本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測豬瘟病毒igg抗體競爭elisa試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

豬瘟(csf)是由豬瘟病毒(csfv)引起的是嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)，可導(dǎo)致各生長階段豬的死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟損失。csfv同屬還包括有牛病毒性腹瀉病毒和羊邊界病毒，其中csfv與牛病毒性腹瀉病毒血清之間存在交叉反應(yīng)。csfv是有囊膜的rna病毒，基因組長約12.3kb，含一個開放式閱讀框架(orf)，翻譯成一條約含3898個氨基酸殘基的多聚前體蛋白，其中c、erns(e0)、e1、e2為結(jié)構(gòu)蛋白，e2蛋白是研制csfv血清抗體診斷試劑的首選抗原。

近年來，國內(nèi)自主研發(fā)的用于檢測csfv血清抗體的試劑盒在豬瘟防控方面起到了重要作用，但核心技術(shù)缺乏直接導(dǎo)致國產(chǎn)診斷試劑與國外同類產(chǎn)品之間存在顯著差異，不僅體現(xiàn)在價格上，還存在產(chǎn)品的穩(wěn)定性差，包括批間和批內(nèi)的變異系數(shù)過大、試劑的保質(zhì)期較短、操作程序不友好等問題。更為重要的是，出口csfv抗體檢測試劑盒的國家都是“滅豬瘟的地區(qū)”，這些試劑盒均以抗體定性為判定標(biāo)準(zhǔn)，不適合于我國豬瘟的防控現(xiàn)狀。我國采取接種豬瘟弱毒疫苗的免疫防控策略，豬瘟疫苗免疫覆蓋率幾乎達到100％，需要的是能夠評估疫苗免疫過程中抗體消長規(guī)律的診斷產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測豬瘟病毒igg抗體競爭elisa試劑盒，以解決現(xiàn)有csfv血清抗體檢測elisa試劑盒存在的穩(wěn)定性差和保質(zhì)期短等問題。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用定量檢測豬瘟病毒igg抗體競爭elisa試劑盒進行檢測的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：一種定量檢測豬瘟病毒igg抗體競爭elisa試劑盒，將特異性鑒定和篩選來自豬瘟病毒疫苗株c-株編碼的e2蛋白兩個重復(fù)的抗原結(jié)構(gòu)域a通過柔性氨基酸接頭、半胱氨酸、疏水氨基酸進行融合串聯(lián)，并在大腸桿菌e.coli中成功獲得重組表達蛋白，重組蛋白命名為r2e2，以其作為抗原建立的定量檢測抗豬瘟病毒e2蛋白igg抗體競爭elisa試劑盒；試劑盒包括抗原包被板、血清樣品稀釋液、洗滌液、tmb底物液、終止液；抗原包被板包括預(yù)包被r2e2抗原、抗原穩(wěn)定劑、酶標(biāo)板、封閉液、標(biāo)準(zhǔn)igg樣品；所述抗原為：5`-domaina-tgt-da15-linker-da15-tgt-domaina-3`或氨基酸：5`-domaina-cys-lys5-linker-lys5-cys-domaina-3`。此為優(yōu)化的抗原組合模式，可以高效的結(jié)合血清中的抗csfv病毒的igg抗體；抗原在大腸桿菌中實現(xiàn)可溶性表達，并進行純化、回收。(制備研制elisa試劑盒的重組抗原

優(yōu)選的，酶標(biāo)板所包被抗原的包被濃度為1ng～10ng/ml。獲得最佳的抗原包

被量，有助于節(jié)約成本，降低非特異性反應(yīng)的發(fā)生。

優(yōu)選的，抗原穩(wěn)定劑組成為，體積濃度為0.01％多聚甲醛pbs緩沖液，50μl/孔，室溫，作用5min。0.01％多聚甲醛可很好固定r2e2抗原，同時不會影響其與igg抗體的結(jié)合能力，確?？乖诒Ｙ|(zhì)期內(nèi)不發(fā)生降解，延長試劑盒的保存期限.

