本發(fā)明涉及免疫層析檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光免疫層析技術(shù)的定量檢測(cè)計(jì)算方法。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，越來(lái)越多的便攜式現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)器件被發(fā)明出來(lái)，無(wú)論是在醫(yī)學(xué)的快速檢測(cè)中，還是在食品安全的檢測(cè)中都可以使用到便攜式檢測(cè)器件。而便攜式檢測(cè)又稱之為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，是體外診斷在不斷發(fā)展中產(chǎn)生的一種細(xì)分的行業(yè)，通過(guò)在現(xiàn)場(chǎng)的采樣即刻進(jìn)行分析，省去了使用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)師的繁雜的檢測(cè)過(guò)程和長(zhǎng)時(shí)間的等待，能夠快速的得到檢驗(yàn)結(jié)果的一種新方法。其中在便攜式檢測(cè)中熒光免疫層析檢測(cè)技術(shù)是應(yīng)用了熒光技術(shù)而產(chǎn)生的一種新興檢測(cè)技術(shù)。

熒光免疫層析技術(shù)主要由兩個(gè)部分組成包括光電探測(cè)器和檢測(cè)板。層析法所應(yīng)用的場(chǎng)所就是在檢測(cè)板，檢測(cè)開(kāi)始時(shí)將樣品滴到檢測(cè)板上，樣品在層析作用下移動(dòng)，同時(shí)將固化的標(biāo)記物也就是熒光物質(zhì)溶解，反應(yīng)并形成免疫復(fù)合物，而復(fù)合物隨后富集到檢測(cè)線和控制線上，反應(yīng)物的含量和待測(cè)物濃度成正比；因?yàn)闊晒馕镔|(zhì)的特性，在一定波長(zhǎng)的照射激發(fā)下，會(huì)產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光發(fā)射。而光電探測(cè)器在接受了發(fā)射的熒光時(shí)，將其轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)信息，通過(guò)軟件算法的相應(yīng)處理，就可以得到樣品的光強(qiáng)特征值即檢測(cè)線與控制線的比值；最后，測(cè)試樣品的濃度可以通過(guò)光強(qiáng)特征值與樣品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而出。

由于熒光物質(zhì)的發(fā)光光強(qiáng)較低，所以在熒光分析中一般測(cè)試時(shí)都是將儀器的增益和放大倍數(shù)提高，以獲得高的光強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)。但是，在之后的算法處理中沒(méi)有針對(duì)各種影響因素進(jìn)行處理，造成得到的熒光信號(hào)可能不只是含有熒光物質(zhì)的發(fā)射光，還包括有試劑板的背景熒光等雜散光和電子電路干擾的影響。并且由于試劑條的檢測(cè)線很窄，當(dāng)檢測(cè)樣品濃度不高時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的光強(qiáng)信號(hào)非常弱，再加上各種影響因素的干擾，會(huì)混合在有用信號(hào)中，甚至將有用信號(hào)淹沒(méi)，降低了信號(hào)的信噪比和靈敏度。而本發(fā)明中使用了L-M法來(lái)處理硬件數(shù)據(jù)，L-M算法總稱為L(zhǎng)evenberg-Marquardt，中文為列文伯格-馬夸爾特法，是一種最優(yōu)化的算法，是使用最為廣泛的非線性最小二乘算法。其在處理數(shù)據(jù)過(guò)程時(shí)能夠使數(shù)據(jù)重建，能夠很好的將數(shù)據(jù)的特性保留下來(lái)。廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)學(xué)、管理優(yōu)化、網(wǎng)絡(luò)分析、最優(yōu)設(shè)計(jì)、機(jī)械或電子設(shè)計(jì)等等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本方案在上述背景條件下，為了避免上述技術(shù)的不足，提出了一個(gè)不同的算法處理方法，同時(shí)應(yīng)用在這個(gè)算法的面積計(jì)算方法，在算法處理過(guò)程中消除各種影響因素，并且保持?jǐn)?shù)據(jù)的不失真性。而應(yīng)用于此算法中的面積計(jì)算非常簡(jiǎn)單方便，能便捷和快速檢測(cè)得到高精度、低誤差的結(jié)果。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種基于熒光免疫層析技術(shù)的定量檢測(cè)計(jì)算方法，包括以下步驟：將滴加有待測(cè)樣本溶液的熒光免疫試紙條插入熒光免疫分析儀中，依次經(jīng)過(guò)LED光源照射、濾光片濾光處理、光電探測(cè)器檢測(cè)、電信號(hào)處理、AD轉(zhuǎn)換處理、基線校正、L-M算法處理、面積計(jì)算、濃度計(jì)算的過(guò)程。

