專利名稱：利用9、10-二氫化吖啶的水解酶的化學(xué)發(fā)光檢測的制作方法
本申請是于1994年3月2日提出的申請系列NO.08/205,093和1994年4月15日提出的NO.08/228,290的連續(xù)部分，其中NO.08/205,093和NO.08/228,290為1993年5月17日提出的申請系列NO.08/061,810的連續(xù)部分。
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及到一種改進(jìn)的用化學(xué)方法產(chǎn)生光(化學(xué)發(fā)光)的方法，其中通過一種酶的作用產(chǎn)生一種促進(jìn)過氧化物酶的反應(yīng)性能的物質(zhì)，而該過氧化物酶本身又催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本發(fā)明也涉及應(yīng)用這一方法來檢測第一種酶。本發(fā)明還涉及應(yīng)用這一方法來分別檢測和測量各種生物分子，包括利用免疫檢測技術(shù)的半抗原、抗原和抗體，利用Western-印跡技術(shù)的蛋白質(zhì)以及利用Sourthern和Northern-印跡技術(shù)的DNA和RNA。這一方法也被用來在DNA測序應(yīng)用中檢測DAN。這一方法還可被用來檢測DAN突變。
有關(guān)技術(shù)描述(a)10-甲基-(9、10)-二氫化吖啶-9-羧酸的烷基酯和芳香酯在強堿條件下在偶極非質(zhì)子傳遞溶劑中通過自氧化形成N-甲基吖啶酮而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光(F.McCapra，“美國化學(xué)研究報告”(Acc.Chem.Res.)9(6)，201-8(1976))。化學(xué)發(fā)光的量子產(chǎn)額在10-5-0.1的范圍內(nèi)，據(jù)發(fā)現(xiàn)在酚和醇的離去基團(tuán)的pKa下降時其量子產(chǎn)額會增加。由于中間介質(zhì)的競爭性的不發(fā)光的分解，在水溶液中量子產(chǎn)額會非常低。加入陽離子表面活性劑CTAB，通過阻止競爭性的黑暗反應(yīng)能增加130倍的表現(xiàn)量子產(chǎn)額。
申請人的同時待審查的申請系列1993年5月17日提出的NO.08/061,810，1994年3月2日提出的NO.08/205,093以及1994年4月15日提出的NO.08/228,290公開了用于檢測過氧化物酶和辣根過氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光的9、10-二氫化吖啶化合物。除申請人的前述的同時待審查的申請外，沒有其他任何靠利用過氧化物酶或其他酶氧化9、10-二氫化吖啶來產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的報導(dǎo)。
(b)增強酶的方案頒發(fā)給Kricka的美國專利5,306,621描述了一種用酶法從無活性前增強子(pro-enhancer)產(chǎn)生用于辣根過氧化物酶(HRP)催化的氨基苯二酰一肼的化學(xué)發(fā)光的氧化反應(yīng)的增強子的方法。沒有任何關(guān)于將9、10-二氫化吖啶用作化學(xué)發(fā)光的底物的建議。所報導(dǎo)的這一方法的相對低的靈敏度(10-16mol堿性磷酸酶)對于很多應(yīng)用都是不夠的。
已報導(dǎo)過用于堿性磷酸酶比色檢測的偶聯(lián)酶的階式反應(yīng)器(D.M.Obzansky等人“臨床化學(xué)”(Clin.Chem.)，37，1513-8(1991))。在這個方案中，堿性磷酸酶產(chǎn)生一種與第二種酶的無活性形式起反應(yīng)并將這種酶轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)的物質(zhì)。第二種酶與其自身的底物反應(yīng)產(chǎn)生H2O2。以隨后的比色方法來檢測H2O2。但關(guān)于化學(xué)發(fā)光檢測未作任何披露和建議。
曾報導(dǎo)一種化學(xué)發(fā)光的Western印跡方法，其中結(jié)合的HRP-抗體共軛物催化一種引起膜表面生物素-酚共軛物沉淀的反應(yīng)。結(jié)合的生物素用于俘獲額外的HRP-抗生蛋白鏈菌素共軛物。被俘獲的酶通過氨基苯二酰一肼的化學(xué)發(fā)光來檢測(D.A.Wigle，N.N.Radakovic，S.L.Venance，S.C.Pang“生物技術(shù)”(BioTechniques 14，562-3(1993))。對利用9、10-二氫化吖啶作為化學(xué)發(fā)光的底物未作任何披露和建議。
已經(jīng)知道有幾種涉及多酶的生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)(A.Tsuji，M.Maeda，H.Arakawa，“分析科學(xué)”(Anal.Sci.)，5，497-506(1989))。對作用方式的仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)，與本發(fā)明相比，在這些方法的大多數(shù)中，僅有一個增強階段。所有后來的階段僅僅為達(dá)到最后的發(fā)光反應(yīng)提供一個電子傳遞體系(electron relay system)。只有以利用堿性磷酸酶產(chǎn)生NADP+為基礎(chǔ)的比色方法才確實為雙重增強的方法(A.Johannsson，C.J.Stanley，C.H.Self，“臨床化學(xué)雜志”(Clin.Chim.Acta)148，119-24(1985))。已知還有一種基于同樣原理的熒光分析(D.B.Cook，C.H.Self，“臨床化學(xué)”(Clin.Chem.)，39，965-71(1993))。沒有講授或建議利用化學(xué)發(fā)光的參考資料。


