膠體金層析法檢測(cè)雌酮硫酸鈉的試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，是一種膠體金層析法檢測(cè)雌酮硫酸鈉的試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道雌激素替代療法范圍越來(lái)越廣泛。由于生理和病理原因引起的雌激素分泌不足而導(dǎo)致的各種患者呈不斷增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。目前獲取制備雌激素類藥物原料的一個(gè)主要方向是從孕馬尿中提取天然雌激素。市場(chǎng)需求量的激增，使從孕馬尿中提取雌激素的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大。對(duì)孕馬尿含量的常規(guī)檢測(cè)分析主要是利用氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)等儀器在試驗(yàn)室操作，方法繁瑣、分析速度慢、成本高，要求儀器化程度高等；隨著待檢樣品、特別是要求現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的分析手段難以適應(yīng)要求，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)和應(yīng)用高效率孕馬尿中雌激素分析技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種膠體金層析法檢測(cè)雌酮硫酸鈉的試紙條，克服了上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，其能有效解決孕馬尿含量的常規(guī)檢測(cè)方法繁瑣、分析速度慢、成本高和儀器化程度高，已不能適應(yīng)現(xiàn)有技術(shù)要求的問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過(guò)以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種膠體金層析法檢測(cè)雌酮硫酸鈉的試紙條，包括底板、樣品吸收墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙；在底板的中部頂端固定連接有硝酸纖維素膜，在硝酸纖維素膜的中部沿徑向分別劃有相平行的檢測(cè)線和質(zhì)控線，在硝酸纖維素膜的左部上端固定連接有金標(biāo)抗體結(jié)合墊，在金標(biāo)抗體結(jié)合墊的左部上端固定連接有樣品吸收墊，在硝酸纖維素膜的右部上端固定連接有吸水濾紙。
[0005]下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之一的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn):
上述檢測(cè)線按下述方法得到:第一步，精密稱取6.6mg雌酮硫酸鈉-17-廂置反應(yīng)瓶中，在反應(yīng)瓶中加入ImlN, N-二甲基亞酰胺溶解在雌酮硫酸鈉-17-廂中，溶解后加入2.0ml二氧六環(huán)混勻，在溫度為4°C下放置30min，后加入23.2 μ I三正丁胺并攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)后加入17.4 μ I氯甲酸已丁酯混勻后得到活化溶液(A);第二步，精密稱取98.5mg牛血清白蛋白，在牛血清白蛋白中依次加入5ml濃度為0.0lmol -L-1、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液和2ml二氧六環(huán)并均勻，在溫度為4°C下放置30min后得到溶液(B);第三步，將活化溶液(A)加入溶液(B)中并攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值為8.0至9，在溫度為4°C下繼續(xù)攪拌反應(yīng)18h，反應(yīng)完成后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移入透析袋，置于溫度為4°C下、濃度為0.05 mol *L-1、pH為7.4的碳酸鹽緩沖液中透析1h至24h，透析后得到結(jié)合比為1:24的人工抗原；第四步，將人工抗原和弗氏完全佐劑等體積乳化后得到初次免疫劑，人工抗原和弗氏不完全佐劑等體積乳化后得到加強(qiáng)免疫劑，選擇體重為1.8kg至2.1kg的新西蘭白雄兔，對(duì)新西蘭白雄兔采用背部皮下多點(diǎn)注射法進(jìn)行一次初次免疫和三次加強(qiáng)免疫，初次免疫用初次免疫劑，初次免疫劑的劑量為0.8mg/只兔，初次免疫后再進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫用加強(qiáng)免疫劑，加強(qiáng)免疫劑的劑量為0.40mg/只兔,每次免疫時(shí)間間隔為I周至2周,最后一次免疫完成10天后對(duì)新西蘭白雄兔采血收集血清，用ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)，待抗血清的效價(jià)達(dá)到1:20000后，采取兔心臟采血法獲取全血，全血析出血清后,在血清過(guò)蛋白A親和層析柱純化后，力口入體積百分比為0.01%的硫柳汞水溶液Iml至3ml混勻后得到抗雌酮硫酸鈉特異性抗體；第五步，通過(guò)微量進(jìn)樣器在硝酸纖維素膜上用抗雌酮硫酸鈉特異性抗體劃線包被得到檢測(cè)線。
