本發(fā)明涉及代謝組學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及用于抑郁癥診斷的代謝性生物標(biāo)記物組合。

背景技術(shù)：

1、抑郁癥在醫(yī)療體系中的低識(shí)別率主要是因?yàn)榕R床上對(duì)于抑郁癥的診斷主要是根據(jù)病史、臨床癥狀、病程來進(jìn)行判斷，目前抑郁癥的診斷主要依靠患者自述的癥狀及臨床訪談的結(jié)果，診斷過程相對(duì)主觀，這也造成抑郁癥治療率低、復(fù)發(fā)率高等問題。國際上通用的診斷標(biāo)準(zhǔn)有icd-10和dsm-v。而且，在抑郁癥患者中普遍存在臨床就診率低的現(xiàn)象。因此，對(duì)于抑郁癥的防治，需要一種客觀的檢測項(xiàng)目作為抑郁癥管理的篩查工具，不但可以將抑郁癥的“防線”提前，主動(dòng)發(fā)現(xiàn)大量抑郁癥潛在患者，還可以對(duì)于現(xiàn)有抑郁癥臨床診斷過于主觀的判斷手段進(jìn)行有效的補(bǔ)充。

2、研究表明，抑郁癥患者的服藥依從性較差，1年內(nèi)復(fù)發(fā)率約為33%，嚴(yán)重影響著抑郁癥患者的治療效果及治療轉(zhuǎn)歸，患者回歸社會(huì)后通常會(huì)不定期復(fù)發(fā)疾病，使得抑郁癥的治療終點(diǎn)難以確定。不同階段的抑郁癥患者，所需的治療方法及用藥不盡相同。大部分的患者并不能遵從全病程治療策略，這為臨床工作增加了困難。因此，需要對(duì)抑郁癥患者進(jìn)行病程監(jiān)控，包括治療轉(zhuǎn)歸和復(fù)發(fā)預(yù)測，這對(duì)于為抑郁癥患者提供及時(shí)的有效治療尤為重要。

3、近些年，基于代謝組學(xué)的抑郁癥研究日益增多。一項(xiàng)研究通過對(duì)298例抑郁癥患者的代謝組學(xué)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，血漿羥基化鞘烯素是治療抑郁癥結(jié)局的重要預(yù)測指標(biāo)（joycej?b.using?multi-domain?data?to?predict?remission?of?unipolar?depressiveepisodes?following?antidepressant?therapy[d].college?of?medicine-mayo?clinic,2020.）。另一項(xiàng)研究表明，乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺、肌酐、乙酸鹽、l-纈氨酸、l-丙氨酸和脂肪酸的水平在血清中顯著降低，而丙酮和膽堿水平顯著升高（song?z,?wang?h,?yin?x,?etal.?application?of?nmr?metabolomics?to?search?for?human?disease?biomarkers?inblood[j].?clinical?chemistry?and?laboratory?medicine?(cclm),?2019,?57(4):417-441.）。諸多研究證明，代謝物在抑郁癥的機(jī)理，用藥，預(yù)后等方面發(fā)揮重要作用。針對(duì)所篩選的分子標(biāo)記物，進(jìn)行試劑盒開發(fā)，對(duì)于臨床應(yīng)用意義重大。

4、盡管許多研究機(jī)構(gòu)對(duì)抑郁癥的診斷標(biāo)記物進(jìn)行了研究，但這些現(xiàn)有研究并沒有提供在臨床上可準(zhǔn)確、簡便、可靠、廣泛應(yīng)用的診斷方法。