圖1是利用本發(fā)明的試劑組合物檢測堿性磷酸酶(AP)的線性曲線。含有被保護(hù)的HR的增強子磷酸2-萘酯的溶液和標(biāo)量的AP保溫。在37℃下30分鐘的原初反應(yīng)階段后，加入50μl保持在室溫下的本發(fā)明的試劑。該試劑含有0.1mM 2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-(9、10)-二氫化吖啶-9-羧酸酯(2′、3′、6′-trifluorophenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylate)，1.2mM過氧化脲，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.05％吐溫20(TWEEN 20)和40pmol HRP。在15分鐘時測光強。術(shù)語S-B是指存在AP時的繼電器邏輯元件(RLU)中的化學(xué)發(fā)光信號(S)，其中(S)以無AP時背景化學(xué)發(fā)光(B)來校正。以這一方法，0.1amol(1×10-19mol)的AP都可以檢測到。
圖2是利用本發(fā)明的試劑組合物檢測β-半乳糖苷酶(β-Gal)的線性曲線。在0.005M磷酸鈉緩沖液pH7.0中含有被保護(hù)的HRP增強子p-苯基苯酚-半乳糖苷的溶液和標(biāo)量的β-Gal于室溫下保溫。在30(min)的原初反應(yīng)階段后，加入50μl保持于室溫的檢測試劑。該試劑含有0.1mM 2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基(9、10)-二氫化吖啶-9-羧酸酯，1.2mM過氧化脲，2mM EDTA，0.05％ TWEEN 20和40pmol的pH8.0的0.01M tris-緩沖液中的HRP。在15分鐘時測量光強。以這一方法，0.56amol(5.6×10-19mol)的β-Gal也是可以檢測的。
因此本發(fā)明的一個目的是提供一種利用被護(hù)增強子通過過氧化物酶作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光來檢測水解酶以及其共軛物的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用被護(hù)增強子通過過氧化物酶的作用產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光來檢測生物物質(zhì)和化合物的方法。此檢測可以采取溶液中的免疫檢定、Western-印跡技術(shù)中的蛋白質(zhì)的檢測、和Sourthern-印跡技術(shù)中或DNA測序應(yīng)用的DNA的檢測以及其他(例如突變的檢測)DNA雜交分析等形式。
本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方法。這一方法包括使一種被護(hù)增強化合物與第一種酶反應(yīng)產(chǎn)生一種增強化合物，該增強化合物促進(jìn)9、10-二氫化吖啶化合物(優(yōu)選N-烷基-(9、10)-二氫化吖啶-羧酸的衍生物)和過氧化物與過氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。在一個優(yōu)選方案中，第一種酶為一種水解酶。優(yōu)選的9、10-二氫化吖啶化合物的分子式為
其中，R選自烷基、雜烷基和芳烷基，R1-R8單獨選自于產(chǎn)生光的基團(tuán)，其中Y為一個離去基團(tuán)，它能通過9、10-二氫化吖啶與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)而產(chǎn)生光。
本發(fā)明也涉及利用此方法通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在某一檢測過程檢測被分析物，其中被分析物被連結(jié)到或者能夠直接地或間接地被連結(jié)到第一種酶上，并且其中產(chǎn)生的光的量與被分析物的量相關(guān)。例如，本方法可分別被用于通過免疫檢測技術(shù)來檢測半抗原、抗原和抗體，通過Western-印跡技術(shù)檢測蛋白質(zhì)，通過Sourthern-印跡技術(shù)和Northern-印跡技術(shù)檢測DNA和RNA。該方法還可用來在DNA測序應(yīng)用中檢測DNA。
本發(fā)明還涉及利用此方法來檢測水解酶或者水解酶和生物分子的共軛物。
本發(fā)明還涉及到通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在檢測過程中檢測被分析物的改進(jìn)方法，改進(jìn)包括提供一種在水解酶存在時產(chǎn)生光的一種試劑組合物。該試劑組合物包括一種含有一種下式N-烷基-9、10-二氫化吖啶羧酸的衍生物，
