具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和快速發(fā)光的親水高量子產(chǎn)率吖啶酯的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有改進(jìn)的穩(wěn)定性和快速發(fā)光的親水高量子產(chǎn)率吖啶酯
[0001] 1.對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用 本申請(qǐng)要求2013年7月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)No. 61/843, 528的優(yōu)先權(quán)， 其全文經(jīng)此引用并入本文。
[0002] 2.發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及具有提高的光輸出、改進(jìn)的穩(wěn)定性、快速發(fā)光和低非特異性結(jié)合的親水、高 量子產(chǎn)率化學(xué)發(fā)光吖啶鑰化合物。這些化合物因其提高的量子產(chǎn)率和親水性質(zhì)而可用于改 進(jìn)檢測(cè)靈敏度。這些化合物的改進(jìn)的穩(wěn)定性有助于延長(zhǎng)使用這些化合物的試劑的貯存壽命 以及使檢測(cè)性能隨時(shí)間的變化最小化。它們的提高的發(fā)射動(dòng)力學(xué)尤其在自動(dòng)化分析儀中的 檢測(cè)中還能實(shí)現(xiàn)更快的光測(cè)量。
[0003] 3.發(fā)明背景 化學(xué)發(fā)光的吖啶酯（AE)是已廣泛用于免疫測(cè)定和核酸測(cè)定的極其有用的標(biāo)記物。 Pringle, M. J. JoyraaJ ο/1 第忍卷，第 105-122 頁(yè)（1999)的 綜述概括了這類(lèi)化學(xué)發(fā)光化合物過(guò)去和當(dāng)前的發(fā)展。
[0004] McCapra, F.等人在 TfeiraAeiimw Zeii.第丈?卷，第 3167-3172 頁(yè)（1964)中和 Rahut等人在J (5/芯CAe?第卷，第3587-3592頁(yè)（1965)中公開(kāi)了可通過(guò)堿性過(guò)氧 化物觸發(fā)來(lái)自吖啶鑰鹽的酯的化學(xué)發(fā)光。自這些開(kāi)創(chuàng)性研究以來(lái)，由于它們作為標(biāo)記物的 效用，對(duì)吖啶鐵化合物的興趣已經(jīng)增加。Simpson, J.S.A.等人，Tfe tore,第276卷，第 646-647頁(yè)（1979)公開(kāi)了吖啶酯9-羧基苯基-N-甲基吖啶鑰溴化物在免疫測(cè)定中的應(yīng)用。 但是，這種吖啶酯相當(dāng)不穩(wěn)定，由此限制其商業(yè)應(yīng)用。這種不穩(wěn)定性來(lái)源于酚和吖啶鑰環(huán)之 間的9-羧基苯基酯連接基的水解。
[0005] 已經(jīng)描述了用于提高吖啶鐵化合物的穩(wěn)定性的不同策略。Law等人，JoyraaJ ο/1 組第 4卷，第 88-89 頁(yè)（1989)將兩個(gè)甲基引入 吖啶酯部分的側(cè)面以穩(wěn)定這種連接基。發(fā)現(xiàn)所得空間穩(wěn)定的吖啶酯，DME-NHS [10-甲基 吖啶-9-甲酸2'，6'-二甲基-4'-(N-琥珀酰亞胺氧基羰基）苯基酯]具有與不含這兩個(gè) 甲基的吖啶酯相同的光輸出。前一化合物在結(jié)合到免疫球蛋白上時(shí)的穩(wěn)定性極優(yōu)并且甚至 在37°C下在pH 7下一周后也沒(méi)有表現(xiàn)出化學(xué)發(fā)光活性的損失。相反，未取代的吖啶酯在 經(jīng)受相同處理時(shí)僅保留其活性的10%。美國(guó)專(zhuān)利No. 4, 918, 192和5, 110. 932描述了 DMAE 及其應(yīng)用。
[0006] 授予Law等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 5, 656, 426公開(kāi)了 DMAE的一種親水形式，被稱(chēng)作 NSP-DMAE-NHS酯，其中N-甲基基團(tuán)已被N-磺丙基（NSP)所替代。下面圖解這兩種化合物 的結(jié)構(gòu)和吖啶鑰環(huán)的編號(hào)系統(tǒng)。