5、申請(qǐng)?zhí)枮?01610105047.3和201080046087.6的中國專利申請(qǐng)中，披露了利用血清代謝標(biāo)記物對(duì)抑郁癥進(jìn)行診斷。但血清樣本存在樣本采集困難，需要專業(yè)的醫(yī)護(hù)人員才能進(jìn)行，患者本人難以在家自行采集。申請(qǐng)?zhí)枮?01480019392.4的中國專利申請(qǐng)中，披露了利用血清或尿液的生物標(biāo)記物診斷，所使用的一套生物標(biāo)記物包括至少cgmp、皮質(zhì)醇、鈣衛(wèi)蛋白、凝血噁烷、醛固酮、hvem和p物質(zhì)。由于所用標(biāo)記物既有小分子代謝物，又有大分子蛋白質(zhì)，需要使用多個(gè)技術(shù)平臺(tái)檢測，例如質(zhì)譜和免疫學(xué)方法，增加了檢測難度和成本，并且該發(fā)明采用血清和尿液樣本，儲(chǔ)存和運(yùn)輸成本都很高。申請(qǐng)?zhí)枮?02010658243.x的中國專利申請(qǐng)采用尿液制作濾紙片采集樣本，盡管有效解決了血清和血漿所存在的一些問題，但是其檢測目的單一，僅僅對(duì)抑郁癥的診斷進(jìn)行預(yù)測，而在抑郁癥的病程過程中，分級(jí)診斷、鑒別針對(duì)、治療轉(zhuǎn)歸，和復(fù)發(fā)同樣患者影響較大。傳統(tǒng)的分析方法如免疫分析一直是臨床診斷中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，免疫方法中，放免檢測由于存在放射污染，目前已基本被淘汰。elisa方法手工操作，結(jié)果易受人為因素影響。出于對(duì)檢測便利和檢測結(jié)果精準(zhǔn)性等需求，需要開發(fā)新的檢測標(biāo)記物、檢測方法和檢測工具。

6、申請(qǐng)?zhí)枮?01610105047.3的中國專利申請(qǐng)?zhí)峁┑脑噭┖心軌驕y定血液中篩選的14種代謝標(biāo)記物的含量：蛋氨酸、煙酸、磷酸絲氨酸、乳酸、谷氨酸、次黃嘌呤、膽堿、色氨酸、5-羥基色胺、丙酰肉堿、戊二?；鈮A、雌二醇、皮質(zhì)甾醇和雌三醇，利用該試劑盒對(duì)抑郁癥早期診斷的特異性達(dá)86.8％，敏感度達(dá)到96.8％，準(zhǔn)確率達(dá)93.0％。申請(qǐng)?zhí)枮?01080046087.6的中國專利申請(qǐng)僅涉及用于診斷抑郁癥的分子標(biāo)記物，并未表明代謝物組合的診斷效力。文獻(xiàn)?（重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文，作者：鄭鵬，基于代謝組學(xué)策略篩選抑郁癥血漿、尿液的診斷標(biāo)記物，2013年以及zheng?p,?wang?y,?chen?l,?et?al.identification?and?validation?of?urinary?metabolite?biomarkers?for?majordepressive?disorder.?mol?cell?proteomics.2013；12（1）：207-214）披露了采用核磁共振測定了126個(gè)抑郁癥患者與134個(gè)正常對(duì)照尿液樣本，共鑒定了23個(gè)差異性代謝物，邏輯回歸分析發(fā)現(xiàn)丙二酸(malonate)、甲酸酯(formate)、n-甲基煙酰胺（n-methylnicotinamide）、m-羥基乙酸苯酯（m-hydroxyphenylacetate）以及丙氨酸（alanine）這五個(gè)代謝物質(zhì)組成生物標(biāo)記物組具有潛在的臨床診斷價(jià)值。該生物標(biāo)記物組可區(qū)分訓(xùn)練集的?82個(gè)抑郁癥與82個(gè)正常對(duì)照的auc值為0.812（95％置信區(qū)間：0.829~0.961）；區(qū)分測試集的?44個(gè)抑郁癥與52個(gè)正常對(duì)照的auc值為0.895（95％置信區(qū)間：0.829~0.961）。

7、基于上述研究現(xiàn)狀，仍需要開發(fā)更優(yōu)的用于抑郁癥診斷的代謝性生物標(biāo)記物組合，使其用于抑郁癥診斷時(shí)具有例如更高的特異性、靈敏度、準(zhǔn)確率并且同時(shí)便于檢測的優(yōu)秀特性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一是提供一種用于抑郁癥診斷的代謝性生物標(biāo)記物組合，基于該代謝性生物標(biāo)記物組合，可通過機(jī)器學(xué)習(xí)模型算法，篩選最優(yōu)診斷模型，并構(gòu)建抑郁癥診斷試劑盒。

2、本發(fā)明進(jìn)一步目的之一是提供所述代謝性生物標(biāo)記物組合在制備用于受試體抑郁癥診斷的試劑盒中的用途。

3、本發(fā)明的進(jìn)一步目的之一是提供一種測試受體干血斑樣本中代謝性生物標(biāo)記物種類和含量的檢測方法。

4、基于上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種用于抑郁癥診斷的代謝性生物標(biāo)記物組合，包括：脯氨酸、甜菜堿、丙氨酸、色氨酸、犬尿氨酸、5-羥色胺、肌酸、琥珀酸、牛磺酸、2-羥基丁酸。優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種用于抑郁癥診斷的代謝性生物標(biāo)記物組合，所述代謝性生物標(biāo)記物組合由脯氨酸、甜菜堿、丙氨酸、色氨酸、犬尿氨酸、5-羥色胺、肌酸、琥珀酸、?；撬?、2-羥基丁酸組成。