優(yōu)選地，所述的面積計(jì)算是將原始曲線擬合為兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的高斯曲線，通過(guò)計(jì)算擬合后的兩條曲線的系數(shù)比值從而計(jì)算出原有的曲線面積比值。

優(yōu)選地，所述基線校正選用最小二乘法。

優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：

(1)在熒光免疫試劑條上滴加待測(cè)樣本溶液，靜置一段時(shí)間后，插入熒光免疫分析儀中進(jìn)行檢測(cè)；

(2)針對(duì)試劑條中熒光標(biāo)記物的光譜，選擇合適的LED光源，啟動(dòng)LED光源照射試劑條；

(3)針對(duì)熒光標(biāo)記物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，選擇對(duì)應(yīng)的激發(fā)光濾光片和發(fā)射光濾光片，濾除背景光、雜散光的干擾；

(4)利用光電探測(cè)器將檢測(cè)到的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)；

(5)對(duì)光電探測(cè)器獲取的微弱電流信號(hào)進(jìn)一步處理，先通過(guò)I/V轉(zhuǎn)換電路將電流信號(hào)轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)，再通過(guò)帶通濾波放大電路進(jìn)行放大，增大信噪比；然后通過(guò)檢波電路以獲取高精度的放大的模擬電信號(hào)；

(6)使用AD轉(zhuǎn)換器，將采集處理放大后的模擬電信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)，并且將轉(zhuǎn)換來(lái)的數(shù)字信號(hào)按照每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的檢測(cè)順序拼成一條原始檢測(cè)數(shù)據(jù)的采集樣品曲線；

(7)將AD轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正，采用最小二乘法擬合來(lái)進(jìn)行基線校正以消除曲線漂移造成的影響；

(8)將基線校正后的原始檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行L-M處理；

(9)經(jīng)過(guò)上述算法和校正流程處理過(guò)后，形成了T峰和C峰的高斯曲線，將形成的兩個(gè)高斯曲線寫為振幅系數(shù)與面積為1的高斯曲線的乘積，而高斯曲線的面積比就是高斯曲線公式中的振幅系數(shù)的比值，同時(shí)也將比值的結(jié)果記為光強(qiáng)特征值；

(10)根據(jù)T/C光強(qiáng)特征值與濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出T/C比值對(duì)應(yīng)的待測(cè)樣品濃度。

優(yōu)選地，步驟(2)所述選擇合適的LED光源指的是選擇發(fā)射波長(zhǎng)同熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)相同的LED光源。

優(yōu)選地，步驟(9)所述的光強(qiáng)特征值的計(jì)算方法具體過(guò)程、公式如下：

T峰擬合后的高斯曲線函數(shù)為：

C峰擬合后的高斯曲線函數(shù)為：

由上述的高斯曲線函數(shù)計(jì)算的T峰和C峰的面積比值為：

優(yōu)選地，所述的光電探測(cè)器為光電二極管。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明中，LED光源的內(nèi)在特征有利于熒光免疫分析儀的便攜化、穩(wěn)定、長(zhǎng)時(shí)間測(cè)量；并且LED光源的耗電非常低、熱量低、壽命長(zhǎng)。針對(duì)試劑條中熒光標(biāo)記物的光譜，選擇合適的LED光源，照射試劑條時(shí)能夠獲取較高的熒光強(qiáng)度，減少溫度變化，進(jìn)而降低溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。

本發(fā)明針對(duì)熒光標(biāo)記物的激發(fā)光波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)，選擇對(duì)應(yīng)的激發(fā)光濾光片和熒光濾光片，來(lái)獲取理想波長(zhǎng)的激發(fā)光和熒光；能夠有效地濾除背景光、雜散光的干擾。

本發(fā)明選擇光電二極管作為光電探測(cè)器，其成本低、響應(yīng)快、使用壽命更長(zhǎng)；并且具有高穩(wěn)定性、低暗電流、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。LED光源、濾光片、光電二極管、以及光路結(jié)構(gòu)組成的光學(xué)系統(tǒng)被密封在光學(xué)暗箱中，可降低雜散光的干擾。

本發(fā)明在將模擬信號(hào)轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號(hào)的處理過(guò)程中，采用高精度的AD轉(zhuǎn)換器，并且具有轉(zhuǎn)化速度快、功耗低的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明中的算法處理過(guò)程中使用了L-M算法，L-M算法作為最優(yōu)化的算法處理，在處理過(guò)程中使數(shù)據(jù)重建，而重建數(shù)據(jù)只是將有用信號(hào)進(jìn)行重建，在其重建過(guò)程中能夠?qū)?shù)據(jù)中的噪聲等影響信號(hào)完全消除，既消除了對(duì)于數(shù)據(jù)影響大的影響信號(hào)，又保證了數(shù)據(jù)的完整真實(shí)。