[0006]上述檢測(cè)線的寬度為Imm至1.5mm,檢測(cè)線的點(diǎn)樣量按0.5cm寬的試紙條上點(diǎn)樣
1.5ul。
[0007]上述質(zhì)控線按下述方法得到:通過(guò)微量進(jìn)樣器在硝酸纖維素膜上用濃度為
1.0mg/ml的羊抗兔IgG劃線包被得到質(zhì)控線。
[0008]上述將劃有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜用封閉液在37°C下浸泡封閉30分鐘后自然風(fēng)干；其中:封閉液包括磷酸鹽緩沖液、牛血清白蛋白和Tween20，磷酸鹽緩沖液為濃度為0.0lmol *L-1、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，牛血清白蛋白在封閉液中的質(zhì)量百分比為1%，Tween20在封閉液中的質(zhì)量百分比為0.1%。
[0009]上述金標(biāo)抗體結(jié)合墊按下述方法得到:第一步，把氯金酸加入超純水中配成質(zhì)量百分比濃度為0.01%的氯金酸水溶液，將氯金酸水溶液煮沸后每10ml加入質(zhì)量百分比為1%的檸橡酸三鈉水溶液3ml，繼續(xù)煮沸2min，待冷卻至室溫后用濃度為0.1mol.L-1的K2C03調(diào)至PH為8.2后得到膠體金溶液；第二步，在10ml膠體金溶液中加入600 μ g抗雌酮硫酸鈉特異性抗體攪拌1min后得到第一混合液，攪拌后在溫度為4°C下靜置45min，然后加入牛血清白蛋白攪拌1min后得到第二混合液，牛血清白蛋白在第二混合液中的體積百分比濃度為1%，將第二混合液12000rpm離心5min，吸去上清后所得沉淀即為膠體金標(biāo)記抗雌酮硫酸鈉特異性抗體；第三步，按每4mg的膠體金標(biāo)記抗雌酮硫酸鈉特異性抗體中加入Iml的蒸餾水進(jìn)行稀釋，稀釋后按30μ l/cm2的量均勻噴涂于玻璃纖維素膜上，在溫度為-20°C下、真空度為200Pa下冷凍真空干燥后得到金標(biāo)抗體結(jié)合墊。
[0010]上述硝酸纖維素膜上的抗雌酮硫酸鈉特異性抗體的物質(zhì)的量和金標(biāo)抗體結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記抗雌酮硫酸鈉特異性抗體的物質(zhì)的量相等。
[0011]本發(fā)明結(jié)構(gòu)合理而緊湊，使用方便，通過(guò)底板、樣品吸收墊、金標(biāo)抗體結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙的配合使用，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)孕馬尿的目的，具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、結(jié)果直觀、攜帶方便的特點(diǎn)，不需要專門(mén)的測(cè)試輔助設(shè)備，縮短了測(cè)試時(shí)間，提高了測(cè)試效率，適用于獸醫(yī)院和養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)馬妊娠的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0012]附圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的主視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0013]附圖2為附圖1的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0014]附圖中的編碼分別為:I為底板，2為樣品吸收墊,3為金標(biāo)抗體結(jié)合墊,4為硝酸纖維素膜，5為吸水濾紙，6為檢測(cè)線，7為質(zhì)控線。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來(lái)確定具體的實(shí)施方式。
[0016]在本發(fā)明中，為了便于描述，各部件的相對(duì)位置關(guān)系的描述均是根據(jù)說(shuō)明書(shū)附圖1的布圖方式來(lái)進(jìn)行描述的，如:前、后、上、下、左、右等的位置關(guān)系是依據(jù)說(shuō)明書(shū)附圖1的布圖方向來(lái)確定的。