5、本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于抑郁癥診斷的代謝性生物標(biāo)記物組合，包括：甲硫氨酸、苯丙氨酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、γ-氨基丁酸、尿囊素、尿酸、組氨酸、天門冬氨酸、蘇氨酸、雄烯二酮、胞嘧啶、黃嘌呤、膽紅素、丙酮酸、亞油酸、谷氨酰胺、絲氨酸、己二酸、假尿嘧啶核苷、酪氨酸、脯氨酸、纈氨酸、鳥氨酸、甜菜堿、丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、犬尿氨酸、5-羥色胺、肌酸、琥珀酸、牛磺酸、2-羥基丁酸、谷氨酸、葡萄糖、賴氨酸、精氨酸。

6、本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于診斷診斷抑郁癥的試劑盒，其包含所述代謝性生物標(biāo)記物組合。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供包含檢測如上所述代謝標(biāo)記物的試劑盒，包括代謝標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品，同位素內(nèi)標(biāo)、稀釋劑，甲酸，乙酸銨溶液。所述代謝標(biāo)記物提取溶劑選自水、甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇中一種或幾種的混合溶液，要求為色譜純級(jí)；所述流動(dòng)相用到的水，甲醇，乙腈，異丙醇，乙醇，甲酸，乙酸銨，均需達(dá)到色譜級(jí)。所述稀釋劑由甲醇，水，dmso中的一種或多種構(gòu)成，需要為色譜級(jí)。

7、進(jìn)一步地，所述試劑盒可按照以下方法制備：

8、（1）制備代謝標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)純品凍干粉；

9、（2）制備同位素內(nèi)標(biāo)的凍干粉；

10、（3）制備代謝標(biāo)記物提取溶劑；

11、（4）制備標(biāo)準(zhǔn)品和同位素內(nèi)標(biāo)的溶解劑；

12、（5）將上述試劑組裝為所述試劑盒。

13、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種上述試劑盒的使用方法，包括：

14、（1）采集受試體的血液樣品，制備干血斑紙片，將干燥后的干血斑樣品作為檢測樣本；

15、（2）以代謝產(chǎn)物提取溶劑和同位素內(nèi)標(biāo)液，對(duì)所述干血斑樣品進(jìn)行提取，得提取液；

16、（3）采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（lc-ms/ms）的靶向代謝組學(xué)分析方法，對(duì)于干血斑提取液中代謝物的濃度進(jìn)行測定；

17、（4）將測得的代謝物濃度與每一代謝物濃度正常值比較，如果其中脯氨酸、甜菜堿、丙氨酸、色氨酸、犬尿氨酸、5-羥色胺、肌酸、琥珀酸、?；撬?、2-羥基丁酸的濃度顯著降低（小于正常值的0.8倍），則判定為抑郁癥。

18、此外，本發(fā)明提供的試劑盒的檢測樣品也可以是血清和/或血漿。

19、本發(fā)明可采用如下方法制備干血斑樣品，其步驟包括：（1）收集干血斑卡片：卡片應(yīng)干凈無污染，無霉菌，卡片在使用前應(yīng)被密封。每個(gè)卡片應(yīng)該有獨(dú)立的識(shí)別信息（姓名、年齡、性別、日期編碼），卡片為特制卡片，具有專門的血液采集區(qū)域。（2）干血斑卡片分為2部分，一部分是血液收集區(qū)域，有半徑為3mm的內(nèi)圈，半徑5mm的外圈，該區(qū)域禁止接觸；另一部分是持拿區(qū)域，該區(qū)域持拿需戴干凈的醫(yī)用手套。（3）該干血斑卡片含有抗氧化劑（vc），酶滅活劑1-氨基苯并三唑（abt）。（4）可使用毛細(xì)血管血和靜脈血采血取樣，指尖等毛細(xì)血管采集時(shí)，提前清洗，且不能使用碘伏等不揮發(fā)性消毒劑，在干血斑卡的每個(gè)內(nèi)圈中滴一滴血，確保覆蓋整個(gè)圈且完全滲透該濾紙，同時(shí)避免血液浸染到外圈。采集過程應(yīng)該避光，若無條件，應(yīng)避免強(qiáng)光，以免對(duì)光敏性物質(zhì)產(chǎn)生影響。（5）血斑采集后，避免長時(shí)間暴露在空氣中。可采用氮吹的方式，快速干燥?；蛘卟捎谜婵諆x器，快速干燥。將收集到的干血斑，快速在液氮中冷浸，使酶失活，然后晾干。卡片不可以疊摞，用單獨(dú)的密封袋分裝后，放到-80℃冰箱冷凍。圖7提供了一個(gè)干血斑卡片的示意性實(shí)例。

