本發(fā)明屬于醫(yī)藥,具體的涉及一種aβ1-42、nfl、uch-l1聯(lián)合檢測(cè)的免疫層析試劑盒及其用于阿爾茨海默癥早期診斷或腦部健康的應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、阿爾茨海默癥(alzheimer?disease;ad)患者的大腦中,老人斑是最顯著的病理特征之一,是不溶性蛋白質(zhì)異常聚集形成豐富的β片層結(jié)構(gòu)的淀粉樣纖維,并積累于腦實(shí)質(zhì)細(xì)胞間隙的構(gòu)成物。最新研究發(fā)現(xiàn),ad患者血漿中aβ1-42水平的檢測(cè)與腦脊液(csf)中aβ1-42的檢測(cè)具有同樣的意義,ad患者或淀粉樣蛋白陽性的輕度認(rèn)知障礙(mild?cognitiveimpairment,?mci)患者血漿aβ42水平也降低。這一無創(chuàng)性的檢查更易被病人接受,也易在臨床上推廣。
2、uch-l1(ubiquitin?c-terminalhydrolase-l1)是一種神經(jīng)元特異性的蛋白酶。它在神經(jīng)元的代謝和細(xì)胞死亡過程中發(fā)揮重要作用。近年來的研究表明,uch-l1在阿爾茨海默?。╝d)的診斷和治療中具有重要意義。
3、nfl(neurofilament?light)是神經(jīng)軸突損傷的標(biāo)志。神經(jīng)絲蛋白(nfs)是神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)蛋白之一,由神經(jīng)絲輕鏈蛋白(nfl)、神經(jīng)絲中鏈蛋白(nfm)、神經(jīng)絲重鏈蛋白(nfh)、α-絲聯(lián)蛋白(ina)及外周蛋白(peripherin)5種亞單元構(gòu)成。神經(jīng)絲蛋白在軸突和樹突的生長(zhǎng)、神經(jīng)傳導(dǎo)以及突觸傳遞中發(fā)揮著重要作用,從而維持穩(wěn)定的神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)速度。與神經(jīng)絲中鏈和神經(jīng)絲重鏈相比,神經(jīng)絲輕鏈可以實(shí)現(xiàn)自我組裝,其異常運(yùn)輸與組裝均可影響神經(jīng)元軸突功能,而神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸功能障礙是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的主要病理表現(xiàn)之一。在軸突損傷或神經(jīng)元變性后,nfl被釋放至細(xì)胞間隙,nfl在阿爾茨海默病中的表達(dá)較正常群體均顯著升高。nfl水平不僅可以反映阿爾茨海默疾病進(jìn)程中神經(jīng)元的損傷程度,還可以反映疾病進(jìn)程及臨床治療效果。
4、現(xiàn)有技術(shù)對(duì)阿爾茨海默癥診斷主要以血液或腦脊液為主,對(duì)身體有創(chuàng)傷,本發(fā)明對(duì)尿液進(jìn)行檢測(cè),采用aβ1-42、nfl、uch-l1?3個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè),增加對(duì)阿爾茨海默癥診斷的準(zhǔn)確度。
5、免疫層析技術(shù),是基于抗原抗體反應(yīng)的原理,通過抗體與目標(biāo)分析物的特異性結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。免疫層析技術(shù)通常采用試紙條或檢測(cè)卡的形式,將抗體固定在固相載體上,如硝酸纖維素膜或微孔板。當(dāng)樣品中的目標(biāo)分析物與固相載體上的抗體結(jié)合后,通過標(biāo)記物(如膠體金)的顯色或信號(hào)產(chǎn)生,可以直觀地觀察和判斷檢測(cè)結(jié)果。然而在生物流體中的許多復(fù)合物可能會(huì)感染檢測(cè)結(jié)果,并且為了盡早發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的變化,需要靈敏度高的檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種快速、直觀、簡(jiǎn)便、低成本的aβ1-42、nfl、uch-l1聯(lián)合檢測(cè)的免疫層析試劑盒。
