本發(fā)明涉及食品檢測與食品質量控制領域，具體涉及一種紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的測定方法，特別是涉及一種通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用技術進行檢測的方法。

背景技術：

葡萄酒的氣味是葡萄酒質量與品質的一項重要指標，良好的氣味會增加葡萄酒的復雜性和協(xié)調性，并提高消費者購買率。相反，不良的氣味則會造成葡萄酒的缺陷。

葡萄酒的氣味是由很多物質構成的。其中，揮發(fā)性酚類是很重要的一類，尤其是4-乙基苯酚(4-ethylphenol,4-EP)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-ethylguaiacol,4-EG)。

4-EP通常被描述為“草棚味”、“馬廄味”，4-EG則被描述為煙熏味、丁香味。低濃度時，4-EP和4-EG可以增加葡萄酒氣味的復雜性；高濃度時，因其嗅覺閾值較低(4-EP:430μg/L、4-EG:33μg/L)，容易造成紅葡萄酒的感觀缺陷。通常，它們在酒中的濃度從幾十微克每升到幾百微克每升不等。當達到數(shù)毫克每升時，4-EP會帶來一種強烈的“馬廄”味。即使是在較低的濃度下(600-700μg/L)，4-EP也會改變酒的香氣。雖然其氣味可能只有輕微地令人不愉快，但它仍然會掩蓋掉果香和酒香，使酒失去它們本身的個性。研究表明，這類揮發(fā)性酚類物質給葡萄酒帶來的香氣上的缺陷是普遍存在的。因此，建立一種準確、快速檢測紅葡萄酒中4-EP、4-EG的方法，了解目前紅葡萄酒中4-EP、4-EG的含量情況是十分必要的。這將為進一步研究其產生機理、控制其對紅葡萄酒感官品質的影響提供技術支持。

近年來，隨著現(xiàn)代分析技術的發(fā)展，一些精密的分析手段被應用于葡萄酒風味物質的分離和鑒定，如氣相色譜、氣相色譜/質譜聯(lián)用系統(tǒng)等。但使用這些分析系統(tǒng)之前，都必須將香氣物質較為完全地從葡萄酒中抽提出來，以獲得理想的分析結果。因此選擇適當?shù)妮腿》椒ㄊ鞘直匾?。目前葡萄酒香氣的萃取方法有溶劑萃取法、固相萃取?SPE)、吹掃捕集法(P&T)、頂空固相微萃取法(HS-SPME)、固態(tài)攪拌棒吸附萃取法(SBSE)等。尤其是SPE技術，近年來被廣泛運用于葡萄酒香氣成分的研究。但該方法的難點是眾多操作參數(shù)的選擇和定量結果的重復性，因而，需要研究建立相應的方法后才可用作日常質量控制分析。

國外的研究中，對于4-EP、4-EG的萃取技術主要有液-液萃取、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、頂空固相微萃取(HS-SPME)、多重頂空固相微萃取。其中多重頂空固相微萃取是對頂空固相微萃取技術的改進，可連續(xù)分離樣品中的揮發(fā)性酚類物質，同時能避免可能出現(xiàn)的基體效應。對于4-EP、4-EG的定量分析檢測技術主要有GC-FID或GC-MS。也有文獻報道用HPLC-FID定量分析合適的揮發(fā)性酚類樣本以及用HPLC-電化學陣列檢測器定量分析。

而在中國，相關報道很少。目前，優(yōu)質國產葡萄酒已經開始逐漸走出國門，出口到世界各地，而葡萄酒中4-EP、4-EG的檢測手段的不足，使得我國葡萄酒在出口上很容易遭遇其他國家的貿易壁壘。

總而言之，我國在葡萄酒中4-EP、4-EG的檢測與其他國家相比有較大的差距。這對于我國葡萄酒產業(yè)的進一步發(fā)展，是一個很大的隱患。因此建立一種快速、準確、方便、實用的檢測方法，有利于監(jiān)控葡萄酒生產過程中4-EP、4-EG的含量控制，進而保障葡萄酒的質量，以及消費者食品安全與我國葡萄酒產業(yè)的健康發(fā)展。目前尚無針對紅葡萄酒中4-EP和4-EG檢測的相關專利。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是填補紅葡萄酒中4-EP和4-EG相關檢測方法領域的不足，通過摸索最佳頂空固相微萃取條件和最佳氣相色譜-質譜分離條件而提供一種紅葡萄酒中4-EP和4-EG含量的測定方法，從而克服上述不足。