20、本發(fā)明中干血斑樣品的處理方式為：用打孔器在干血斑樣品區(qū)沿著外圈線，截取一個(gè)直徑10mm小圓片，放到1.5ml離心管中，然后加入500ml含有內(nèi)標(biāo)的洗脫劑/沉淀劑。震蕩渦旋約5分鐘。15000g條件下離心10分鐘，取上清液，進(jìn)行二次離心（或用濾膜過濾），取上清液進(jìn)樣。在打孔器打孔過程中，要嚴(yán)格按照卡紙外圈進(jìn)行打孔，防止在打孔過程中樣本間相互污染而影響檢測結(jié)果。

21、本發(fā)明中代謝標(biāo)記物可用于受試體抑郁癥或情感障礙的診斷。

22、本發(fā)明中，所述抑郁癥選自輕度抑郁癥、中重度抑郁癥或雙相抑郁。為簡潔表達(dá)，本發(fā)明其他部分表述為“抑郁癥”，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，其所述技術(shù)方案的原則和目的，同樣適用于情感障礙的其他類型。

23、本發(fā)明中，“代謝標(biāo)記物”指一種過程、事件或病癥的獨(dú)特的生物或生物來源的指示物。生物標(biāo)記物可用于抑郁癥診斷。采用本發(fā)明提供的生物標(biāo)記物對(duì)抑郁癥診斷具有較高的特異性，靈敏度以及準(zhǔn)確率，本發(fā)明使抑郁癥的診斷不再完全依靠臨床醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)和問卷量表的主觀判斷，大大地提高了診斷和治療正確率。

24、本發(fā)明中，“受試體”為人類。

25、本發(fā)明的發(fā)明人基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（lc-ms/ms）的靶向代謝組學(xué)分析技術(shù)，通過對(duì)健康人群和抑郁癥患者進(jìn)行檢測，得到可以作為抑郁癥診斷的多種生物標(biāo)記物，能夠取得較高的特異性，靈敏度以及準(zhǔn)確率的效果。

26、本發(fā)明檢測干血斑紙片中的代謝物，不僅能夠有效避免對(duì)醫(yī)生主觀判斷的依賴，同時(shí)輔助抑郁癥的診斷，對(duì)于臨床意義重大；樣本存儲(chǔ)在干血斑紙片上，它有著制作收集簡便、方便運(yùn)輸、可以常溫保存等優(yōu)勢。本發(fā)明采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（lc-ms/ms）方法，對(duì)待測生物標(biāo)記物靶向定量，樣本檢測準(zhǔn)確、方便。

27、本發(fā)明在診斷抑郁癥時(shí)采用廣義線性模型(glm),曲線下的面積(auc)值為1,準(zhǔn)確度為99.30%,靈敏度為100%,特異性為98.96%。表明本發(fā)明提供的代謝性生物標(biāo)記物組合及所構(gòu)建的模型具有極好的診斷價(jià)值,顯著優(yōu)于既往類似報(bào)道。本發(fā)明提供的代謝性生物標(biāo)記物組合具有創(chuàng)新性,特別是目前并未有研究表明2-羥基丁酸與抑郁癥的診斷相關(guān)。2-羥基丁酸與能量代謝不足和葡萄糖調(diào)節(jié)受損有關(guān)。有研究表明2-羥基丁酸與在雙相障礙患者中顯著升高(,,,et?al.metabolomic?profiling?ofbipolar?disorder?by?1h-nmr?in?serbian?patients[j].metabolites,2023，13（5）:607.）。然而，并未有研究表明2-羥基丁酸可以作為抑郁癥診斷分子標(biāo)記物。本發(fā)明中增加2-羥基丁酸作為診斷分子標(biāo)記物，具有創(chuàng)新性。