[0007] Natrajan等人在美國(guó)專(zhuān)利No. 6, 664, 043 B2中公開(kāi)了具有連接到 酚上的親水改性劑的NSP-DMAE衍生物。在上文中圖解了 一種這樣的化合物， NSP-DMAE-HEG-Glutarate-NHS (縮寫(xiě)為HEG-AE)的結(jié)構(gòu)。在這種化合物中，二氨基六（乙 二醇）（diamino hexa(ethylene) glycol，二氨基-HEG)部分連接到酸上以提高該吖啶酯 的水溶性。戊二酸酯部分附加到HEG的末端并轉(zhuǎn)化成NHS酯以便能標(biāo)記各種分子。
[0008] Kinkel 等人, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 第 4卷， 第 136-139 頁(yè)（1989)和 Mattingly, Journal of Bioluminescence and 〇￡7??_/知^?_//76'6^6'/^6'，第^卷，第107-114頁(yè)（1991)和美國(guó)專(zhuān)利1'1〇.5,468,646描述了不 同的一類(lèi)穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光吖啶鑰化合物。在這類(lèi)化合物中，酚酯連接基被磺酰胺部分所替 代，這據(jù)報(bào)道提供水解穩(wěn)定性而不損害光輸出。在吖啶酯中，酚是"離去基"，而在吖啶鑰磺 酰胺中，磺酰胺是與堿性過(guò)氧化物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過(guò)程中的"離去基"。
[0009] 通常通過(guò)堿性過(guò)氧化物觸發(fā)來(lái)自吖啶鑰化合物的發(fā)光?？偣廨敵?-也可被稱(chēng)作 化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率，是該化學(xué)反應(yīng)導(dǎo)致形成激發(fā)態(tài)吖啶酮的效率和激發(fā)態(tài)吖啶酮的熒光量 子產(chǎn)率的組合。
[0010] 最近，Natrajan等人在美國(guó)專(zhuān)利No. 7, 309, 615 B2 (其公開(kāi)內(nèi)容經(jīng)此引用并入本 文）中描述了在吖啶鑰環(huán)的C2和/或C7上含有親水烷氧基（0R*)的親水、高量子產(chǎn)率吖啶 鑰化合物，其中R*是包含磺丙基部分或乙二醇部分或其組合的基團(tuán)。來(lái)自此類(lèi)化合物的提 高的光輸出和它們的親水性質(zhì)使它們可用于改進(jìn)免疫測(cè)定的靈敏度。下面圖解一種這樣的 化合物 NSP-2, 7-(0MHEG)2-DMAE-AC-NHS (縮寫(xiě)為 HQYAE)的結(jié)構(gòu)。
[0011] 4.發(fā)明概述 已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在吖啶鑰環(huán)的C2和/或C7上具有-OG形式的給電子官能團(tuán)的 親水、高量子產(chǎn)率化學(xué)發(fā)光吖啶酯提供提高的光輸出、改進(jìn)的穩(wěn)定性、快速發(fā)光和/或在檢 測(cè)中的低非特異性結(jié)合，其中G代表支鏈親水的取代基。
[0012] 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了親水、高量子產(chǎn)率吖啶酯，其具有式（I)的結(jié)構(gòu)：
其中，R1是甲基或磺丙基；G是支鏈基團(tuán)，其在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地選自：
其中R2、R3、R4、R5、iaP R7在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為甲基或基團(tuán)-(CH2CH2O)bCH 3,其中是 1至5的整數(shù)；且R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類(lèi)似物或被分析物 的結(jié)合分子上的親電子或親核基團(tuán)。
[0013] 在根據(jù)式（I)的一些實(shí)施方案中，G在一處或在兩處出現(xiàn)時(shí)是基團(tuán)：
其中私和R3在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為甲基或基團(tuán)-(CH2CH2O) bCH3,其中是1至5的整 數(shù)；且特別地，G可以在一處或在兩處出現(xiàn)時(shí)是基團(tuán)：
;或在另一實(shí)施方案中G可以在一處或在兩處出現(xiàn)時(shí)是基團(tuán)：