優(yōu)選的，封閉液組分為質(zhì)量濃度為0.5-10％蔗糖、質(zhì)量濃度1.0-8.0％明膠、質(zhì)量濃度0.1-6.0％的酪蛋白，1×pbst，ph7.2，200μl/孔。目的：封閉液中的明膠、酪蛋白和海藻糖可以結(jié)合酶標(biāo)板中抗原未能吸附的剩余位置，使整個孔底部都被蛋白覆蓋，阻斷待檢測樣品中存在的蛋白或者抗體與酶標(biāo)板中剩余位置發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致非特異性反應(yīng)的發(fā)生，并且添加的海藻糖是一種耐熱保護劑，可以抵抗因溫度變化導(dǎo)致包被板子上的抗原包降解，延長包被板的保存期限。

優(yōu)選的，hrp-igg酶標(biāo)記抗體在elisa中的工作濃度為1∶10,000～1∶100,000，hrp-igg質(zhì)量含量為0.425ng/ml～4.25ng/ml。獲得最佳的hrp-igg競爭抗體的工作濃度。

優(yōu)選的，標(biāo)準(zhǔn)igg樣品為0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml樣品和待檢測血清樣本，均以50μl/孔加入到對應(yīng)孔中，同時加入100μl/孔酶標(biāo)記抗體hrp-igg，37℃孵育60min。用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本中的igg質(zhì)量含量，從而獲得樣品中抗csfv的igg抗體的質(zhì)量含量。

優(yōu)選的，tmb底物液反應(yīng)體積為100μl/孔，避光室溫作用25-30min顯色，tmb底物液為底物a和底物b按照1:1混合使用，底物a為5mg/mldmso溶液；底物b為500ml雙蒸水溶解13.608gch3coona·3h2o，用1mol/l檸檬酸調(diào)ph至6.0，加入1ml30％雙氧水，定容至1000ml。tmb在hrp-igg上的hrp在雙氧水的催化下顯色，顏色的深淺與樣品中靶抗體含量有關(guān)。

優(yōu)選的，所述的終止液為1.5mol/lh2so4，50μl/孔。

一種用定量檢測豬瘟病毒igg抗體競爭elisa試劑盒進行檢測的方法，包括以下步驟：

(1)樣品檢測，在相應(yīng)微孔中分別加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品和待測血清標(biāo)本，然后在所有孔中加入100μl/孔酶結(jié)合物hrp-igg；

(2)孵育，加樣完成后，用pet封口貼密封微孔板，使用微量振蕩器震動30秒或者手工在實驗操作臺上搖晃60秒混勻，將已密封微孔板放置于37℃孵育60min；

(3)洗滌，孵育完畢后，棄盡微孔內(nèi)液體，1×pbst洗板5次，洗滌結(jié)束后拍干微孔壁內(nèi)殘余液體；

(4)tmb顯色，底物a和底物b按1∶1比例混勻，100μl/孔，混合30秒，室溫避光靜置30min顯色；

(5)終止，取出微孔板，此時明顯看到各微孔內(nèi)呈現(xiàn)不均一的藍色，每孔加入50μl的1.5molh2so4終止液，輕微混勻，此時各微孔內(nèi)的藍色漸變?yōu)辄S色；(6)結(jié)果判定，實驗結(jié)果成立條件為：當(dāng)0μg標(biāo)準(zhǔn)品od450nm＞1.8，且標(biāo)準(zhǔn)品od450nm吸光度值按照0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml呈遞減趨勢，判定實驗成立。

優(yōu)選的，結(jié)果計算方法為，

(1)百分結(jié)合率計算公式：設(shè)0μgigg標(biāo)準(zhǔn)品管計數(shù)為b0，各標(biāo)準(zhǔn)管或樣品管計數(shù)為b，b/b0×100％

(2)logit值計算公式：logit＝ln(b/b0)/(1－b/b0)

