本發(fā)明屬于煙草制品添加劑理化分析領(lǐng)域，具體是一種適用于口含煙中對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的測(cè)定。

背景技術(shù)：

對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)又稱為尼泊爾金酯類物質(zhì)，包括甲酯，乙酯，丙酯等，是一種廣譜，高效防腐劑。目前廣泛使用于食品，化妝品，家具，紡織等日化領(lǐng)域，甚至在嬰兒用品（如咬咬膠）也檢測(cè)到它的存在。對(duì)羥基苯甲酸酯具有酚羥基結(jié)構(gòu)，在ph3-8的范圍內(nèi)均有較好的抑菌作用。在實(shí)際應(yīng)用中，單獨(dú)使用一種酯的現(xiàn)象較為少見(jiàn)，多為幾種酯的混合使用。

以前，研究認(rèn)為尼泊爾金酯毒性不大，但是，1998年，routledge等首次發(fā)現(xiàn)了尼泊爾金酯具有雌激素活性，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)尼泊爾金酯具有低毒性的觀點(diǎn)提出了挑戰(zhàn)；在化妝品領(lǐng)域，最新研究表明，含尼泊爾金酯的膏霜作用于皮膚上后，在紫外線的照射下，會(huì)加速皮膚老化，因此，目前很多高端化妝品開(kāi)始使用別的替代品來(lái)進(jìn)行防腐。

不同于日用品，食品中的尼泊爾金酯類物質(zhì)是直接進(jìn)入人體內(nèi)的。如果過(guò)多的食入含有尼泊爾金酯的食物，會(huì)導(dǎo)致部分沒(méi)有被體內(nèi)組織酶水解成代謝產(chǎn)物——對(duì)羥基苯甲酸，而直接被吸收儲(chǔ)存在人體組織中，從而造成多種疾病之源。

口含煙是無(wú)煙氣煙草制品的一種，其主體也是煙草，主要通過(guò)口腔含服對(duì)其進(jìn)行吸食。這類產(chǎn)品為了保證口感，含水率較卷煙高，有的甚至加入大量的保潤(rùn)劑保持其濕潤(rùn)狀態(tài)。如果環(huán)境溫度較高，極易產(chǎn)生霉菌等腐敗物質(zhì)，因此，產(chǎn)品中會(huì)加入一定量的防腐成分。我國(guó)目前對(duì)于此類防腐劑在食品中的限量在10~1500mg/kg范圍內(nèi)（按照不同的對(duì)羥基苯甲酸酯進(jìn)行分類，且以對(duì)羥基苯甲酸鹽計(jì)）。目前各個(gè)國(guó)家并沒(méi)有關(guān)于口含煙的成分安全監(jiān)控系統(tǒng)性文件的頒布，對(duì)于其潛在的危險(xiǎn)成分（如尼泊爾金酯等防腐劑）檢測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)于尼泊爾金酯類物質(zhì)的檢測(cè)，有使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，液相色譜，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等分析技術(shù)。gb/t5009.31-2003即采用氣相色譜進(jìn)行測(cè)定，但是只測(cè)定兩種酯（甲酯和丙酯），還有的采用氣相色譜質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)定前對(duì)其進(jìn)行衍生化處理，操作較為繁瑣。液相色譜及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜可以實(shí)現(xiàn)尼泊爾金酯類物質(zhì)的準(zhǔn)確測(cè)定，但是液相色譜測(cè)定中需要使用大量的有機(jī)溶劑，對(duì)操作者和環(huán)境的危害較大。合相色譜是2012年由waters公司推出的全新色譜技術(shù)，其主要的流動(dòng)相為壓縮二氧化碳（co2），與液體流動(dòng)相或載氣相比，降低了成本和毒性，且分析速度快，與質(zhì)譜檢測(cè)器串聯(lián)后，可以實(shí)現(xiàn)多種成分的準(zhǔn)確測(cè)定。采用合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)口含煙中的尼泊爾金酯類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術(shù)狀況而提出的一種適用于口含煙中對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的測(cè)定，該方法前處理步驟較為簡(jiǎn)單，所使用的有機(jī)溶劑較少；測(cè)定過(guò)程所使用的有機(jī)溶劑量也很少，在3min的時(shí)間內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)多種成分的測(cè)定，測(cè)定效率高。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：采用溶液萃取的方法對(duì)樣品進(jìn)行萃取，選取quechers試劑對(duì)樣品進(jìn)行凈化，通過(guò)超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，具體步驟如下：

（1）準(zhǔn)確稱取1g口含煙樣品至50ml離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液，再加入10ml甲醇，在超聲波中超聲提取30min，在離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心2min；

（2）取離心管中上清液1~1.5ml至含有quechers試劑的離心管中，渦旋混合1~2min，在離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心1min，取上清液，經(jīng)0.22μm尼龍濾膜過(guò)濾后，采用超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定；

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制，用甲醇配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為50，100，200，300，500ng/ml，其中的內(nèi)標(biāo)濃度均為100ng/ml；

（4）采用acquityupc²-ms/ms對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，分析條件為：

色譜柱：watersupc²hssc18sb，規(guī)格2.1mm×100mm,1.7μm；流動(dòng)相：a：co2，b：v/v,1:1的異丙醇/甲醇混合溶液；洗脫方式：梯度；流速：1.2-1.5ml/min；柱溫：20~40?c；進(jìn)樣體積：1μl；電離方式：電噴霧離子源（esi）；掃描方式：負(fù)離子；溫度：150℃；毛細(xì)管電壓：3.0kv；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流速：600l/h；反吹氣流速：50l/h；mrm模式采集；

mrm參數(shù)見(jiàn)表1，梯度洗脫程序見(jiàn)表2：

。

（5）結(jié)果計(jì)算：根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品對(duì)應(yīng)的濃度與含量。