2、本發(fā)明提供了一種aβ1-42、nfl、uch-l1聯(lián)合檢測(cè)的免疫層析試劑盒,包括免疫層析試紙條,所述免疫層析試紙條包括樣品墊、結(jié)合墊、包被膜,所述結(jié)合墊包含微球標(biāo)記的aβ1-42、nfl、uch-l1抗體偶聯(lián)物,所述樣品墊經(jīng)處理液處理,所述樣品墊處理液為含有0.5%-1.0%(w/v%)bsa,0.4%-0.8%(w/v%)tween-20,0.1%-0.5%(w/v%)海藻糖,0.02%-0.1%(w/v%)氯化鈣的pbs緩沖液;所述結(jié)合墊經(jīng)浸泡液處理,所述浸泡液為含有0.8%-1.2%(w/v%)bsa,1.5%-2%(w/v%)蔗糖,0.1%-0.2%?(w/v%)tween-20,0.2%-0.5%(w/v%)mes的pbs緩沖液。
3、本技術(shù)發(fā)明人發(fā)現(xiàn),在處理液中添加bsa、tween-20、海藻糖以及氯化鈣處理樣品墊后,對(duì)aβ1-42、nfl、uch-l1的抗原檢測(cè)更有效,能夠有效地降低檢測(cè)背景信號(hào)的干擾,提高三者檢測(cè)的靈敏度。所述結(jié)合墊經(jīng)浸泡液處理后,提高了檢測(cè)試劑盒的穩(wěn)定性。尤其是在浸泡液中添加mes,利用mes保證了微粒的分散穩(wěn)定性,有效防止因微粒的凝結(jié)而影響檢測(cè)信號(hào),從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
4、在一些實(shí)施方案中,所述樣品墊處理液的pbs緩沖液的濃度為10mm,ph為7.0-7.5。優(yōu)選的,ph優(yōu)選為7.2。
5、在一些實(shí)施方案中,所述樣品墊處理液為含有0.5%(w/v%)bsa,0.5%(w/v%)tween-20,0.2%(w/v%)海藻糖,0.05%(w/v%)氯化鈣的pbs緩沖液。
6、在一些實(shí)施方案中,所述浸泡液為含有1%(w/v%)bsa,2%(w/v%)蔗糖,0.1%(w/v%)tween-20,0.3%(w/v%)mes的pbs緩沖液。
7、在一些實(shí)施方案中,所述結(jié)合墊浸泡液的pbs緩沖液的濃度為10mm,ph為7.0-7.5。優(yōu)選的,ph優(yōu)選為7.2。
8、在一些實(shí)施方案中,所述結(jié)合墊還包含微球標(biāo)記的質(zhì)控抗體偶聯(lián)物,所述微球標(biāo)記的質(zhì)控抗體偶聯(lián)物選自微球標(biāo)記的兔igg抗體、雞igy抗體或鼠igg抗體。優(yōu)選的,所述微球標(biāo)記的質(zhì)控抗體偶聯(lián)物選自微球標(biāo)記的兔igg抗體偶聯(lián)物。
9、在一些實(shí)施方案中,所述包被膜為硝酸纖維素膜。
10、在一些實(shí)施方案中,所述包被膜上包括檢測(cè)用aβ1-42、nfl、uch-l1抗體和檢測(cè)用質(zhì)控抗體。
11、在一些實(shí)施方案中,所述檢測(cè)用aβ1-42、nfl、uch-l1抗體分別與微球標(biāo)記的aβ1-42、nfl、uch-l1抗體偶聯(lián)物特異性結(jié)合。所述檢測(cè)用aβ1-42、nfl、uch-l1抗體為抗aβ1-42抗體、抗nfl抗體、抗uch-l1抗體。
12、在一些實(shí)施方案中,所述檢測(cè)用質(zhì)控抗體選自羊抗兔igg抗體、羊抗雞igy抗體、羊抗鼠igg抗體。優(yōu)選的,所述檢測(cè)用質(zhì)控抗體選自羊抗兔igg抗體。