(3)繪圖計算：以標(biāo)準(zhǔn)濃度取log值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的logit值為縱坐標(biāo)在普通坐標(biāo)紙上或以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的b/b0為縱坐標(biāo)在logit-log坐標(biāo)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)待測樣品的b/b0從坐標(biāo)紙上查出樣品的濃度值；如果使用普通坐標(biāo)紙，查出的數(shù)值應(yīng)取反對數(shù)才是最后的濃度值；在log-logit坐標(biāo)紙上繪圖，坐標(biāo)紙上橫軸從左至右第一個1-9表示為第一個10進位，第二個1-9表示為第二個10進位；第三個1-9表示為第三個10進位；坐標(biāo)紙縱軸為百分比，即各標(biāo)準(zhǔn)吸光值的百分結(jié)合率；畫一條通過各點的直線，要求盡可能多的點在線上，同時剩余的點均勻分布在直線的兩邊；樣品也同樣由吸光值計算百分結(jié)合率，再從縱軸上的相應(yīng)結(jié)合率找到直線上的點，此點對應(yīng)的橫坐標(biāo)濃度即為樣品的濃度；

(4)血清樣品反應(yīng)的結(jié)論為：

4.1當(dāng)弱毒疫苗免疫個體igg抗體質(zhì)量含量≥100μg/ml，免疫合格；

4.2當(dāng)弱毒疫苗免疫個體igg抗體質(zhì)量含量在20μg/ml～50μg/ml免疫不合格，建議加強免疫后再進行igg抗體檢測；

4.3當(dāng)弱毒疫苗免疫個體igg抗體質(zhì)量含量≤20μg/ml，免疫失敗。

本發(fā)明定量檢測抗豬瘟病毒e2蛋白igg抗體競爭elisa試劑盒，可對豬瘟疫苗免疫產(chǎn)生的抗e2蛋白igg抗體進行定量檢測。更為關(guān)鍵的是，本試劑盒的檢測結(jié)果能夠反應(yīng)接種疫苗過程中，機體抗csfv血清igg抗體變化規(guī)律，為養(yǎng)豬戶csf防控提供科學(xué)合理的技術(shù)支持。

研究表明，重組r2e2與完整csf病毒抗原具有相似的結(jié)合豬瘟血清抗體功能，酶標(biāo)板所包被抗原在間接elisa試驗中證實與牛病毒性腹瀉陽性血清無交叉反應(yīng)，為csfv血清抗體特異性抗原。同時，將重組r2e2抗原制備的兔抗高免血清中的igg，通過碘酸鈉法標(biāo)記上辣根過氧化物酶(hrp)，以其作為競爭抗體，研制可定量檢測csf病毒igg抗體競爭elisa試劑盒。田間血清樣品檢測結(jié)果證實，本發(fā)明所涉及方法可定量檢測csf疫苗免疫后血清中igg的含量，為制定合理的豬瘟疫苗免疫計劃提供可靠檢測方法。

附圖說明

圖1是一種定量檢測豬瘟病毒igg抗體競爭elisa試劑盒的實驗原理圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明做進一步說明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

采用人工基因合成方式獲得融合e2抗原表位基因序列。csfv疫苗株e2基因抗原結(jié)構(gòu)域a區(qū)段(domaina:766aa～866aa)；兩個重復(fù)抗原結(jié)構(gòu)域區(qū)段用柔性接頭(linker)序列(ggtggcggaggatccggtggcggaggatcc，編碼氨基酸ggggsggggs)連接；linker的5`和3`端各添加15個連續(xù)的a(da15，編碼親水性5個賴氨酸，lys)和1個半胱氨酸(cys)，確保兩個結(jié)構(gòu)域獨自發(fā)揮功能。其中cys和lys的組合可顯著提高水溶性蛋白表達效率，融合基因模式為：5`-domaina-tgt-da15-linker-da15-tgt-domaina-3`(氨基酸表示為：5`-domaina-cys-lys5-linker-lys5-cys-domaina-3`)。將人工合成目的核苷酸序列酶切，與pgex6p-1表達載體連接，重組質(zhì)粒命名為r2e2，轉(zhuǎn)化bl21(star)感受態(tài)細(xì)胞，iptg誘導(dǎo)表達和親和層析純化重組融合蛋白，作為檢測方法的包被抗原。