[0017]實(shí)施例1，如圖1所示，該膠體金層析法檢測(cè)雌酮硫酸鈉的試紙條包括底板1、樣品吸收墊2、金標(biāo)抗體結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水濾紙5;在底板I的中部頂端固定連接有硝酸纖維素膜4，在硝酸纖維素膜4的中部沿徑向分別劃有相平行的檢測(cè)線6和質(zhì)控線7，在硝酸纖維素膜4的左部上端固定連接有金標(biāo)抗體結(jié)合墊3，在金標(biāo)抗體結(jié)合墊3的左部上端固定連接有樣品吸收墊2，在硝酸纖維素膜4的右部上端固定連接有吸水濾紙5。底板
1、樣品吸收墊2、硝酸纖維素膜4和吸水濾紙5均為現(xiàn)有公知公用的材料。
[0018]實(shí)施例2，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，檢測(cè)線6按下述方法得到:第一步，精密稱取6.6mg雌酮硫酸鈉-17-廂置反應(yīng)瓶中，在反應(yīng)瓶中加入lmlN，N-二甲基亞酰胺溶解在雌酮硫酸鈉-17-廂中，溶解后加入2.0ml二氧六環(huán)混勻，在溫度為4°C下放置30min，后加入23.2 μ I三正丁胺并攪拌反應(yīng)30min，反應(yīng)后加入17.4 μ I氯甲酸已丁酯混勻后得到活化溶液(A);第二步，精密稱取98.5mg牛血清白蛋白，在牛血清白蛋白中依次加入5ml濃度為0.0lmol.L-1、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液和2ml二氧六環(huán)并均勻，在溫度為4°C下放置30min后得到溶液(B);第三步，將活化溶液(A)加入溶液(B)中并攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值為
8.0至9，在溫度為4°C下繼續(xù)攪拌反應(yīng)18h，反應(yīng)完成后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移入透析袋，置于溫度為4°C下、濃度為0.05 mo 1-L-1、pH為7.4的碳酸鹽緩沖液中透析1h至24h，透析后得到結(jié)合比為1:24的人工抗原；第四步，將人工抗原和弗氏完全佐劑等體積乳化后得到初次免疫劑，人工抗原和弗氏不完全佐劑等體積乳化后得到加強(qiáng)免疫劑，選擇體重為1.8kg至
2.1kg的新西蘭白雄兔，對(duì)新西蘭白雄兔采用背部皮下多點(diǎn)注射法進(jìn)行一次初次免疫和三次加強(qiáng)免疫，初次免疫用初次免疫劑，初次免疫劑的劑量為0.8mg/只兔，初次免疫后再進(jìn)行三次加強(qiáng)免疫,加強(qiáng)免疫用加強(qiáng)免疫劑,加強(qiáng)免疫劑的劑量為0.40mg/只兔，每次免疫時(shí)間間隔為I周至2周，最后一次免疫完成10天后對(duì)新西蘭白雄兔采血收集血清，用ELISA法測(cè)定抗血清的效價(jià)，待抗血清的效價(jià)達(dá)到1:20000后，采取兔心臟采血法獲取全血，全血析出血清后，在血清過(guò)蛋白A親和層析柱純化后，加入體積百分比為0.01%的硫柳汞水溶液Iml至3ml混勻后得到抗雌酮硫酸鈉特異性抗體；第五步，通過(guò)微量進(jìn)樣器在硝酸纖維素膜4上用抗雌酮硫酸鈉特異性抗體劃線包被得到檢測(cè)線6。
[0019]實(shí)施例3,作為上述實(shí)施例的優(yōu)化,檢測(cè)線6的寬度為Imm至1.5mm,檢測(cè)線6的點(diǎn)樣量按0.5cm寬的試紙條上點(diǎn)樣1.5 μ I。
[0020]實(shí)施例4，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，質(zhì)控線7按下述方法得到:通過(guò)微量進(jìn)樣器在硝酸纖維素膜4上用濃度為1.0mg/ml的羊抗兔IgG劃線包被得到質(zhì)控線7。
[0021]實(shí)施例5，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，將劃有檢測(cè)線6和質(zhì)控線7的硝酸纖維素膜4用封閉液在37°C下浸泡封閉30分鐘后自然風(fēng)干；其中:封閉液包括磷酸鹽緩沖液、牛血清白蛋白和TWeen20，磷酸鹽緩沖液為濃度為0.0lmol.L-1、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，牛血清白蛋白在封閉液中的質(zhì)量百分比為1%，Tween20在封閉液中的質(zhì)量百分比為0.1%。
[0022]實(shí)施例6，作為上述實(shí)施例的優(yōu)化，金標(biāo)抗體結(jié)合墊3按下述方法得到:第一步，把氯金酸加入超純水中配成質(zhì)量百分比濃度為0.01%的氯金酸水溶液，將氯金酸水溶液煮沸后每10ml加入質(zhì)量百分比為1%的檸橡酸三鈉水溶液3ml，繼續(xù)煮沸2min，待冷卻至室溫后用濃度為0.1mol *L-1的K2C03調(diào)至PH為8.2后得