea age get tga 3ttc33gcct ctcgcag3cc cg3cgc3ccc ccgcc3cgc3 55 Asn Ser Ser Ala 1 4
gttttatccg gtaaagcga atg att aga ggt ctt ggg gcc gaa acg ate tea 107 Met lie Arg Gly Leu Gly Ala Glu Thr lie Ser 1 5 10
acc tat tct caa act tta aat ggg taa gaagcccggc tcgctggcgt ggagccgggc 164 Thr Tyr Ser Gin Thr Leu Asn Gly 15 18
gtgga atg cga gtg cct agt ggg cca c廿ttg gta age aga act ggc get gcg 217 Met Arg Val Pro Ser Gly Pro Leu Leu Val Ser Arg Thr Gly Ala Ala 15 15
gga tga accgaacgcc gggttaaggc geccg 248Gly 16
atg ccg acg etc ate aga ccc csg asa agg tgt tgg ttg 3t3 tag acagcaggac 303 Met Pro Thr Lu lie Arg Pro Gin Lys Arg Cys Trp Leu lie 1 5 10 13
ggtggcc atg gaa gtc gga ate cgc taa ggagtgaagc t 342 MetGlu Val Gly lie Arg 1 5
<210>4 <211> 54 <212> DNA
〈13〉肺癌抗原肽IV (SMMU-EPIIV)重組T7噬菌體 <220> <221> gene <222> (6)…(49)
<223>來源于人類基因組中的WDR66基因 <400> 4
Aat tea age get tga attctcctgc agggatatcc cgggagctcg tcgacaagc 54 Asn Ser Ser Ala 1 4
<210> 5 <211> 79 <212> DNA
〈13〉肺癌抗原肽V(SMMU-EPI V)重組T7噬菌體 <400> 5
aat tea age get tga attcaagcaa ggactgagct tagatatctg g 46 Asn Ser Ser Ala 1 4
atg ctg atg aaa gac age ttg ttt aac caa get 79 Met Leu Met Lys Asp Ser Leu Phe Asn Gin Ala 1 5 10
<210> 6 <211>266 <212> DNA
17《213^市癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)重組T7噬菌體 <220> <221> gene <222> (6)…(261)
<223>來源于人類基因組中的OLFM1基因 <400> 6
aat tea age etc aat cca tag aggtcttgga caggcggacc cagagagact tgcagtacgt 61
Asn Ser Ser Leu Asn Pro 1 56
ggagaag atg gaa gag aca tgt tct gca cct tct cca gta get gcc tea get gtt 116 Met Glu Glu Thr Cys SerAla Pro Ser Pro Val Ala Ala SerAla Val 1 5 15
ttg tgc ggg cat ccc gtg aac aca tgg tct get gtg ggg cga cca 161 Leu Cys Gly His Pro Val Asn Thr Trp SerAla Val Gly Arg Pro 20 25 30
ctg tgc aga tac acc tgc cct cgc tgt cct ggg cag age tgt aca 206 Leu Cys Arg Tyr Thr Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gin Ser Cys Thr 35 40 45
cct gcc age tct cct cag ggt tgg tgg gc3 gca cgc egg tgc tgc 251 Pro Ala Ser Ser Pro Gin Gly Trp Trp Ala Ala Arg Arg Cys Cys 50 55 60
ggt cgc 3ac aaa get 266 Gly Arg Asn Lys Ala 65純氨基酸序列表
<110>第二軍醫(yī)大學
<120> —種肺癌早期特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒
<160> 12
<210> 1
<211>4
<212> PRT
<213>肺癌抗原肽1 (SMMU-EPII)、肺癌抗原肽III (SMMU-EPIIII)和肺癌 抗原肽IV (SMMU-EPIIV)重組T7噬菌體人工序列
<220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列羧基端 <400> 1