一種過氧化物化合物、一種過氧化物酶和一種可能為酚化合物的促進(jìn)過氧化物酶的反應(yīng)活性的被護(hù)增強子；一種增加光的產(chǎn)量的表面活性劑，以及一種阻止過氧化物化合物在與過氧化酶反應(yīng)之前活化N-烷基-9、10-二氫化吖啶羧酸衍生物的螯合劑的水溶液。
本發(fā)明涉及一種通過促進(jìn)或增大過氧化物酶的活性的第一酶的作用產(chǎn)生一種增強子或循環(huán)劑，該增強子或循環(huán)劑又轉(zhuǎn)而催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的方法。因此，由于二個信號增大過程，本發(fā)明可以利用此方法高靈敏度地檢測第一種酶。所得到的光的強度提供了一種直接測量被標(biāo)記的有機的或生物的分子量的方法。
本發(fā)明也考慮到了利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在檢測過程中檢測任意一種被分析物、水解酶或水解酶共軛物的試劑盒(Kit)。在任何本發(fā)明的實施方案中實施本發(fā)明的有用試劑盒在一個或更多個容器中包括
(a)如上所描述的一種9、10-二氫化吖啶化合物；(b)一種過氧化物(如果待檢測的被分析物不是該過氧化物)或一種產(chǎn)生過氧化物的試劑；(c)一種過氧化酶(如果待檢測的被分析物不是該過氧化物酶)或者一種過氧化物酶與該被分析物的共軛物、或者一種過氧化物酶與一種和被分析物形成特殊結(jié)合對(specific binding pair)的試劑的共軛物；(d)一種被護(hù)增強化合物；以及任選地(e)一種表面活性劑和一種螯合劑。試劑盒組份可以單獨或者以各種組合形式盛裝，如此在考慮實施下面詳細(xì)描述的本發(fā)明的各種方法時會一目了然。
本發(fā)明的反應(yīng)方法可以以幾種不同的方式進(jìn)行。在一種方式或?qū)嵤┓桨钢校饷冈谑覝刂林辽俅蠹s40℃的溫度下與被護(hù)增強子的水溶液單獨起反應(yīng)。該溶液可以含有有利于酶活性的藥劑如金屬離子。在合適的反應(yīng)或保溫期后，將該溶液或其一部分與9、10-二氫化吖啶化合物、過氧化物和過氧化物酶的第二種溶液混合。該第二種溶液可以任選地含有包括表面活性劑和金屬-螯合劑的其他藥劑。在另一方案中，9、10-二氫化吖啶化合物沒有包含在第二種溶液中，而是單獨地加到最后的反應(yīng)溶液中。在更進(jìn)一步的方案中，被護(hù)增強子9、10-二氫化吖啶、過氧化物、過氧化物酶和表面活性劑均被包含在一種水溶液中以和水解酶直接起反應(yīng)。
方案1
通過一種酶從被護(hù)增強物除去X基團(tuán)，產(chǎn)生一種催化劑或增強子，如一種酚，該增強子大大促進(jìn)過氧化物酶尤其是辣根過氧化物酶催化N-烷基-9、10-二氫化吖啶羧酸衍生物與過氧化氫氧化反應(yīng)產(chǎn)生光的能力。優(yōu)選的一類被護(hù)增強子包括分子式為Ar-OX的化合物(其中Ar為一個芳香基團(tuán)，X為一個可以被水解酶分解以產(chǎn)生一種酚化合物Ar-OH或其陰離子的離去基團(tuán)。方案1示出了具有特定的離去基團(tuán)X的一些掩蔽的或被護(hù)的酚的例子。通過使X基團(tuán)離去和釋放酚來與合適被護(hù)的酚起反應(yīng)的酶的特定例子包括酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、β-葡糖苷酶、乳糖酶、羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶?？赡艿腛-X基團(tuán)包括任何在使用條件下穩(wěn)定以及可以通過與酶反應(yīng)被分解的化學(xué)離去基團(tuán)，包括(但不限于)烷基或芳香羧酸酯、包括磷酸鹽和硫酸鹽的無機含氧酸鹽、以及包括β-D-半乳糖苷、β-葡糖苷酸、和β-葡糖苷和對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易見的物質(zhì)的氧的吡喃糖苷(oxygen-pyranoside)。已知的促進(jìn)其他過氧化物酶反應(yīng)的酚化合物在下述參考文獻(xiàn)中加以了描述G.Thorpe，L.Kricka，“生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光”(Bioluminescenceand Chemiluminescence)“新視野”(New Perspecties)，J.Scholmerch等人編輯第199-208頁(1987)，M.Li，H.Yoshida，Y.Aramaki，H.Masyya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori“生物化學(xué)和生物物理研究評論”(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，193(2)，540-5(1933)，以及美國專利5,171,668和5,206,149。優(yōu)選增強物選自于取代的酚、未取代的和取代的萘酚、包括但不限于p-苯基苯酚、p-碘苯酚、p-溴苯酚、p-羥基肉桂酸、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。