13、在一些實(shí)施方案中,所述微球?yàn)椴噬槟z微球,膠體金,膠體碳,金納米棒,磁性納米粒子或熒光微球。優(yōu)選的,所述微球選自彩色乳膠微球。
14、在一些實(shí)施方案中,所述微球的粒徑為100~500nm。優(yōu)選的,所述微球的粒徑為200~300nm。進(jìn)一步,所述微球選自100nm粒徑乳膠微球和300nm粒徑微球,兩者重量比3:1~5:1混合(優(yōu)選4:1)。通過選取不同粒徑的微球制備aβ1-42、nfl、uch-l1微球偶聯(lián)物,有效解決了粒徑小的微球能檢測(cè)出高濃度的抗原而在低濃度時(shí)無法檢測(cè),粒徑大的微球能檢測(cè)出低濃度的抗原,而在高濃度出無法檢測(cè)的技術(shù)問題,本發(fā)明提供的技術(shù)方案選擇兩種粒徑微球可以同時(shí)檢測(cè)出低濃度和高濃度的抗原,檢測(cè)范圍可達(dá)最低可達(dá)0.1ng/ml,最高可達(dá)1000ng/ml。
15、進(jìn)一步,優(yōu)選的,所述微球?yàn)榘被暇厶前奈⑶?。采用氨基葡聚糖?duì)微球表面進(jìn)行處理后,與未包裹的微球相比,可有效地消除非特異性結(jié)合,提高檢測(cè)信號(hào)的信噪比,同時(shí)穩(wěn)定性得到改善。
16、在一些實(shí)施方案中,所述微球標(biāo)記的aβ1-42、nfl、uch-l1抗體偶聯(lián)物溶于含有0.5%(w/v%)bsa,0.5%(w/v%)tween-20的pbs緩沖液,形成濃度為0.01%~0.2%(w/v%)的微球混合溶液。優(yōu)選的,形成濃度為0.1%(w/v%)的微球混合溶液。本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),低于0.01%(w/v%)靈敏度達(dá)不到;高于0.2%(w/v%)微球釋放效果不好,精密度變差。
17、進(jìn)一步,所述微球混合溶液噴涂于所述結(jié)合墊上,烘干。優(yōu)選的,噴涂量為30-50μl/cm。更優(yōu)選的,噴涂量為40μl/cm。
18、在一些實(shí)施方案中,烘干溫度為35-40℃,優(yōu)選的,烘干溫度為37℃,烘干時(shí)間為16~24小時(shí)。
19、在一些實(shí)施方案中,所述包被膜上包被有aβ1-42、nfl、uch-l1抗體三條檢測(cè)線;或者所述包被膜上包被有aβ1-42、nfl、uch-l1抗體任意一條或者兩條檢測(cè)線,將包括不同檢測(cè)線的包被膜安裝在一起實(shí)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)。
20、在一些實(shí)施方案中,所述微球標(biāo)記的(例如aβ1-42、nfl、uch-l1、兔igg抗體)抗體偶聯(lián)物的制備步驟包括:將微球與上述抗體進(jìn)行反應(yīng),封閉后超聲即可。
21、在一些實(shí)施方案中,所述微球標(biāo)記的(例如aβ1-42、nfl、uch-l1)抗體偶聯(lián)物的制備步驟包括:
22、將微球溶于mes緩沖溶液中,離心,除去上清;
23、加入mes緩沖溶液,添加nhs和/或edc活化劑,反應(yīng),離心,除去上清;
24、加入pbs緩沖液中溶解,加入抗體反應(yīng),離心,除去上清;
25、加入封閉試劑,進(jìn)行封閉處理,離心,除去上清;
26、加入復(fù)溶試劑復(fù)溶,得到微球標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物。
27、在一些實(shí)施方案中,步驟2)中,所述活化劑選自nhs和/或edc;nhs終濃度為0.02-0.1mg/ml。優(yōu)選nhs終濃度為0.05mg/ml;edc終濃度為0.02-0.1mg/ml,優(yōu)選edc終濃度為0.05mg/ml。
28、在一些實(shí)施方案中,步驟2)中,所述微球與所述活化劑避光反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間20-60min;優(yōu)選30min。