1、重組r2e2抗原的制備

1.1基因合成：以豬瘟兔化弱毒疫苗株的e2基因作為親本基因，截取e2基因抗原結(jié)構(gòu)域a區(qū)段(766aa～866aa)，兩端加ecori和xhoi限制性酶切位點，將設(shè)計好基因組合5`-domaina-tgt-da15-linker-da15-tgt-domaina序列送上海捷瑞生物工程有限公司進行基因合成。

1.2重組表達載體的構(gòu)建和鑒定

(lb液體和固體培養(yǎng)基，抗性/濃度，amp⁺/100μg/ml)

將r2e2片段從克隆載體上酶切、回收、純化，與pgex6p-1載體按照載體和目的片段摩爾比≈1∶3混合后用t4dna連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化dh5a感受態(tài)細(xì)胞，在lb平板培養(yǎng)12～18h。挑取單克隆，增菌后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和pcr鑒定，鑒定得到的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌株bl21(star)感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒命名為r2e2。

1.3r2e2蛋白重組表達和鑒定

1)挑取5個單克隆菌株，接種到5個5mllb液體培養(yǎng)基試管中，220r/min，37℃過夜振蕩培養(yǎng)；然后分別從5管中取50μl菌液轉(zhuǎn)接新的lb液體培養(yǎng)基試管中，220r/min，培養(yǎng)2.5h至od600≈0.5～0.6，在其中的4個管中加入iptg的終濃度分別為0.3mol/l、0.4mol/l、0.5mol/l、1.0mol/l,剩余1管作為誘導(dǎo)對照，37℃200r/min振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。

2)sds-page鑒定重組r2e2蛋白：收集菌體，超聲，10000r/min離心3min，在上清和沉淀中分別加入100μltris(ph6.8)，100℃煮5min，10000r/min離心15min。配制12％的sds-page蛋白質(zhì)電泳凝膠，每個樣品加10μl，加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量marker6μl，80v濃縮膠，120v分離膠，膠塊考馬斯亮藍染色，脫色后觀察到r2e2蛋白實現(xiàn)可溶性表達。

3)westernblotting：結(jié)果表明，重組r2e2融合蛋白可以被豬瘟陽性血清識別，具有良好的特異性。

4)間接elisa實驗血清抗體檢測比較重組r2e2與csfv抗原結(jié)合活性

將濃度為3.85μg/ml純化r2e2重組蛋白包被96孔板；同時以滅活的csfv疫苗抗原(細(xì)胞源)包被elisa板作為陽性對照。

按照間接elisa操作模式，以5份(s1～s5)已知csf抗體陽性血清(p)和已知無豬瘟特異性抗體的1份陰性血清(n)作為第一抗體，以2份牛源牛病毒性腹瀉(bvdv)抗體陽性血清(b1,b2)和1份陰性牛血清(b0)作為交叉反應(yīng)樣品，上述樣品均作1∶50稀釋與兩種抗原相互作用,血清作2孔重復(fù)，重復(fù)測3次，取平均值計算p/n值。以辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記兔抗豬igg為第二抗體，tmb為底物，酶標(biāo)儀吸光度od450nm波長讀結(jié)果，計算結(jié)果見表1。