很多9、10-二氫化吖啶化合物在實施本發(fā)明中都是有用的。申請人的同時待審查的申請系列號，于1993年5月17日提出的08/061,810、于1994年3月2日提出的08/205,093和于1994年4月15日提出的08/288,290公開了幾種化學(xué)發(fā)光的9、10-二氫化吖啶化合物，包括芳香酯(Y＝OAr)，尤其是鹵素取代了的苯酯；硫酯(Y＝SAr)，尤其是苯硫代酯(phenylthioester)和鹵素取代的苯硫代酯和芳基磺酰亞胺(aryl sulfonimide)(Y＝NR9SO2Ar)將3個所述申請的公布內(nèi)容并入本文作為參考。環(huán)上取代的9、10-二氫化吖啶，即，其中R1-R8的一個或多個基團(tuán)為非氫的原子或基團(tuán)，是在能用于實施本發(fā)明的化合物的范圍內(nèi)。
在實施本發(fā)明中有用的螯合劑包括，例如，多齒陽離子配合劑如EDTA、EGTA和它們的鹽，以及本領(lǐng)域中所知的其他試劑。要意識到的是螯合劑對金屬依賴性的酶如堿性磷酸酶產(chǎn)生副作用。在利用本發(fā)明的方法來檢測這些酶時，應(yīng)該避免將螯合劑和酶在同一溶液中使用。本方法中有用的表面活性劑包括陰離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)，陽離子表面活性劑如季銨表面活性劑或者優(yōu)選一種非離子表面活性劑如聚氧乙烯化烷基酚、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯山梨醇酯和類似的表面活性劑。
本發(fā)明的一個重要方面是，在沒有水解酶時，含有一種N-烷基-9、10-二氫化吖啶羧酸衍生物、一種過氧化物、一種過氧化物酶和一種被護(hù)增強物的組合物不產(chǎn)生大量的背景的化學(xué)發(fā)光信號。與美國專利5,306,621中所公開的氨基苯二酰一肼體系相比，該組合物與水解酶反應(yīng)形成游離的增強子引起持續(xù)時間延長的化學(xué)發(fā)光。通過避免需要精確的反應(yīng)時間，延長持續(xù)時間簡化了測定，并且在利用以軟膠片為基礎(chǔ)的檢測手段時增加了檢測的靈敏度。
與本領(lǐng)域中所知的方法相比，N-烷基-9、10-二氫化吖啶羧酸衍生物和本發(fā)明的組合物的其他優(yōu)點在于增加了靈敏度和檢測第一種酶的動態(tài)范圍。比較實驗表明，應(yīng)用本發(fā)明的試劑組合物與應(yīng)用包括氨基苯二酰一肼的試劑相比，堿性磷酸酶的檢測極限至少低100倍。
考慮到實施例，這些優(yōu)點和其他的優(yōu)點將更加清楚。實施例實施例1磷酸p-碘苯基酯二鈉鹽的合成于15ml二氯甲烷(CH2Cl2)中溶解吡啶(0.395g，5mmol)，將該溶液冷卻至大約5℃，并緩慢加入POCl3(2.30g，15mmol)，同時攪拌溶液。然后，在5分鐘內(nèi)滴加入10ml的p-碘苯酚(1.10g，5mmol)的CH2Cl2溶液。移去冷卻浴并繼續(xù)攪拌30分鐘。減壓除去溶劑，并加入15ml CH3CN以溶解固體。邊攪拌逐滴加入溶于1ml水的NaOH(0.8g，20mmol)產(chǎn)生白色沉淀。靜置10分鐘后，收集固體物，并用大量的CH3CN沖洗再用丙酮沖洗，然后在空氣中干燥。實施例2合成p-苯基苯酚磷酸二鈉鹽在15ml CH2Cl2中溶解吡啶(0.395g，5mmol)，將該溶液冷卻到大約5℃，邊攪拌邊緩慢加入POCl3(2.30g，15mmol)。然后，在5分鐘內(nèi)滴加溶于10ml CH2Cl2的p-苯基苯酚。移去冷卻浴并攪拌30分鐘。減壓除去溶劑，并加入15ml CH3CN以溶解固體。邊攪拌邊逐滴加入溶于1.2ml水的NaOH(0.80g，20mmol)產(chǎn)生白色沉淀。靜置10分鐘后，收集固體，用大量的CH3CN然后以丙酮沖洗，并于空氣中干燥。實施例3p-碘苯基β-D-吡喃半乳糖苷(p-Iodophenyl-β-D-galacto-pyranoside)的合成將溶于3ml丙酮的p-碘苯酚(1g，4.5mmol)用3ml的5M KOH處理。向攪拌的溶液中逐份地加入乙酰溴半乳糖(5.6g，13.6mmol)。最初在2-3小時間隔內(nèi)一份4.1g的乙酰溴半乳糖連同1ml的5M KOH加入，再連同0.5ml的5M KOH加入幾份0.5g的乙酰溴半乳糖直至總量為5.6g(3個等份)。繼續(xù)攪拌過夜。加入水，溶液用二氯甲烷再以乙酸乙酯苯取。蒸發(fā)合并的有機層，通過柱層析使用30％乙酸乙酯的己烷在硅膠(silica)上純化粗產(chǎn)物以除去未反應(yīng)的糖。以適合的級分中除去溶劑得到所需化合物的四乙酸酯。將一份300mg的上述四乙酸酯溶于2ml丙酮，并和650μl的10M KOH攪拌過夜以水解得到所需化合物。蒸發(fā)掉丙酮并加入30ml水。加入氯化銨以中和pH值，得到的溶液用乙酸乙酯苯取。用MgSO4干燥乙酸乙酯溶液，在減壓下濃縮，得到白色固體，再用50％甲醇/乙酸乙酯進(jìn)一步以柱層析純化，1H(NMR)核磁共振(CD3OD)δ3.28-3.89(m，6H)，4.81(d，1H)，6.89-7.57(m，4H)。實施例4p-苯基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷的合成向溶于丙酮的p-苯基苯酚(250mg，1.46mmol)中加入1ml的10NKOH，接著再加入乙酰溴半乳糖(1.8g，4.37mmol)。反應(yīng)混合物于室溫下攪拌過夜。TLC(薄層色譜法)分析表明沒有殘留的起始物質(zhì)。加入10NKOH(1ml)以完全脫乙?；?，溶液再次攪拌過夜。蒸發(fā)掉丙酮后，粗物質(zhì)溶解于乙酸乙酯，并用5×150ml水沖洗。用MgSO4干燥乙酸乙酯，減壓濃縮，得到一種白色固體，再用30％甲醇/乙酸乙酯以柱層析進(jìn)一步純化；1H核磁共振(NMR)(CD3OD)δ3.56-3.91(m，6H)，4.89(m，1H)，7.15-7.57(m，9H)。