29、在一些實(shí)施方案中,步驟3)中,所述微球與抗體反應(yīng)2-5小時(shí),優(yōu)選3小時(shí)。
30、在一些實(shí)施方案中,步驟4)中,所述封閉試劑為含有0.5%(w/v%)甘氨酸的ph為7.2的10mm?pbs緩沖液。本技術(shù)發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過程中也嘗試過封閉試劑中不含0.5%(w/v%)甘氨酸pbs緩沖液,總體來說,加入含有甘氨酸的pbs溶液以終止活化反應(yīng),有效避免了非特異性反應(yīng)的發(fā)生,保證了aβ1-42、nfl、uch-l1抗體的穩(wěn)定性以及活性。
31、在一些實(shí)施方案中,步驟5)中,所述復(fù)溶試劑為含有0.5%bsa的pbs緩沖液。所述pbs緩沖液的ph為7-7.5,優(yōu)選ph為7.2。本技術(shù)發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過程中也嘗試過復(fù)溶試劑中含有不同配比的bsa,其中bsa的含量過高,比如2%,總體來說信號(hào)值都不如低濃度的效果好。
32、優(yōu)選的,在步驟2)中,加入mes緩沖溶液后,先添加氨基葡聚糖,再添加nhs和/或edc的活化劑,反應(yīng),離心,除去上清。通過氨基葡聚糖包裹的微球,可有效地消除非特異性結(jié)合,提高檢測(cè)信號(hào)的信噪比,同時(shí)穩(wěn)定性得到改善。
33、在一些實(shí)施方案中,所述微球標(biāo)記的(例如aβ1-42、nfl、uch-l1)抗體偶聯(lián)物的制備步驟包括:
34、1)取0.1ml?固含量為0.1%-20%(w/v)微球,加入0.9ml?ph為6.0?的25mm?mes緩沖溶液,旋渦混勻后,10000-12000?rpm?離心30分鐘,去除上清;
35、2)向步驟1)中加入ph為6.0?的25mm?mes緩沖溶液?1ml,100w超聲混勻,加入edc和nhs,終濃度均為0.05mg/ml;旋渦混勻,避光反應(yīng)30分鐘;12000-15000?rpm?離心30分鐘,去除上清;
36、3)向步驟2)加入ph為7.2?的10mm?pbs緩沖液1ml,100w超聲混勻,然后加入抗體0.1mg,旋渦混勻,靜置反應(yīng)3小時(shí),離心管10000-12000?rpm?離心30分鐘,去除上清;
37、4)向步驟3)加入含有0.5%(w/v%)甘氨酸的ph為7.2?的10mm?pbs?1ml;旋渦混勻后,靜置反應(yīng)30min;12000-15000?rpm?離心30分鐘;
38、5)用含0.5%?bsa的ph為7.2?的10mm?pbs緩沖液1ml重懸微球,得到微球標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物。
39、另一方面,本發(fā)明還提供上述免疫層析試劑盒在檢測(cè)樣本中抗原的應(yīng)用,所述抗原優(yōu)選為蛋白,例如aβ1-42、nfl和uch-l1。所述樣本為人的血液、尿液、腦脊液、糞便、痰液或組織液。
40、有益效果:
41、(1)本發(fā)明所述的免疫層析試劑盒能在較短的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)同時(shí)快速檢測(cè)多種抗原,不僅檢測(cè)靈敏度高,而且能夠?qū)崿F(xiàn)一步法上樣的操作,極大提高操作的精密度和準(zhǔn)確性,減少人為操作的誤差,操作更簡(jiǎn)單,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
42、(2)本發(fā)明聯(lián)合檢測(cè)aβ1-42、nfl、uch-l1。通過對(duì)樣品墊以及結(jié)合墊進(jìn)行預(yù)處理,減少了三種成分之間的相互干擾,檢測(cè)背景信號(hào)低,靈敏度高,且穩(wěn)定性良好。