Asn Ser Ser Ala 1 4
<210> 2 <211> 32 <212> PRT
<213>肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I )重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列氨基端 <400> 2
Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gin 1 5 15
Ala Ala Cys Ser Asp Ser Ala Gin Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala 20 25 30 31
<210> 3 <211>10 <212> PRT
<213>肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I )重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列氨基端 <400> 3
Met Gin Asp Phe Phe Thr Pro Pro Leu Lys 159
19<210>4 <211> 23 <212> PRT
<213>肺癌抗原肽II (SMMU-EPI II )重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列羧基端 <■> 4
Asn Ser Ser Val Pro Ala Thr Arg Glu Ala Glu Ala Gly Glu Trp Cys
1 5 15
Glu Pro Gly Arg Arg Ser Leu 20 23
<210> 5 <211>44 <212> PRT
<213>肺癌抗原肽11 (SMMU-EPIII)重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列氨基端 <400> 5
Met Gly Gly Arg Tyr Ser Ala Arg Leu Arg Ala Pro Leu Leu Cys Ala 1 5 15
Pro Pro Leu Trp Gly Gly Gly Arg Lys Gly Val Phe Phe Pro Pro Pro 20 25 30
Pro Pro Pro Gin Lys Lys Gin Gin Thr Gin Thr Asp 35 40 43
<210> 6 <2"> 19 <212> PRT
《13^市癌抗原肽m(SMMU-EPIIII)重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列 <400> 6
Met lie Arg Gly Leu Gly Ala Glu Thr lie Ser Thr Tyr Ser Gin Thr 1 5 10 15 Leu Asn Gly 18<210> 7 <211> 17 <212> PRT
〈0肺癌抗原肽III(SMMU-EPIIII)重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列 <400> 7
Met Arg Val Pro Ser Gly Pro Leu Leu Val Ser Arg Thr Gly Ala Ala
1 5 15
Gly
16
<210> 8 <211> 14 <212> PRT
〈213〉肺癌抗原肽in(SMMU-EPIIII)重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列 <400> 8
Met Pro Thr Lu lie Arg Pro Gin Lys Arg Cys Trp Leu lie 1 5 10 13
<210> 9 <211>6 <212> PRT
〈13"市癌抗原肽III(SMMU-EPini)重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列氨基端 <400> 9
Met GluVal Gly lie Arg 1 5
<210> 10 <211> 11 <212> PRT
〈13^市癌抗原肽V(SMMU-EPI V)重組T7噬菌體人工序列
21<220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列氨基端 <400> 10
Met Leu Met Lys Asp Ser Leu Phe Asn Gin Ala 1 5 10
<210> 11 <211>6 <212> PRT
〈13〉肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列羧基端 <400> 11
Asn Ser Ser Leu Asn Pro 1 56
<210> 12 <211>66 <212> PRT
〈O肺癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)重組T7噬菌體人工序列 <220>
<223>根據(jù)載體的開放性讀碼框，而讀出來的多肽序列氨基端 <400> 12
Met Glu Glu Thr Cys Ser Ala Pro Ser Pro Val Ala Ala Ser Ala Val 1 5 15