表1：重組r2e2抗原和豬瘟全病毒抗原活性比較

驗證重組抗原r2e2的方法，依據(jù)間接elisa血清抗體檢測方法判斷公式：陽性血清判定標(biāo)準(zhǔn)：陽性血清od450值/陰性血清od450nm值〉2.1(即p/n>2.1)，該血清樣品即為陽性。表1所描述的p/n值結(jié)果說明，重組r2e2抗原和csfv疫苗抗原具有相近的與陽性血清反應(yīng)的能力，重組r2e2抗原可以替換全病毒抗原用于研制csfv血清抗體的檢測方法。根據(jù)表1計算bvdv血清樣品與r2e2抗原和csfv疫苗抗原檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因為r2e2是由串聯(lián)csfv特異性抗原表位組成，與bvdv陽性血清無交叉反應(yīng)；反之，因csfv完整抗原e2蛋白上存在與bvdv血清抗體交叉反應(yīng)的抗原表位，所以導(dǎo)致結(jié)果呈陽性。綜上，利用串聯(lián)2個重復(fù)csfv特異想抗原表位的r2e2蛋白作為檢測抗原，不但可以用于csfv血清抗體檢測，還可以消除與bvdv陽性血清的交叉反應(yīng)。

2、兔抗r2e2抗原高免血清、igg純化、標(biāo)準(zhǔn)品制備及hrp標(biāo)記igg

2.1兔抗r2e2抗原高免血清制備

選用4kg左右健康清潔級新西蘭白兔3只，首免用弗氏完全佐劑乳化抗原，120μg/只背部皮下和后肢肌肉多點免疫。加強免疫用弗式不完全佐劑乳化30μg抗原/只，每2～3周加強免疫一次，直到瓊脂糖擴散實驗達到1∶64時(使用抗原為豬瘟疫苗毒抗原)，即可收集血清用于igg抗體純化。

2.2igg抗體的純化(硫酸銨沉淀法)

(a)血清準(zhǔn)備：取20ml兔血清，加生理鹽水20ml，逐滴加入(nh4)2so4飽和溶液10ml至20％(nh4)2so4溶液，邊加邊攪拌充分混合，靜置30min。

(b)除纖維蛋白：4℃，3000r/min，離心20min，棄去沉淀，既得除去纖維蛋白的血清。

(c)(nh4)2so4沉淀igg：在步驟(b)處理后的上清液中再加(nh4)2so4飽和溶液30ml，使成50％(nh4)2so4溶液，充分混合，靜置30min，而后3000r/min，4℃離心20min，棄上清。

(d)溶解沉淀：加20ml生理鹽水溶解沉淀，加入保存于4℃的(nh4)2so4飽和溶液10ml，使成33％(nh4)2so4，充分混合，靜置30min。4℃，3000r/min，離心20min，棄上清，以除去白蛋白。重復(fù)此步驟，2-3次。用10ml生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋，在常水中透析過夜，然后在生理鹽水中于4℃透析24h，過程中換液數(shù)次。離心去除雜蛋白，上清液即為粗提igg。

(e)獲取高純度igg：過deae－纖維素層析柱。以0.01mol/lpbs(ph7.4)和0.03mol/lnacl洗脫，收集洗脫液，即為高純度igg抗體。

(f)igg純度鑒定--免疫電泳鑒定：孔內(nèi)加待測樣品，電泳后，在槽內(nèi)加抗igg血清，瓊脂擴散24h，觀察結(jié)果。出現(xiàn)一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于γ—球蛋白區(qū)，證明igg純度符合實驗預(yù)期。

(g)igg的定量及保存

用紫外吸收法定量純化后igg含量。根據(jù)公式(mg/ml)＝1.55×a280—0.75×a260計算含量。分裝純品igg1mg/ml，凍干后4℃保存。

2.3用于定量igg標(biāo)準(zhǔn)品的制備。

將純品igg用0.1molpbs(ph7.2)稀釋成0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml等4個濃度，作為競爭elisa定量血清樣品中igg抗體含量的標(biāo)準(zhǔn)品。