在本發(fā)明中，步驟（2）中的quechers試劑由25mgpsa、7.5mgcarbon、150mgmgso4構(gòu)成，其中，mgso4主要用來(lái)除去樣品中的水分，因?yàn)楹舷嗌V主要流動(dòng)相為co2，要求提取液中水分的含量控制在5%以下，對(duì)于口含煙這種含水分較高的樣品，首先是要除去水分；carbon主要用來(lái)除去提取液中的色素類物質(zhì)，以防長(zhǎng)期進(jìn)樣所造成的柱效下降，峰型變異等現(xiàn)象；psa主要用來(lái)除去甲醇提取液中的其它雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定所帶來(lái)的干擾。

采用quechers試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行一步凈化就可以實(shí)現(xiàn)水、雜質(zhì)和色素的同時(shí)去除，操作簡(jiǎn)單，凈化效率高。免去了以往需要樣品烘干、采用spe小柱進(jìn)行凈化等繁瑣步驟。

步驟（1）中所使用的內(nèi)標(biāo)為氘代對(duì)羥基苯甲酸甲酯。

所述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的具體配制方法如下：

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)溶液的配置：

準(zhǔn)確稱取0.05g左右對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯于燒杯中，加入甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為1mg/ml的對(duì)羥基苯甲酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（標(biāo)準(zhǔn)溶液i），此溶液在4℃條件下避光保存，保質(zhì)期為1年。

準(zhǔn)確移取100μl標(biāo)準(zhǔn)溶液i至10ml容量瓶中，用甲醇定容，得到濃度為10000ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（標(biāo)準(zhǔn)溶液ⅱ），此溶液在4℃條件下避光保存，保質(zhì)期為6個(gè)月。

用25ml水溶解2.5mg氘代對(duì)羥基苯甲酸甲酯，得到100μg/ml的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，此溶液在4℃條件下避光保存，保質(zhì)期為6個(gè)月。

準(zhǔn)確移取1ml內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10ml容量瓶中，用水定容，得到濃度為10000ng/ml的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，此溶液在4℃條件下避光保存，保質(zhì)期為6個(gè)月。

由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配置系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為50，100，200，300，500ng/ml，其中的內(nèi)標(biāo)濃度均為100ng/ml），進(jìn)行upc²-ms/ms分析后，計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)的峰面積比，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為50~500ng/ml，線性相關(guān)系數(shù)0.9992~0.9996，分別按信噪比s/n=3和10計(jì)算得方法的檢出限（lod）和定量限（loq），甲酯、乙酯、丙酯和丁酯定量限和檢出限見(jiàn)表3。

選取口含煙樣品進(jìn)行高、中、低3個(gè)水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量分別為50，100，200ng/ml，每個(gè)水平平均測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可得，高中低3個(gè)加標(biāo)水平條件下的回收率范圍為94.6~105.6%，結(jié)果良好。

取上述口含煙樣品進(jìn)行精密度試驗(yàn)，平行測(cè)定6次，計(jì)算6次測(cè)定的相對(duì)平均標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表5，由表5可得，6次平行測(cè)定的rsd為2.14~3.95%，測(cè)定結(jié)果良好。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：前處理步驟較為簡(jiǎn)單，所使用的有機(jī)溶劑較少；測(cè)定過(guò)程所使用的有機(jī)溶劑量也很少，在3min的時(shí)間內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)多種成分的測(cè)定，測(cè)定效率高，相對(duì)于液相色譜，此方法檢出限低，更適合微量成分的測(cè)定，是一種較為綠色、高效、準(zhǔn)確的口含煙中對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的測(cè)定方法。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中次高級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液（即濃度300ng/ml）測(cè)定的提取離子色譜圖。

圖2為本發(fā)明中實(shí)際樣品測(cè)定的提取離子色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例：口含煙中對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的測(cè)定。

1）樣品前處理

將袋裝口含煙的包裝袋剪開(kāi)，準(zhǔn)確稱取1g左右的樣品至50ml離心管中，加入0.1ml10000ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液（氘代對(duì)羥基苯甲酸甲酯），再加入10ml甲醇，（最終的內(nèi)標(biāo)濃度為100ng/ml），在超聲波中超聲提取30min，在離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心2min。

取離心管中上清液1~1.5ml至含有quechers試劑（25mgpsa、7.5mgcarbon、150mgmgso4）的離心管中，渦旋混合1~2min，在離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心1min，取上清液，經(jīng)0.22μm尼龍濾膜過(guò)濾后，采用超高效合相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

2）采用acquityupc²-ms/ms（美國(guó)waters公司）對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。分析條件為：色譜柱：watersupc²hssc18sb(2.1mm×100mm,1.7μm)；流動(dòng)相：a：co2，b：異丙醇甲醇混合溶液（v/v,1:1）；洗脫方式：梯度；流速：1.2~1.5ml/min；柱溫：20~40?c；進(jìn)樣體積：1μl；電離方式：電噴霧離子源（esi）；掃描方式：負(fù)離子；溫度：150℃；毛細(xì)管電壓：3.0kv；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流速：600l/h；反吹氣流速：50l/h；mrm模式采集，mrm參數(shù)見(jiàn)表1，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

3）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

采用甲醇對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，得到濃度為50，100，200，300，500ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（內(nèi)標(biāo)濃度為100ng/ml），此溶液在4℃條件下避光保存，保質(zhì)期為兩周。

4）根據(jù)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積對(duì)內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品對(duì)應(yīng)的濃度與含量。

此例中口含煙樣品中對(duì)羥基苯甲酸甲酯和乙酯的含量分別為1.07和1.52mg/kg，丙酯和丁酯均為未檢出。