[0014] 在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，G在一處或在兩處出現(xiàn)時(shí)是基團(tuán)：
[0015] 在根據(jù)式（I)的其它實(shí)施方案中，G在一處或在兩處出現(xiàn)時(shí)代表基團(tuán)：
其中HRjP R7在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為甲基或基團(tuán)-(CH2CH2O)bCH 3,其中是1至5 的整數(shù)。在根據(jù)這一實(shí)施方案的一個(gè)變體中，R4-R7可代表甲基，以使G在一處或在兩處出 現(xiàn)時(shí)是基團(tuán)：
[0016] 在根據(jù)式（I)的一個(gè)實(shí)施方案中，G在一處或在兩處出現(xiàn)時(shí)是基團(tuán)：
[0017] 在根據(jù)式（I)的吖啶酯中，R12可以例如選自： (1) -OH ； (2) -O-N-琥珀酰亞胺基； (3) -NH- (CH2) 5-C (0) -O-N-琥珀酰亞胺基； (4) -NH- (CH2) 5-C00H ； (5) -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C (0) -O-N-琥珀酰亞胺基，其中/? = 1 至 5; (6) -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C00H，其中 λ = 1 至 5 ; (7) -NH-(C2H4O)b-C 2H4NH2，其中 /? = 1 至 5 ;和 (8) -NH-R-NHR，其中R獨(dú)立地為氫、烷基、烯基、炔基或芳烷基；其中R任選包含最多20 個(gè)雜原子。
[0018] 在各種不例性實(shí)施方案中，R12是_〇Η，或R 12是基團(tuán)： -NH-(C2H4O)b-C2H4NH 2,其中刀=1 至 5， 或Ri2是基團(tuán)： -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C (0) -0-R' '，其中 /?= 1 至5;且其中 R'' 是氫 或-N-琥珀酰亞胺基。
[0019] 一種根據(jù)式（I)的吖啶酯具有下列結(jié)構(gòu)：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類(lèi)似物或被分析物的結(jié)合 分子上的親電子或親核基團(tuán)。
[0020] 另一根據(jù)式（I)的吖啶酯具有下列結(jié)構(gòu)：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類(lèi)似物或被分析物的結(jié)合 分子上的親電子或親核基團(tuán)。
[0021] 又一根據(jù)式（I)的吖啶酯具有下列結(jié)構(gòu)：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類(lèi)似物或被分析物的結(jié)合 分子上的親電子或親核基團(tuán)。
[0022] 另一根據(jù)式（I)的吖啶酯具有下列結(jié)構(gòu)：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類(lèi)似物或被分析物的結(jié)合 分子上的親電子或親核基團(tuán)。
[0023] 再一根據(jù)式（I)的吖啶酯具有下列結(jié)構(gòu)：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物綴合到被分析物、被分析物類(lèi)似物或被分析物的結(jié)合 分子上的親電子或親核基團(tuán)。
[0024] 在根據(jù)式（I)的吖啶酯的一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R12代表-OH。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面中，提供了一種用于檢測(cè)或量化被分析物的測(cè)定法，其包括 步驟：(a)提供一種綴合物，其包含：（i)被分析物的特異性結(jié)合分子；和（ii)根據(jù)式（I) 的親水、高量子產(chǎn)率和快速發(fā)光的吖啶酯；(b)提供具有固定在其上的被分析物的第二特 異性結(jié)合分子的固體載體；(C)混合所述綴合物、所述固相和懷疑含有所述被分析物的樣 品以形成結(jié)合復(fù)合物；（d)分離捕獲在所述固體載體上的結(jié)合復(fù)合物；（e)通過(guò)添加化學(xué) 發(fā)光觸發(fā)劑觸發(fā)來(lái)自步驟（d)的結(jié)合復(fù)合物的化學(xué)發(fā)光；（f)用光度計(jì)測(cè)量發(fā)光量；和（g) 通過(guò)將來(lái)自反應(yīng)混合物的發(fā)光量與將發(fā)光量與被分析物的已知濃度相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)劑量響 應(yīng)曲線比較，來(lái)檢測(cè)被分析物的存在或計(jì)算被分析物的濃度。