實施例5p-苯基苯酚乙酸酯(p-Phenylphenol acetate)的合成在15ml CH2Cl2中溶解吡啶(2ml)。將溶液冷卻至大約5℃，攪拌同時緩慢加入乙酰氯(393mg，5mmol)。然后，在15分鐘內(nèi)逐滴地加入p-苯基苯酚(0.85g，5mmol)于20ml CH2Cl2中的懸浮液。移去冷卻浴，連續(xù)攪拌30分鐘，減壓除去溶劑，加入50ml乙酸乙酯以溶解固體物。用水抽提溶液，在Na2SO4上干燥并在減壓下蒸發(fā)。實施例6合成過氧化物酶底物化合物2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯(a)，以文獻(xiàn)中所描述的方法制備化合物3-甲氧基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸(G.Zomer，J.Starenuiter，R.Van Den Berg，E.Jansen，參見“化學(xué)和生化分析中的發(fā)光技術(shù)”(Luminescence Techniques in Chemical andBiochemical Analysis)，W.Baeyens，D.De Keukeleire，K.Korkidis編輯，Dekker，New York，505-521，(1991)。以市面上可買到的(Aldrich)3-甲氧基-二苯胺和草酰氯縮合生成3-甲氧基和1-甲氧基-9、10-二氫化吖啶羧酸的混合物，其作為混合物轉(zhuǎn)化為酯。
(b)將3-甲氧基和1-甲氧基-9、10-二氫化吖啶羧酸(1.5g)的混合物懸浮于10ml的SOCl2中，反應(yīng)混合物回流加熱3小時。減壓除去溶液得到一種黃色固體物，在氬氣中將它溶于二氯甲烷(CH2Cl2)和吡啶(0.7ml)中。滴加溶于CH2Cl2的2、3、6-三氟苯酚(0.878g)溶液。溶液于室溫攪拌過夜，再以更多的CH2Cl2(100ml)稀釋，并用水(3×50ml)沖洗。有機層以Na2SO4干燥并濃縮得到異構(gòu)酯的混合物。用25％乙酸乙酯/己烷于二氧化硅上層析分離出產(chǎn)物2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-吖啶-9-羧酸酯1H核磁共振(NMR)(CDCl3)δ4.043(s，3H)，7.08-8.25(m，9H)。
(c)在氬氣氣氛下于二氯甲烷(3ml)中溶解上述化合物(0.24g)，并加入三氟甲磺酸甲酯(methyl trifluoromethanesulfonate)(0.1ml，1.4eq.)。溶液于室溫下攪拌過夜，產(chǎn)生厚厚的一層黃色沉淀。過濾沉淀，用乙醚沖洗并干燥，得到純的2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-吖啶鎓-9-羧酸-三氟甲磺酸酯的黃色晶體1H核磁共振(DMSO-d6)δ4.288(s，3H)，4.837(s，3H)，7.64-8.89(m，9H)。
(d)于無水乙醇(15ml)中懸浮吖啶鎓酯(35mg)，溶液回流加熱10分鐘，得到澄清的溶液。向溶液中逐份加入過量的氯化銨(4g)，再加入鋅(4g)，使溶液立刻脫色。將無色溶液回流加熱30分鐘，冷卻，過濾，用乙醇(3×20ml)沖洗沉淀。濃縮溶液，得到灰白色固體，將它再溶于二氯甲烷，并用水沖洗(3×50ml)。二氯甲烷蒸發(fā)后得到的粗物質(zhì)于硅膠上(乙酸乙酯/己烷)層析，得到純的2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯的白色固體物1H核磁共振(NMR)(CDCl3)δ3.422(s，3H)，3.847(s，3H)，5.25(s，1H)，6.54-7.39(m，9H)。實施例7合成過氧化物酶底物化合物2′、3′、6′-三氟苯基吖啶-9-羧酸酯(a)于過量亞硫酰(二)氯(5ml)中懸浮吖啶-9-羧酸(Aldrich，0.5g)，反應(yīng)混合物加熱回流3小時。在減壓下除去溶液，得到黃色固體，在氬氣氣氛中將它溶于二氯甲烷和吡啶(0.53g)。逐滴加入溶于二氯甲烷的苯酚溶液。在室溫下將溶液攪拌過夜，再用更多的二氯甲烷(100ml)稀釋，并用水沖洗(3×50ml)。有機層在Na2SO4上干燥，并濃縮得到產(chǎn)物。黃色固體再用乙醚沖洗以除去多余的苯酚(82％回收率)1H核磁共振(NMR)(CDCl3)δ7.08-7.28(m，2H)，7.71-8.42(m，8H)。
(b)2′、3′、6′-三氟苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧酸三氟甲磺酸酯。然后將該酯(0.30g)在氬氣中懸浮于二氯甲烷(25ml)，并加入三氟甲磺酸甲酯(0.95ml)于室溫下將溶液攪拌過夜，產(chǎn)生一層厚的沉淀。再將沉淀過濾、用乙醚沖洗并干燥得到黃色晶體產(chǎn)物。1H NMR(丙酮-d6)δ5.29(s，3H)，7.50-7.67(m，2H)，8.26-9.14(m，8H)。