2.4制備hrp-igg競爭抗體

稱取5mghrp溶解于1ml蒸餾水中，加入0.2ml新配的0.1mnaio4溶液，室溫下避光攪拌20min。將上述溶液裝入透析袋，在1mm的醋酸鈉(ph4.4)緩沖液4℃過夜透析。加20μl0.2m碳酸鹽(ph9.5)緩沖液，調(diào)hrp溶液ph值到9.0～9.5。立即在1ml0.01m碳酸鹽緩沖液中再次加入5mgigg，室溫避光輕輕攪拌2小時。加0.1ml新配的4mg/mlnabh4液，混勻，置4℃2h。將上述液裝入透析袋中，對0.15mpbs(ph7.4)透析，4℃過夜。在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4℃沉淀1h。3000rpm/min,離心30min，棄上清。沉淀物用半飽和(nh4)2so4洗二次，沉淀物溶于0.15m的pbs(ph7.4)中。將上述溶液裝入透析袋中，對0.15m的pbs(ph7.4)緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm/min,離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，加入40％甘油于-20℃保存。

利用公式計算hrp-igg量：igg量(mg/ml)＝(od280nm-od403nm×0.3)×0.62將定量的酶標(biāo)記抗體，1ml/瓶分裝標(biāo)定好效價的hrp-igg抗體，標(biāo)簽上注明批次、效價、制備時間和數(shù)量，置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5hrp-igg競爭抗體工作濃度滴定

用棋盤滴定法滴定“2.4”hrp標(biāo)記igg抗體在elisa中工作濃度，確定工作濃度為1∶100,000(hrp-igg質(zhì)量含量為4.25ng/ml)。

3、一種定量檢測豬瘟病毒igg抗體競爭elisa方法的建立

3.1r2e2抗原包被和固定

1)抗原包被

用50mmol/l碳酸鹽緩沖液(ph9.6)將純化r2e2抗原稀釋成4.26ng/ml,100μl/孔加入酶標(biāo)板中，封口膜密封，置室溫孵育24h。棄去孔內(nèi)液體，300μl/孔1×pbst(ph7.2)洗滌液洗滌3次，最后一次拍干。

2)抗原固定

加入50μl/孔抗原穩(wěn)定緩沖液(體積濃度為0.01％多聚甲醛，0.01mpbs，ph7.2)，室溫作用5min，用1×pbst洗滌5次，拍干。

3)封閉抗原預(yù)包被板

加入200μl/孔封閉液(0.8％蔗糖、質(zhì)量濃度1.25％明膠、質(zhì)量濃度0.8％酪蛋白，1×pbst，ph7.2)室溫作用30min，1×pbst洗滌3次后拍干，徹底干燥微孔板后，加入干燥劑和抽真空密封，即為抗原包被板。

3.2樣品檢測

1)加樣

在相應(yīng)微孔中分別加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品(建議：縱向加樣：0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml)和待測血清標(biāo)本，然后在所有孔中加入100μl/孔酶結(jié)合物(hrp-igg)。

2)孵育

加樣完成后，用pet封口貼密封微孔板，使用微量振蕩器震動30秒或者手工在實驗操作臺上向左右輕輕平行搖晃60秒混勻。將已密封微孔板放置于37℃孵育60min。

3)洗滌

孵育完畢后，棄盡微孔內(nèi)液體，1×pbst洗板5次。洗滌結(jié)束后用吸水紙拍干微孔壁內(nèi)殘余液體，并將微孔板外部液體與指紋擦拭干凈。

4)tmb顯色

底物a和底物b按1∶1比例混勻(底物溶液a：tmb濃度為5mg/mldmso溶液；底物b：500ml雙蒸水溶解13.608gch3coona·3h2o，用1mol/l檸檬酸調(diào)ph至6.0，加入1ml30％雙氧水，定容至1000ml)，100μl/孔，自動或手動混合30秒，室溫避光靜置30min顯色。

5)終止

取出微孔板，此時可以明顯看到各微孔內(nèi)呈現(xiàn)不均一的藍色，每孔加入50μl的1.5molh2so4終止液，輕微混勻。此時各微孔內(nèi)的藍色漸變?yōu)辄S色。