本發(fā)明選用最小二乘法擬合來(lái)濾除基線漂移，可以有效減少噪聲干擾以及基線漂移對(duì)分析結(jié)果造成的影響。

本發(fā)明中的面積計(jì)算基于L-M算法的優(yōu)化結(jié)果，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)L-M算法被擬合成兩條標(biāo)準(zhǔn)的高斯曲線，而本次面積比值的計(jì)算即為標(biāo)準(zhǔn)高斯曲線的面積比值的計(jì)算，即為標(biāo)準(zhǔn)高斯曲線的振幅系數(shù)之比。該方法可以簡(jiǎn)單快捷，且精準(zhǔn)的計(jì)算出曲線面積的比值。

本發(fā)明方法重點(diǎn)在于通過(guò)使用算法來(lái)對(duì)信號(hào)進(jìn)行重建，既消除了噪聲等各種干擾的影響，又還能使信號(hào)處理過(guò)程不失真，能得到高精度和低誤差的結(jié)果。即本發(fā)明能快速、便捷而又準(zhǔn)確的測(cè)出濃度結(jié)果。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明檢測(cè)方法的流程示意圖；

圖2為本發(fā)明原始檢測(cè)數(shù)據(jù)的樣品曲線圖；

圖3為經(jīng)過(guò)算法處理和基線校正后的曲線圖；

圖4為本發(fā)明使用的試劑條的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明而非對(duì)其加以限定。

本發(fā)明為一種基于熒光免疫層析技術(shù)的定量檢測(cè)方法，實(shí)施流程圖如圖1所示，具體步驟如下：

1、樣品添加

在熒光免疫試劑條上滴加至少40微升的待測(cè)樣本溶液，靜置15分鐘后，插入儀器中開(kāi)始檢測(cè)。

2、硬件處理：

(1)照明過(guò)程：使用LED光源作為照射到試劑條上試紙的光源，LED光源有利于熒光免疫分析儀的便攜和穩(wěn)定。試劑條上熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)主要是在365nm左右，激發(fā)后的熒光發(fā)射波長(zhǎng)在613nm左右。選用LED光源時(shí)，選擇發(fā)射波長(zhǎng)同熒光物質(zhì)的激發(fā)波長(zhǎng)相同的365nm的LED光源。檢測(cè)試劑條時(shí)，將LED光源照向試劑條的試紙窗口，發(fā)出激發(fā)光。同時(shí)，對(duì)于選擇與熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長(zhǎng)相同的LED光源，有利于獲得熒光物質(zhì)的更高的發(fā)射熒光強(qiáng)度，并且使得溫度變化范圍區(qū)間變小，從而減少溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

(2)濾光過(guò)程：選擇對(duì)應(yīng)于熒光標(biāo)記物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的激發(fā)光濾波片和發(fā)射光濾波片，以獲得理想的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。具體到實(shí)例中，LED光源發(fā)出激發(fā)光以后，先通過(guò)LED前面的通過(guò)光波長(zhǎng)是365±20nm的激發(fā)光濾波片，濾掉非激發(fā)光波長(zhǎng)的其他的LED光；激發(fā)光照射到試劑條上，試紙上的熒光標(biāo)記物質(zhì)受激發(fā)后發(fā)射出熒光；發(fā)射的熒光通過(guò)在光電探測(cè)器前端的通過(guò)光波長(zhǎng)是610±20nm的發(fā)射光濾光片，濾除背景光、雜散光，只通過(guò)熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的發(fā)射光以減少干擾；保證了后續(xù)的光電探測(cè)器獲取的熒光信號(hào)的純度。

(3)檢測(cè)過(guò)程：本方案選擇的作為檢測(cè)的光電探測(cè)器為光電二極管，可以將檢測(cè)到的熒光信號(hào)輸出轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，因其高穩(wěn)定性、低暗電流、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)對(duì)于信號(hào)的輸出有著最小的影響，且成本低廉，響應(yīng)速度快，使用壽命長(zhǎng)；將由LED光源、濾光片、光電二極管、以及光路結(jié)構(gòu)所組成的光學(xué)系統(tǒng)密封于光學(xué)暗箱中，用來(lái)降低雜散光的影響。檢測(cè)過(guò)程中，儀器內(nèi)部的電機(jī)帶動(dòng)待測(cè)試劑條勻速直線運(yùn)動(dòng)，由于在試劑條上熒光物質(zhì)分布的不同，光電探測(cè)器在試紙上的每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)上獲取的熒光信號(hào)也是不同的。