(c)2′、3′、6′-三氟苯基10-甲基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。將吖啶鎓酯(0.20g)溶于10ml冰醋酸中，得到黃色溶液，再加入鋅(2.5g)使溶液立刻脫色。于室溫下攪拌5分鐘后，反應(yīng)混合物薄層層析表明其為非極性物質(zhì)。倒掉乙酸并將固體用二氯甲烷沖洗。蒸發(fā)混合溶液得到粗的固體，再將固體溶于二氯甲烷中并用2或3-50ml的水沖洗。在硅膠(20-30％乙酸乙酯/正己烷)上層析蒸發(fā)掉二氯甲烷后得到的粗物質(zhì)，得到純的白色固體產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ3.44(s，3H)，54(s，1H)，6.76-6.84(m，2H)，6.99-7.39(m，8H)。實施例8檢測膜上的堿性磷酸酶在一個步驟中制備用于化學(xué)發(fā)光檢測膜上的堿性磷酸酶共軛物的試劑?？捎糜诨瘜W(xué)發(fā)光的Western-印跡技術(shù)中的該試劑包括1mM被護(hù)HRP增強子磷酸2-萘酯(Aldrich)、0.05mM 2′、3′、6′-三氟苯基10-甲基9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯，2.5mM過氧化脲、0.5％ TWEEN 20和40pmol的溶于pH8.8、0.01Mtris緩沖液中的HRP。在Western印跡中，固定在硝化纖維或聚偏二氟乙烯薄膜上的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體通過將該膜與裝于容器(透明薄膜)中的檢測試劑浸潤而檢測，將膜暴露給X-射線膠片5秒至30分鐘，然后沖洗軟片。實施例9 堿性磷酸酶檢測的線性度應(yīng)用本發(fā)明的試劑組合物來測定堿性磷酸酶(AP)的線性度。將含有溶于pH8.8的0.01Mtris緩沖液的被護(hù)HRP增強子磷酸2-萘酯的溶液(50μl)和含有3.7×10-15-1.1×10-19mol酶的AP保溫。在37℃下原初反應(yīng)30分鐘后，將50μl本發(fā)明的試劑加入到每個溶液中。試劑含有0.1mM2′、3′、6-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯鹽，1.2mM過氧化脲、2mM EDTA，0.05％ TWEEN 20和40pmol的溶于pH8.0的0.01Mtris緩沖液中的HRP。持續(xù)監(jiān)測光強15分鐘。所得值在第15分鐘測量。圖1說明了可達(dá)到的非常好的靈敏度；可檢測到0.11amol(1.1×10-19mol)的AP。圖中，S-B一詞指存在AP時繼電器邏輯元件(RLU)中的化學(xué)發(fā)光信號(S)，該信號以不存在AP時的背景化學(xué)發(fā)光進(jìn)行校正。結(jié)果為三個重復(fù)的樣品的平均值。實施例10 β-半乳糖苷酶檢測的線性度應(yīng)用本發(fā)明的試劑組合物測定β-半乳糖苷酶(β-gal)的線性度。將含有溶于pH7.0、0.005M的磷酸鈉緩沖液的被護(hù)HRP增強子p-苯基苯酚半乳糖苷(0.15mM)的溶液(50μl)和含有5.6×10-15-1.9×10-19mol酶的β-gal(半乳糖苷酶)保溫。在25℃下原初反應(yīng)30分鐘后，向每一溶液中加入實施例9的試劑。圖2說明可達(dá)到優(yōu)良的靈敏度，可檢測到0.56amol(5.6×10-19mol)的β-半乳糖苷酶。結(jié)果取三個重復(fù)樣品的平均值。
上述描述僅意在說明本發(fā)明，本發(fā)明只受到所附的權(quán)利要求書的限定。
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的方法，該方法包括使一種水解酶與一種被護(hù)增強子、一種過氧化物、一種過氧化物酶以及一種9、10-二氫化吖啶的化合物起反應(yīng)，該9、10-二氫化吖啶化合物與過氧化物和過氧化酶反應(yīng)產(chǎn)生光，其中被護(hù)增強化合物分子式為ArOX，其中X為一個與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar選自取代的苯基、萘基和取代的萘基，其中水解酶與被護(hù)增強化合物反應(yīng)以除去X，因而，與無增強化合物時產(chǎn)生的光水平相比較，增加了9、10-二氫化吖啶化合物產(chǎn)生的光的水平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，還進(jìn)一步包括(a)使水解酶與被護(hù)增強子在水溶液中反應(yīng)第一段時間；然后(b)將含水解酶和被護(hù)增強子的溶液與一種含9、10-二氫化吖啶、過氧化物化合物和過氧化物酶的溶液混合以產(chǎn)生光。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中9、10-二氫化吖啶的分子式為
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基，其中R1-R8獨立地選自于產(chǎn)生光的基團(tuán)，其中Y為一個離去基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中Y選自于芳氧基團(tuán)、取代的芳氧基團(tuán)、芳硫基團(tuán)、取代的芳硫基團(tuán)和磺酰亞胺(sulfonimide)基團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中Y為被取代了的芳氧基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中被取代了的芳氧基團(tuán)為鹵素取代了的苯氧基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中R1-R8至少有一個基團(tuán)為C1-C20烷氧基團(tuán)，并且其中R為C1-C20烷基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中9、10-二氫化吖啶為2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中水解酶被結(jié)合到一個特殊結(jié)合對的鏈節(jié)上，其中特殊結(jié)合對選自半抗原、抗原、抗體、蛋白質(zhì)、寡核苷酸和核酸。
