本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鐵棍山藥中吡唑醚菌酯殘留量的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

吡唑醚菌酯是BASF公司于1993年發(fā)現(xiàn)、2001年登記上市的甲氧基丙烯酸酯類醌外抑制型殺菌劑。主要通過(guò)阻止細(xì)胞色素bc1復(fù)合體的電子傳遞進(jìn)而抑制線粒體呼吸作用，使線粒體不能產(chǎn)生和提供細(xì)胞正常代謝所需要的ATP，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，具有保護(hù)、治療和葉片滲透?jìng)鲗?dǎo)作用。會(huì)引起像推遲衰老、葉片變綠、對(duì)生物和非生物脅迫耐受性更好等生理效應(yīng)，能更有效地利用水和氮。吡唑醚菌酯具有廣譜、高效、毒性低，對(duì)非靶標(biāo)生物安全，對(duì)使用者和環(huán)境安全友好、對(duì)作物安全性好等特點(diǎn)， 有研究表明吡唑嘧菌酯還有保健增產(chǎn)的作用。自上市以來(lái)其已在100多種作物上登記使用，主要用于防治如谷物的山藥殼針孢、柄銹病、山藥德斯霉菌、桿圓核腔菌、黑麥喙孢菌和麥穎枯病，花生的球腔菌，大豆的線蟲病、思茅松毛蟲病和大豆銹菌，葡萄的霜霉病和白粉菌，馬鈴薯和番茄的疫霉病和早疫病，黃瓜的霜霉病和白粉病，香蕉的黑條葉斑病菌，柑橘的痂囊腔菌和球座菌，草坪的紋枯病和腐霉菌。

國(guó)內(nèi)外對(duì)吡唑醚菌酯的殘留測(cè)定方法已有大量報(bào)道。吳迪等建立了凝膠滲透色譜結(jié)合氨基柱凈化、高效液相色譜檢測(cè)的方法；周先學(xué)等建立了高效液相色譜/VWD快速檢測(cè)蘋果和土壤中吡唑醚菌酯殘留量的方法；閆曉陽(yáng)等建立了固相萃取、高效液相色譜/DAD檢測(cè)煙葉和土壤中吡唑醚菌酯的方法；De Melo Abreu等建立了同時(shí)檢測(cè)葡萄和葡萄酒中6種殺菌劑的高效液相色譜檢測(cè)方法；Fulcher等利用DSPE/HPLC-UV法分析了吡唑醚菌酯在甘蔗土壤中的殘留；Esteve-Turrillas等開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)免疫親和色譜柱提取，然后用HPLC-UV分析蘋果汁和紅葡萄汁中吡唑醚菌酯殘留的檢測(cè)方法；湯永嬌等建立了氨基柱凈化，超高效液相色譜/紫外檢測(cè)器檢測(cè)芒果中吡唑醚菌酯的方法；劉軍等建立了柑橘中吡唑醚菌酯的高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法；王燕等建立了PSA固相萃取柱凈化，HPLC-MS檢測(cè)人參根莖葉和土壤中吡唑醚菌酯的方法；徐娟等利用QuEChERS提取，采用超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)檢測(cè)了包括吡唑醚菌酯在內(nèi)的230種農(nóng)藥殘留。然而，到目前為止還沒(méi)有報(bào)道吡唑醚菌酯在鐵棍山藥中的檢測(cè)方法。

上述檢測(cè)方法的提取液多為丙酮，用量較多，后期凈化復(fù)雜，環(huán)境污染嚴(yán)重，且提取、鹽析后，多為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，工作效率低；有些方法前處理簡(jiǎn)單，但檢測(cè)所用儀器為質(zhì)譜，普及率較低，方法推廣應(yīng)用難，檢測(cè)成本高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種鐵棍山藥中吡唑醚菌酯殘留量的檢測(cè)方法，提取液用量較少，后期凈化較簡(jiǎn)單，較少了環(huán)境污染，降低了檢測(cè)成本；提取、鹽析后，加熱板蒸干，不需要旋蒸，提高了工作效率；檢測(cè)所用的儀器為液相，普及率較高，有較強(qiáng)的實(shí)用性，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種鐵棍山藥中吡唑醚菌酯殘留量的檢測(cè)方法，步驟如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：稱取吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解定容制成1000 mg/L的母液，再逐級(jí)稀釋成濃度為0.05mg/L、0.1 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