Leu Cys Gly His Pro Val Asn Thr Trp Ser Ala Val Gly Arg Pro Leu 20 25 30
Cys Arg Tyr Thr Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gin Ser Cys Thr Pro Ala 35 40 45
Ser Ser Pro Gin Gly Trp Trp Ala Ala Arg Arg Cys Cys Gly Arg Asn 50 55 60 Lys Ala
權(quán)利要求
1、一種肺癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由固相載體和含有重組肺癌特異性抗原肽肺癌抗原肽I、肺癌抗原肽II、肺癌抗原肽III、肺癌抗原肽IV、肺癌抗原肽V和肺癌抗原肽VI的六個重組噬菌體液各100-200μl，滴度為108--1015pfu/L，用0.5％-2％BSA按1∶2--1∶8稀釋，2℃--6℃搖床2h-4h，等量分別包被到固相載體上不同的酶標孔中所組成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征在于所述肺癌抗原肽I 、肺癌抗原肽 II、肺癌抗原肽III、肺癌抗原肽IV、肺癌抗原肽V和肺癌抗原肽VI的核苷酸序列 及其氨基酸序列分別為以下1、 2、 3、 4、 5、 6個序列<210> 1 <211> 267 <212> DNA<213>肺癌抗原肽I (SMMU-EPI I )重組T7噬菌體 <220> <221> gene <222> (6)…(262)<223>來源于人類基因組中的HLA-B基因的CDS <400> 1aat tea age get tga attctcctgc agggat3tcc cgggagctcg tcgacaagct tggctgtcct 65AsnSerSerAla agcagttgtg gtcateggag卿ggtcgc tgctgtg atg tgt agg 3gg aag 3gt 120 Met Cys Arg Arg Lys Ser 1 5tea ggt gga aaa gga ggg age tac tct cag get gcg tgc 3gc gac 165 Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gin Ala Ala Cys Ser Asp 10 15 20agt gec cag ggc tct gat gtg tct etc aca get tga aaagectgag 211 Ser Ala Gin Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala 25 30 31acagctgtct tgtgagggac tgag atg cag gat ttc ttc acg cct ccc etc aag ct 267 Met Gin Asp Phe Phe Thr Pro Pro Leu Lys 1 5 9<210>2 <211>420 <212> DNA《13〉肺癌抗原肽n(SMMU-EPIII)重組T7噬菌體 <400> 2aat tea age gtc cca get act egg gag get gag gca gga gaa tgg 45 Asn Ser Ser Val Pro Ala Thr Arg Glu Ala Glu Ala Gly Glu Trp 1 5 15tgt gaa cct ggg agg egg 3gc ttg tag tg3gccgag3 tcgcaccact gaactcgagc 102 Cys Glu Pro Gly Arg Arg Ser Leu 20 23Ctgggtg3C3 g3gcg3g3Ct CCatctC333 33S3333333 3333333Ctt ggggCCCCCC 162cccaataaat tatttacccc ctggggcccc caaagggggc tgggagggta aaaaagtacc 222 gggggggggc cgcgtt他tttttttttt tttttagaga gggactctct ctctcacagg gggggg 288atg ggg ggg 3g3 tat age get cgt etc egg gcc cca ctt etc tgt gcc 333Met Gly Gly Arg Tyr Ser Ala Arg Leu Arg Ala Pro Leu Leu Cys Ala ccc cct ctt tgg ggg ggg ggg aga aag ggg gtg ttt ttt ccc ccc 378 Pro Pro Leu Trp Gly Gly Gly Arg Lys Gly Val Phe Phe Pro Pro 20 25 30ccc ccc ccc ccc ca3 a33 333 c33 ca3 3ca caa 3c3 g3t 420 Pro Pro Pro Pro Gin Lys Lys Gin Gin Thr Gin Thr Asp 35 40 43<210> 3 <211> 342 <212> DNA《13〉肺癌抗原肽m(SMMU-EPIIII)重組T7噬菌體 <220><221> rRNA <222> (6)…(337)<223>來源于核糖體RNA的28S <400> 3aat tea 3gc get tg3 attcaagcct ctcgcag3cc cg3cgc3ccc ccgcc3cgc3 55 Asn Ser Ser Ala gttttatccg gtaaagcga atg att 3g3 ggt ctt ggg gcc gaa acg atc tea 107Met lie Arg Gly Leu GlyAla Glu Thr lie Ser 1 5 10acc tat tct caa act tta aat ggg taa gaagcccggc tcgctggcgt ggagccgggc 164 Thr Tyr Ser Gin Thr Leu Asn Gly gtgga atg cga gtg cct agt ggg cca ctt ttg gta age aga act ggc get gcg 217 MetArg Val Pro Ser Gly Pro Leu Leu Val Ser Arg Thr GlyAla Ala 1 5 15gga tga accgaacgcc gggttaaggc geccg 248 Gly stg ccg acg etc 3tc 3g3 ccc c3g aaa sgg tgt tgg ttg 3t3 t3g 3c3gc3gg3c 303 Met Pro Thr Lu lie Arg Pro Gin Lys Arg Cys Trp Leu lie 1 5 10 13ggtggcc atg gaa gtc gga ate cgc taa ggagtgaagc t 342 Met Glu Val Gly lie Arg 1 5<210>4 <211> 54 <212> DNA<213>肺癌抗原肽1￥ (SMMU-EPIIV)重組T7噬菌體 <220> <221> gene <222> (6)…(49)<223>來源于人類基因組中的WDR66基因 <400> 4Aat tc3 3gc get tg3 3ttctcctgc 3ggg3t3tcc cggg3gctcg tcg3C33gc 54 Asn Ser Ser Ala 1 4<210> 5 <211> 79 <212> DNA<213>肺癌抗原肽V(SMMU-EPI V)重組T7噬菌體 <400> 5aat tea age get tga attcaagcaa ggactgagct tagatatctg g 46Asn Ser Ser Ala 1 43tg ctg atg 333 g3c 3gc ttg ttt aac ca3 get 79 Met Leu Met Lys Asp Ser Leu Phe Asn Gin Ala 1 5 10<210> 6 <211> 266 <212> DNA〈213^市癌抗原肽VI(SMMU-EPIVI)重組T7噬菌體 <220> <221> gene <222> (6)...(261)<223>來源于人類基因組中的OLFM1基因 <400> 6aat tea age etc aat cca tag aggtcttgga caggcggacc cagagagact tgcagtacgt 61Asn Ser Ser Leu Asn Pro 1 56ggagaag atg gaa gag aca tgt tct gca cct tct cca gta get gcc tea get gtt 116 Met Glu Glu Thr Cys Ser Ala Pro Ser Pro Val Ala Ala Ser Ala Val 1 5 15ttg tgc ggg cat ccc gtg aac aca tgg tct get gtg ggg cga cca 161 Leu Cys Gly His Pro Val Asn Thr Trp Ser Ala Val Gly Arg Pro 20 25 30ctg tgc aga tac acc tgc cct cgc tgt cct ggg cag age tgt aca 206 Leu Cys Arg Tyr Thr Cys Pro Arg Cys Pro Gly Gin Ser Cys Thr 35 40 45cct gcc 3gc tct cct cag ggt tgg tgg gca ges cgc egg tgc tgc 251 Pro Ala Ser Ser Pro Gin Gly Trp Trp Ala Ala Arg Arg Cys Cys 50 55 60ggt cgc aac aaa get 266 Gly Arg Asn Lys Ala 65