10.一種在分析過程中利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測被分析物的存在或量的方法，該方法包括(a)使水解酶與被護(hù)增強子、過氧化物化合物、過氧化物酶和9、10-二氫化吖啶化合物反應(yīng)，9、10-二氫化吖啶化合物與過氧化物化合物和過氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)生光，其中被護(hù)增強化合物分子式為ArOX，其中X為一個與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar選自取代的苯基、萘基和取代的萘基，其中水解酶與被護(hù)增強化合物反應(yīng)以除去X，因而，與無增強化合物時產(chǎn)光水平相比較，增加了由9、10-二氫化吖啶化合物產(chǎn)生光的水平。(b)使所產(chǎn)生的光的量與分析物的存在和量建立聯(lián)系。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中9、10-二氫化吖啶的分子式為
其中R選自烷基、雜烷基和芳烷基、其中R1-R8獨立地選自于產(chǎn)生光的基團(tuán)，其中Y為離去基團(tuán)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中Y選自芳氧基團(tuán)、被取代了的芳氧基團(tuán)、芳硫基團(tuán)、被取代了的芳硫基團(tuán)和磺酰亞胺基團(tuán)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中基團(tuán)Y為被取代了的芳氧基團(tuán)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中被取代的芳氧基團(tuán)為鹵素取代了的苯氧基團(tuán)。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中R1-R8中至少之一為C1-C20烷氧基團(tuán)，并且其中R為C1-C20烷基。
16.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中9、10-二氫化吖啶為2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中被分析物為水解酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中水解酶被連結(jié)到特殊結(jié)合對的鏈節(jié)上，其中特殊結(jié)合對選自半抗原、抗原、抗體和寡核苷酸。
19.一種在分析過程中利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測被分析物的存在或量的試劑盒，該試劑盒包括在一個或多個容器里提供(a)一種9、10-二氫化吖啶化合物；(b)一種過氧化物化合物；(c)一種分子式為ArOX的被護(hù)增強化合物，其中X為與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar選自被取代了的苯基、萘基和被取代了的萘基；(d)一種過氧化物酶；和(e)任選地，一種可以是單獨存在的也可以是連結(jié)到特殊結(jié)合對的鏈節(jié)上的水解酶。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其中9、10-二氫化吖啶分子式為
其中R選自于烷基、雜烷基和芳烷基，其中R1-R8獨立地選自于產(chǎn)生光的基團(tuán)，并且其中Y為一個離去基團(tuán)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，其中基團(tuán)Y選自于芳氧基、被取代了的芳氧基、芳硫基、被取代的芳硫基和磺酰亞胺基團(tuán)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，其中基團(tuán)Y為被取代了的芳氧基團(tuán)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的試劑盒，其中被取代了的芳氧基為鹵素取代了的苯氧基團(tuán)。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，其中R1-R8至少之一為C1-C20烷氧基，并且其中R為C1-C20烷基。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的試劑盒，其中9、10-二氫化吖啶為2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基10-甲基9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