（2）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將步驟（1）制得的標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)色譜柱SunFireTM C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)后用PDA檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫為25 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL；

以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，計(jì)算機(jī)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=86491x-426.4，其中，x為吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位mg/L，y為峰面積，響應(yīng)值相關(guān)系數(shù)為r²=0.9999；

（3）樣品提?。簩㈣F棍山藥清洗干凈后勻漿，得到樣品，準(zhǔn)確稱取該樣品20.00 g(精確至0.01 g)于100 mL離心管中，然后加入10 mL水和40 mL乙腈，振蕩1 h后，加入5 g氯化鈉，蓋上蓋子渦旋30 s，靜置1 h，于5000 r/min的條件下離心5 min，取上清液20 mL于40℃蒸發(fā)至近干，待凈化；

（4）樣品凈化：將步驟（3）蒸發(fā)至近干得到的殘留物用5 mL正己烷和丙酮的混合溶液溶解，然后加入氨基固相萃取柱，再用15 mL正己烷和丙酮的混合溶液分3次洗脫，合并淋洗液，于40 ℃蒸干，用乙腈定容至2 mL，過(guò)0.22 μm濾膜得到樣品溶液；

（5）樣品檢測(cè)：將步驟（4）所得的樣品溶液按照步驟（2）中的液相色譜條件進(jìn)行檢測(cè)；

（6）結(jié)果計(jì)算：按照公式計(jì)算樣品中吡唑醚菌酯的濃度；C 表示待測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留量，mg/kg；C₀表示標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，μg/mL；A 表示待測(cè)樣品峰面積；A₀表示標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；V₀表示標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積，μL；V₁表示待測(cè)樣品定容的體積，mL；V₂表示待測(cè)樣品的進(jìn)樣體積，μL；M 表示待測(cè)樣品的質(zhì)量，g。

所述步驟（4）中正己烷和丙酮的混合溶液中正己烷和丙酮的體積比為3:2。

所述步驟（4）中的氨基固相萃取柱預(yù)先經(jīng)過(guò)5 mL正己烷和丙酮的混合溶液預(yù)淋洗，其中正己烷和丙酮的體積比為3:2。

所述步驟（2）中流動(dòng)相乙腈-水的體積比為70：30。

本發(fā)明的有益效果：1、本發(fā)明以乙腈作為提取液，與已報(bào)道的丙酮作為提取液相比后期凈化較簡(jiǎn)單；2、與甲醇作為提取液相比，提取、鹽析后，加熱板蒸干，不需要旋蒸，能提高工作效率；3、檢測(cè)所用的儀器普及率較高，方法易推廣應(yīng)用；4、本發(fā)明檢測(cè)方法的重現(xiàn)性，準(zhǔn)確度、精密度及檢出限均可滿足該農(nóng)藥在鐵棍山藥上的殘留分析要求；5、本發(fā)明檢測(cè)方法較少了環(huán)境污染，降低了檢測(cè)成本，提高了工作效率，有較強(qiáng)的實(shí)用性，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為0.05 mg/L吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖3為0.1mg/L吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖4為0.25 mg/L吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖5為0.5 mg/L吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖6為1mg/L吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖7為2mg/L吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖。