3、 一種如權(quán)利要求1所述肺癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于該方法包括下列歩驟 一、 制備重組肺癌特異抗原肽 1)構(gòu)建肺癌噬菌體展示肽庫抽提30例新鮮肺癌組織總RNA ,等量混合成1mg后抽提mRN A ,應用隨機引物反轉(zhuǎn)錄為cDN A，將cDN A末端進行平齊，加Eco I I /Hin d III接頭，用Eco 11和Hin d m兩種限制性內(nèi)切酶依次進行酶切反應后,去除小片斷后接入T7噬 菌體雙臂，進行體外包裝，從而構(gòu)建成肺癌噬菌體展示肽庫，并測定構(gòu)建的噬菌 體展示肽庫庫容量為3X106pfu ，重組率為60%，符合篩選后期試驗要求；2) 親和篩選肺癌特異抗原肽為了富集可以和肺癌自身抗體結(jié)合的特異展示肽，進行了正反向的5輪親和篩 選，取10u 1A/G的瓊脂糖珠于一 1.5ml離心管中，PBS PH7.4500p l洗2 次，1%BSA 4'C封閉lh，瓊脂糖珠分別與15ii 1肺癌患者及對照患者的血漿 《C孵育過夜；PBS 500 y 1洗滌3次后，用10y 1 P BS溶解富集到的抗體， 10管肺癌的抗體及10管非肺癌的抗體各自合并成一管，取噬菌體庫擴增液20 y 1 ，先與20y 1的非肺癌抗體孵育lh，未結(jié)合的上清再與20u l肺癌抗體結(jié) 合，保留結(jié)合到瓊脂糖珠上的噬菌體，并100" 1 %SDS洗脫,將其轉(zhuǎn)染細菌至 擴增，此為一輪篩選，如此反復5輪；3) 血清學篩選肺癌早期檢測分子標志 1)混合血樣初篩篩選后的肽庫用LB液體培養(yǎng)基1:10S稀釋后，取100u 1噬菌體液、250u 1 新?lián)u好的BLT5403細菌，3ml保溫55'C的頂層瓊脂，混勻后立刻倒入鋪有LB的 平皿中，冷卻后，37"C溫箱孵育4小時，有單個的噬菌體形成，每1個1.5ml離心 管中，加入新?lián)u好的細菌BLT5403 1ml，用消毒的牙簽隨機挑取1個單個的、邊 界清晰的噬菌體于1個1.5ml離心管中，并按順序編號，挑好的噬菌體置37'C恒溫 振蕩器搖4小時-12h，直至每一管液體均變澄清為止；共隨機挑選噬菌體5000個， 挑選好的噬菌體置4'C保存；用T7引物進行PCR反應，擴增所挑選噬菌體的插 入片段，挑取擴增片段200BP以上的噬菌體進行ELISA實驗進一步篩選；將T7tailer fiber抗體(NOV AGE N)，用PBS PH7.4按1: 1000來稀釋， 取100tM包被于96孔酶標板，4"C搖床輕搖過夜，用洗液洗板，每孔150ul，洗 四次，每次1分鐘，拍干，200ul2。/c)BSA/PBS室溫24°C封閉2小時；洗板同 前，加入用1。/。BSA1: 5稀釋的噬菌體100ul，每個標本加4孔，每次試驗均加入 沒有插入片段的50號空噬菌體作為陰性對照4孔和空白對照2孔，室溫孵育2小時；棄去孔內(nèi)液體，拍干；每個噬菌體標本加入100ul1。/。BSA 1: 500稀釋的肺癌組混合血漿、對照組混合血漿各2孔；同時包被空噬菌體四孔，每兩孔分別加肺癌患者混合血清和對照混合血清，作前面四孔相應的陰性對照，室溫孵育1小時；洗板后每孔加入1: 10000稀釋的HRP耦聯(lián)的山羊抗人IgG ，室溫孵育1小時， 洗板后每孔加入溫度平衡至室溫的顯色劑A、 B各1滴，混勻后，37'C孵育20分鐘，加入終止液25ul，立刻用酶標儀檢測，取波長450nm，先用空白對照調(diào)零，然后讀取各孔的 OD值，并記錄結(jié)果，每次進行ELISA按下列公式計算并判斷結(jié)果用空白孔調(diào) 零后，樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值》2. 0，判斷為陽性結(jié)果； 樣品OD值/陰性對照平均OD值，比值<2. 0，判斷為陰性結(jié)果，找出與肺癌混 合血清反應為陽性.；2)獨立血樣篩選將初篩后的有意義噬菌體應用30例肺癌病人血清單獨進行ELISA,方法同步 驟1),不同在于篩選所有的血清為獨立的，而不是混合血清；實驗方法為，包被 某待測噬菌體四孔，兩孔加入某例肺癌病人的血清，兩孔不加血清作空白對照， 另包被空噬菌體兩孔，同樣加步驟1)肺癌病人血清作陰性對照，其他實驗方法 同步驟1);用空白孔調(diào)零后，樣品平均OD值/陰性對照平均OD值，比值》2. 0， 判斷為陽性；二、制備試劑盒應用篩選出的帶有肺癌抗原肽I 、肺癌抗原肽II、肺癌抗原肽III、肺癌抗原肽IV、肺癌抗原肽V和肺癌抗原肽VI的六個重組噬菌體液各100-200iU，滴度為 108—1015pfu/L，用0.5。/o-2。/oBSA按1:2—1: 8稀釋，2'C—6。C搖床2h4h，等量分別包被到固相載體上不同的酶標孔中，制備試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種肺癌特異性自身抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。由固相載體和包被在其表面的含有肺癌抗原肽I、肺癌抗原肽II、肺癌抗原肽III、肺癌抗原肽IV、肺癌抗原肽V和肺癌抗原肽VI的六個重組噬菌體液各100-200μl，等量分別包被到固相載體上不同的酶標孔中所組成。所述重組肺癌特異抗原肽是利用T7噬菌體將肺癌cDNA文庫展示到噬菌體表面，并經(jīng)親和篩選和血清學分析從中篩選出的，它具有檢測肺癌病人血清中由于腫瘤刺激所產(chǎn)生的自身抗體的能力，為早期肺癌患者提供了有效的檢測手段，有較大的臨床應用價值。
文檔編號G01N33/574GK101625360SQ20091004717
公開日2010年1月13日 申請日期2009年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月6日
發(fā)明者吳玲玲, 常文軍, 曹廣文, 趙晉豐 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學