26.一種在分析過程中利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來檢測被分析物的存在或量的試劑盒，該試劑盒包括提供(a)一種在水解酶存在時發(fā)光的試劑組合物，在水溶液中該試劑組合物包括一種被護(hù)增強子，一種過氧化物化合物、一種過氧化物酶和一種9、10-二氫化吖啶化合物；其中9、10-二氫化吖啶化合物與過氧化物化合物和過氧化物酶反應(yīng)發(fā)光；其中被護(hù)增強化合物分子式為ArOX，其中X為一個與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar選自于被取代了的苯基、萘基和被取代了的萘基；其中水解酶與被護(hù)增強化合物反應(yīng)以除去X；因而，與無增強化合物時產(chǎn)光水平相比較，增加了由9、10-二氫化吖啶化合物產(chǎn)生光的水平；和(b)任選地，一種可以單獨存在也可以是被結(jié)合到特殊結(jié)合對的鏈節(jié)上的水解酶。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的試劑盒，其中9、10-二氫化吖啶的分子式為
其中R選自于烷基、雜烷基和芳烷基，其中R1-R8單獨選自于產(chǎn)生光的基團(tuán)，并且其中Y為一個離去基團(tuán)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中基團(tuán)Y選自于芳氧基、被取代了的芳氧基、芳硫基、被取代了的芳硫基和磺酰亞胺基團(tuán)。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中基團(tuán)Y為被取代了的芳氧基團(tuán)。
30根據(jù)權(quán)利要求29的試劑盒，其中被取代了的芳氧基為鹵素取代了的苯氧基團(tuán)。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中R1-R8至少之一為C1-C20烷氧基，并且其中R為C1-C20烷基。
32.根據(jù)權(quán)利要求26的試劑盒，其中9、10-二氫化吖啶為2′、3′、6-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
33.一種在水解酶存在時產(chǎn)生光的組合物，該組合物在水溶液中包括(a)一種過氧化物化合物；(b)一種過氧化物酶；(c)一種與該過氧化物化合物和該過氧化物酶反應(yīng)發(fā)光的9、10-二氫化吖啶化合物；(d)一種分子式為ArOX的被護(hù)增強化合物，其中X為一個與水解酶反應(yīng)的離去基團(tuán)，Ar選自于被取代了的苯基、萘基和被取代了的萘基，其中水解酶與被護(hù)增強化合物反應(yīng)以除去X；因而，與無增強化合物時產(chǎn)生光的水平相比較，增加了由9、10-二氫化吖啶化合物產(chǎn)生光的水平。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中9、10-二氫化吖啶的分子式為
其中R選自于烷基、雜烷基和芳烷基，其中R1-R8單獨選自于產(chǎn)生光的基團(tuán)，并且其中Y為一個離去基團(tuán)。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中基團(tuán)Y選自于芳氧基、被取代了的芳氧基、芳硫基、被取代了的芳硫基和磺酰亞胺基團(tuán)。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中基團(tuán)Y為被取代了的芳氧基團(tuán)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中被取代了的芳氧基為鹵素取代了的苯氧基團(tuán)。
38.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中R1-R8中至少有一個為C1-C20烷氧基，并且其中R為C1-C20的烷基。
39.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中9、10-二氫化吖啶為2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氫化吖啶-9-羧酸酯。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種化學(xué)發(fā)光檢測方法，組合物和試劑盒。其中使用了一種被護(hù)苯酚增強化合物，這種化合物被一種水解酶去保護(hù)，從而增強光化學(xué)反應(yīng)。這一反應(yīng)涉及一種9、10-二氫化吖啶化合物，優(yōu)選為N-烷基-(9、10-二氫化吖啶)-9-羧酸的衍生物，在去保護(hù)增強子存在時，它能被過氧化物和過氧化物酶激活而發(fā)光。結(jié)果是增強了發(fā)光。水解酶單獨存在或與免疫檢測、DNA探針檢測或其他檢測中特殊的結(jié)合對的鏈節(jié)連接，其中這些水解酶與信息分子結(jié)合。
文檔編號G01N33/535GK1156506SQ95194805
公開日1997年8月6日 申請日期1995年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月30日
發(fā)明者哈謝姆·阿克哈溫-塔夫蒂, 扎拉·阿戈哈瓦尼, 雷努卡·德席爾瓦 申請人:魯米根公司