圖8為鐵棍山藥中吡唑醚菌酯添加量為0.05 mg/kg的色譜圖。

圖9為鐵棍山藥中吡唑醚菌酯添加量為0.5 mg/kg的色譜圖。

圖10為鐵棍山藥中吡唑醚菌酯添加量為1mg/kg的色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

本發(fā)明的鐵棍山藥中吡唑醚菌酯殘留的檢測(cè)方法，具體步驟如下：

一、測(cè)定鐵棍山藥中吡唑醚菌酯的含量

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：稱取一定量的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解定容制成1000 mg/L的母液，然后用乙腈定容并逐級(jí)稀釋成所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，工作曲線濃度：0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L；

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將步驟（1）制得的標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)色譜柱SunFireTM C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)后用PDA檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫為25 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水（v/v=70:30），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL；

以溶液濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，計(jì)算機(jī)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=86491x-426.4，其中，x為吡唑醚菌酯濃度，單位mg/L，y為峰面積，響應(yīng)值相關(guān)系數(shù)為r²=0.9999，見(jiàn)圖1，最小檢出量為0.1 ng，最低檢測(cè)濃度均為0.05 mg/kg，相對(duì)保留時(shí)間約為7.0 min；

（3）樣品提取：將鐵棍山藥清洗干凈后勻漿，得到樣品，準(zhǔn)確稱取該樣品20.00 g (精確至0.01 g)于200 mL玻璃瓶中，加10 mL水，40 mL乙腈，于恒溫振蕩器下振蕩1 h后，過(guò)濾至已加入5 g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈震蕩，靜置1 h，取上清液20 mL于40 ℃蒸發(fā)至近干，待凈化；

（4）樣品凈化：將蒸發(fā)至近干得到的殘留物用5 mL正己烷+丙酮(3:2，V/V)溶解加入已經(jīng)過(guò)5 mL正己烷+丙酮(3:2，V/V)預(yù)淋洗的氨基固相萃取柱，收集淋洗液，再用15 mL正己烷+丙酮(3:2，V/V)分3次洗脫，合并淋洗液，于40 ℃蒸干，用乙腈定容至2 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，移入進(jìn)樣瓶中，得到樣品溶液；

（5）樣品檢測(cè)：將所得的樣品溶液過(guò)色譜柱SunFireTM C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)后用PDA檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫為25 ℃，流動(dòng)相為乙腈-水(體積比為70：30)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL；

（6）結(jié)果計(jì)算：按照公式計(jì)算樣品中吡唑醚菌酯的濃度；C 表示待測(cè)樣品中農(nóng)藥殘留量，mg/kg；C₀表示標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，μg/mL；A 表示待測(cè)樣品峰面積；A₀表示標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；V₀表示標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣體積，μL；V₁表示待測(cè)樣品定容的體積，mL；V₂表示待測(cè)樣品的進(jìn)樣體積，μL；M 表示待測(cè)樣品的質(zhì)量，g。

二、測(cè)定鐵棍山藥中吡唑醚菌酯的添加回收率

分別在已經(jīng)制備好的不含吡唑醚菌酯的鐵棍山藥的對(duì)照樣品中添加不同濃度（0.05 mg/kg、0.5 mg/kg和1 mg/kg）的吡唑醚菌酯標(biāo)樣溶液，搖勻，放置2h后，按照上述步驟（3）和步驟（4）所述的樣品提取凈化方法進(jìn)行處理，按步驟（5）進(jìn)行檢測(cè)得到加標(biāo)試樣濃度，按照公式計(jì)算添加回收率，式中P 為添加回收率；C₁為試樣濃度，即試樣測(cè)定值（對(duì)照樣品中吡唑醚菌酯的濃度）；C₂為加標(biāo)試樣濃度，即加標(biāo)試樣測(cè)定值；C₃為加標(biāo)量，單位均為mg/kg。

利用上述方法測(cè)得本方法的加標(biāo)回收率如下表1所示。

表1 不同添加水平時(shí)吡唑醚菌酯在鐵棍山藥中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表1可知，當(dāng)添加水平為0.05、0.5、1 mg/kg時(shí)，測(cè)得吡唑醚菌酯在鐵棍山藥中的平均回收率為77～96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.4～8.4%，符合殘留分析要求。