6)測量

將已終止反應(yīng)的微孔板置于酶標(biāo)儀讀數(shù)槽內(nèi)，使用檢測波長450nm與參考波長630nm的雙波長測量讀取各孔的吸光度值。數(shù)據(jù)讀取應(yīng)在30min內(nèi)完成。

3.3結(jié)果判定

1)實驗成立條件

當(dāng)0μg標(biāo)準(zhǔn)品od450nm＞1.8，并且標(biāo)準(zhǔn)品od450nm吸光度值按照0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml呈遞減趨勢，判定實驗成立。

2)結(jié)果計算

●百分結(jié)合率計算公式：設(shè)s0(0μg/ml)管計數(shù)為b0，各標(biāo)準(zhǔn)管或樣品管計數(shù)為b。b/b0×100％

●logit值計算公式：logit＝ln(b/b0)/(1－b/b0)

●手工繪圖計算：以標(biāo)準(zhǔn)濃度取log值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的logit值為縱坐標(biāo)在普通坐標(biāo)紙上或以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的b/b0為縱坐標(biāo)在logit-log坐標(biāo)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線(理想化時是一條直線)。根據(jù)待測樣品的b/b0可以從坐標(biāo)紙上查出樣品的濃度值。如果使用普通坐標(biāo)紙，查出的數(shù)值應(yīng)取反對數(shù)才是最后的濃度值。在log-logit坐標(biāo)紙上繪圖，坐標(biāo)紙上橫軸從左至右第一個1-9表示為第一個10進位，第二個1-9表示為第二個10進位。第三個1-9表示為第三個10進位。坐標(biāo)紙縱軸為百分比，即各標(biāo)準(zhǔn)吸光值的百分結(jié)合率。畫一條通過各點的直線，要求盡可能多的點在線上，同時剩余的點均勻分布在直線的兩邊。樣品也同樣由吸光值計算百分結(jié)合率，再從縱軸上的相應(yīng)結(jié)合率找到直線上的點，此點對應(yīng)的橫坐標(biāo)濃度即為樣品的濃度。

3)結(jié)果判定

◆當(dāng)弱毒疫苗免疫個體igg抗體質(zhì)量含量≥25μg/ml，免疫合格；

◆當(dāng)弱毒疫苗免疫個體igg抗體質(zhì)量含量在15μg/ml～25μg/ml免疫不合格，建議加強免疫后再進行igg抗體檢測；

◆當(dāng)弱毒疫苗免疫個體igg抗體質(zhì)量含量＜15μg/ml，免疫失敗。

4、田間豬血清樣品檢測實例

用本發(fā)明所涉及elisa檢測試劑抽檢豬瘟疫苗免疫首免21天時的37份育肥豬血清樣品的抗e2蛋白的igg抗體。依據(jù)本試劑盒檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4份igg抗體含量在15μg/ml～25μg/ml之間，屬于疫苗免疫不合格范疇，占被檢血清樣品總數(shù)的10.81％；igg抗體含量大于25μg/ml免疫合格樣品有33份樣品，占樣品總數(shù)89.19％，沒有檢測到抗e2抗體igg質(zhì)量含量＜15μg/ml的樣品(表2)。本檢測結(jié)果符合我國豬瘟疫苗的免疫實際情況。我國2016年之前，我國采取豬瘟疫苗強制免疫計劃，豬瘟疫苗免疫覆蓋率幾乎達到100％，抗體合格率在85％以上，已經(jīng)有效控制了豬瘟對豬只健康的危害。豬瘟防疫已經(jīng)植根于是每個養(yǎng)豬戶的防疫計劃中，即使國家相關(guān)部門不強制進行疫苗接種，養(yǎng)豬戶也會對所有豬定期進行疫苗免疫，預(yù)防豬瘟發(fā)生。

表2定量檢測豬瘟病毒igg抗體競爭elisa試劑盒田間檢測實例