(4)信號(hào)處理：對(duì)由上一個(gè)檢測(cè)過(guò)程中獲得的信號(hào)進(jìn)行進(jìn)一步處理；首先，將獲得的電流信號(hào)輸入到I/V轉(zhuǎn)換電路轉(zhuǎn)換為電壓信號(hào)，再使用帶通濾波放大器將信號(hào)放大，同時(shí)也增大了信噪比；然后通過(guò)檢波電路獲得高精度的放大的模擬電信號(hào)。

(5)AD轉(zhuǎn)換處理：使用轉(zhuǎn)換速度快、功耗低的高精度的AD轉(zhuǎn)換器，將前面信號(hào)處理過(guò)后的模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)；并且將轉(zhuǎn)換來(lái)的數(shù)字信號(hào)按照每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的檢測(cè)順序依次傳遞給儀器的客戶端軟件，形成一條原始檢測(cè)數(shù)據(jù)的采集樣品曲線(圖2)，便于后面的算法處理。

3、基線校正：轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正。由于在實(shí)際的檢測(cè)過(guò)程中會(huì)有微小的溫度變化、熒光濃度不均勻等各種影響因素的原因，造成了曲線的漂移，影響到最終的結(jié)果計(jì)算。所以本系統(tǒng)設(shè)計(jì)采用了最小二乘法擬合來(lái)進(jìn)行基線校正以消除曲線漂移造成的影響。

4、L-M算法處理：L-M算法是一種最優(yōu)化算法。將基線校正后的數(shù)據(jù)利用L-M算法進(jìn)行處理；可以將數(shù)據(jù)在檢測(cè)和硬件處理過(guò)程所存在的試劑條的背景熒光噪聲、雜散光、暗電流、電機(jī)的電磁噪聲等等的影響信號(hào)識(shí)別的誤差因素濾掉。而由于其噪聲的隨機(jī)性，本系統(tǒng)采用的L-M算法，也就是非線性最小二乘算法，可以很好的對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行重建，去除誤差因素的影響；并且在處理過(guò)程中還能很好地保持?jǐn)?shù)據(jù)的不失真，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。即在消除噪聲的同時(shí)還能保持信號(hào)的原有性，從而提高了信噪比。經(jīng)過(guò)算法處理和基線校正后圖形如圖3所示。

5、面積計(jì)算：計(jì)算T峰和C峰面積的比值，本系統(tǒng)采用的方法為：在經(jīng)過(guò)上述校正流程和L-M算法處理過(guò)后，T峰和C峰的信號(hào)圖形擬合為標(biāo)準(zhǔn)形式的高斯曲線。標(biāo)準(zhǔn)形式的高斯曲線函數(shù)由一個(gè)面積為1的高斯曲線乘以一個(gè)振幅系數(shù)組成，所以其面積比值就是振幅系數(shù)的比值。

T峰擬合后的高斯曲線函數(shù)為：

C峰擬合后的高斯曲線函數(shù)為：

由上述的高斯曲線函數(shù)計(jì)算的出T峰和C峰的面積比值為：

得到的面積比值作為光強(qiáng)特征值；同時(shí)，由于在測(cè)量過(guò)程中的各種因素的影響。會(huì)造成T峰和C峰的峰值整體的波動(dòng)，所以在處理計(jì)算時(shí)選擇T峰的C峰處于同一個(gè)狀態(tài)下的結(jié)果進(jìn)行面積計(jì)算和比值，并且此方法在最終的結(jié)果判斷時(shí)還可以起到一定的噪聲消除和精度保持。本實(shí)施例中T、C峰面積比值為：4.0145。

6、濃度計(jì)算：每個(gè)試劑條在出廠前都會(huì)標(biāo)定一個(gè)T/C光強(qiáng)特征值和濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)將T/C計(jì)算所得的光強(qiáng)特征值也就是T、C峰面積比值代入曲線中，就可以求出待測(cè)樣品濃度。本實(shí)驗(yàn)采用的試劑條的標(biāo)準(zhǔn)曲線為(1，0.04)(3.125，0.1293)(6.25，0.247)(12.5，0.4932)(25，1.0119)(50，2.1012)(100，4.0145)(濃度單位為：μg/mL)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。將前面計(jì)算所得的面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到濃度結(jié)果為：104.3627μg/mL，實(shí)驗(yàn)中實(shí)際使用的樣品的濃度為：100μg/mL。誤差范圍僅：4.36％。由此可以看出算法的高準(zhǔn)確度和小誤差范圍。

以上所述實(shí)施方式僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。