[0026] 在一個(gè)相關(guān)方面中，提供了一種用于檢測(cè)或量化被分析物的測(cè)定法，其包括步驟： (a)提供被分析物與根據(jù)式（I)的親水、高量子產(chǎn)率和快速發(fā)光的吖啶酯的綴合物；(b) 提供固定有被分析物的特異性結(jié)合分子的固體載體；（C)混合所述綴合物、固體載體和懷 疑含有所述被分析物的樣品以形成結(jié)合復(fù)合物；（d)分離捕獲在所述固體載體上的結(jié)合復(fù) 合物；（e)通過(guò)添加化學(xué)發(fā)光觸發(fā)劑觸發(fā)來(lái)自步驟（d)的結(jié)合復(fù)合物的化學(xué)發(fā)光；(f)用 光度計(jì)測(cè)量光量；和（g)通過(guò)將反應(yīng)混合物的發(fā)光量與將發(fā)光量與被分析物的已知濃度 相關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)劑量響應(yīng)曲線比較，來(lái)檢測(cè)被分析物的存在或計(jì)算被分析物的濃度。
[0027] 通過(guò)參考以下發(fā)明詳述和所附權(quán)利要求書(shū)更清楚地理解本發(fā)明的這些和其它方 面。
[0028] 5.附圖簡(jiǎn)述 圖1圖解了具有適用于制備蛋白質(zhì)或其它含親核官能團(tuán)的分子的綴合物的親電子 N-羥基琥珀酰亞胺基（NHS)官能團(tuán)的B-AE的結(jié)構(gòu)。
[0029] 圖2圖解了具有可用于使該吖啶鑰化合物與含親電子官能團(tuán)的分子綴合的親核 六乙二醇胺（HEG-NH 2)官能團(tuán)的B-AE結(jié)構(gòu)。
[0030] 圖3顯示使用圖2的B-AE制備的雌二醇綴合物(縮寫(xiě)為B-AE-E2)的結(jié)構(gòu)。
[0031] 6.優(yōu)選實(shí)施方案的描述 在口丨z陡鐵環(huán)的C2和/或C7上引入給電子官能團(tuán)如0R*提尚相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光卩丨z陡鐵化 合物的量子產(chǎn)率。當(dāng)該R*基團(tuán)為親水的，如磺丙基或甲氧基聚（乙二醇）時(shí)，相應(yīng)的吖啶 鑰化合物不僅表現(xiàn)出提高的光輸出，還表現(xiàn)出在免疫測(cè)定中降低的非特異性結(jié)合。這兩種 性質(zhì)共同導(dǎo)致免疫測(cè)定的靈敏度提高。
[0032] 本發(fā)明的主要目的是確認(rèn)導(dǎo)致（a)與NSP-DMAE和衍生物以及HQYAE相比時(shí)更快 的發(fā)光；(b)尤其與HQYAE相比時(shí)改進(jìn)的穩(wěn)定性；（c)與HQYAE相當(dāng)?shù)母吖廨敵龊停╠)與 HQYAE相當(dāng)?shù)牡头翘禺愋越Y(jié)合的吖啶鑰化合物的結(jié)構(gòu)特征。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的親水吖啶鑰化合物，縮寫(xiě)為B-AE (支鏈-吖啶酯)，不僅表現(xiàn)出提高 的光輸出，還表現(xiàn)出改進(jìn)的穩(wěn)定性和更快的發(fā)光。穩(wěn)定性是指吖啶鑰化合物的化學(xué)發(fā)光活 性。穩(wěn)定性的提高因此表現(xiàn)為化學(xué)發(fā)光活性的提高的經(jīng)時(shí)保持性。吖啶鑰化合物的提高的 穩(wěn)定性是有用的，因?yàn)檠苌源祟?lèi)化合物的試劑較不可能表現(xiàn)出檢測(cè)性能的經(jīng)時(shí)劣化，此 外，可能延長(zhǎng)衍生自此類(lèi)化合物的試劑的貯存壽命，由此造成較少浪費(fèi)。通常，衍生自吖啶 鑰化合物的檢測(cè)試劑包括蛋白質(zhì)或小分子的綴合物。該吖啶鑰化合物的第二種性質(zhì)是更快 的發(fā)光，這意味著這些化合物與缺乏本發(fā)明的吖啶鑰化合物的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征的吖啶鑰化合 物相比在