針對上述目的，本發(fā)明提供的技術方案如下：

一種同時檢測紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的方法，其特征在于：所述方法包括以下步驟：

a.內標物的制備：精確稱取1mg純度為色譜純的對-甲酚標準品，用純度為色譜純的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存，作為內標物使用；

b.頂空固相微萃?。涸谘b有磁力攪拌器的15mL頂空瓶中加入待測紅葡萄酒樣品10mL，加入步驟a中制備的內標物100μL和NaCl；將頂空瓶置于磁力加熱攪拌裝置上，在50℃預先加熱平衡10min，調整磁力攪拌轉速為850rpm，插入萃取頭；

c.標準曲線的測定：分別精確稱取純度為色譜純的4-EP標準品1mg和純度為色譜純的4-EG標準品1mg，用純度為色譜純的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存；用純度為色譜純的乙醇稀釋，分別配制50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L和3000μg/L的4-EP標準品溶液；5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的4-EG標準品溶液；

在裝有磁力攪拌器的15mL頂空瓶中分別加入上述標準品溶液10mL，加入步驟a中制備的內標物100μL和NaCl；將頂空瓶置于磁力加熱攪拌裝置上，在50℃預先加熱平衡10min，調整磁力攪拌轉速為850rpm，插入萃取頭；

d.氣相色譜-質譜檢測：將上述步驟b、c的萃取手柄分別插入氣相色譜儀的進樣口進樣，解析5min，得到待測紅葡萄酒樣品溶液中4-EP、4-EG和內標物的峰面積，以及4-EP標準品、4-EG標準品和內標物的峰面積；

e.標準曲線的計算：以標準品峰面積與內標物峰面積之比為響應值A，即

響應值A＝標準品峰面積/內標物峰面積；

根據(jù)響應值與標準品溶液濃度之間存在的線性關系，制成標準曲線；

f.待測紅葡萄酒樣品中4-EP、4-EG濃度的計算：以待測紅葡萄酒樣品中4-EP、4-EG的峰面積分別與內標物的峰面積之比為響應值B_4-EP、B_4-EG，即

B_4-EP＝待測紅葡萄酒樣品中4-EP峰面積/內標物峰面積，

B_4-EG＝待測紅葡萄酒樣品中4-EG峰面積/內標物峰面積；

根據(jù)步驟e中得到的標準曲線計算待測紅葡萄酒樣品中4-EP、4-EG濃度；

其中，

所述步驟d中，

1)氣相色譜檢測條件：

氣相色譜進樣方式為SPME無分流進樣；

氣相色譜升溫程序為初始溫度50℃保持3分鐘，之后以10℃/min升至150℃，再以5℃/min升至180℃，再以10℃/min升至210℃，保持16min；

2)質譜條件：

質譜儀電離源為EI電離源，電子能量為70eV，掃描范圍(m/z)：50～500AMU，離子源溫度250℃。

所述的同時檢測紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的方法步驟b和步驟c中，NaCl的添加量為2.5g。

所述的同時檢測紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的方法步驟b和步驟c中，萃取頭為美國Supelco公司的50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭。

所述的同時檢測紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的方法步驟b和步驟c中，頂空固相微萃取的溫度為55℃，萃取時間為45min。

所述的同時檢測紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的方法步驟d中，檢測儀器為美國安捷倫公司GC6890/MS5973型氣相色譜/質譜聯(lián)用儀；

氣相色譜檢測條件還包括：

1)色譜柱為美國安捷倫公司的HP-INNO-WAX，規(guī)格為60.0m×0.25mm×0.25μm；

2)載氣為高純度氮氣，流量1mL/min；

3)檢測器溫度250℃，進樣口溫度250℃。

所述的同時檢測紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的方法步驟d中，質譜條件還包括：質譜分析結束后，分析結果運用NIST2005標準譜庫進行檢索。

本發(fā)明的有益效果在于：

建立一種快速、準確、方便、實用的檢測方法，用于同時檢測和監(jiān)控紅葡萄酒生產過程中4-EP、4-EG的含量，進而保障葡萄酒的質量，以及消費者食品安全與我國葡萄酒產業(yè)的健康發(fā)展。

填補我國在紅葡萄酒中4-EP、4-EG的含量檢測方法領域的不足，為葡萄酒質量檢測提供技術支持。

附圖說明

以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中：

圖1為本發(fā)明的實施例中的4-EP標準曲線圖；

圖2為本發(fā)明的實施例中的4-EG標準曲線圖；

圖3為本發(fā)明的實施例中的4-EP和4-EG標準品氣相色譜圖；

圖4為實際檢測中紅葡萄酒樣品中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚以及內標物的氣相色譜圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的描述。

本發(fā)明一種同時檢測紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的方法，其包括以下步驟：

a.內標物的制備：精確稱取1mg純度為色譜純的對-甲酚標準品，用純度為色譜純的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存，作為內標物使用。

b.頂空固相微萃取：在裝有磁力攪拌器的15mL頂空瓶中加入待測紅葡萄酒樣品10mL，加入步驟a中制備的內標物100μL和2.5g的NaCl。將頂空瓶置于磁力加熱攪拌裝置上，在50℃預先加熱平衡10min，調整磁力攪拌轉速為850rpm，插入萃取頭，在55℃下頂空固相微萃取45min。

其中，萃取頭為美國Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。

c.標準曲線的測定：分別精確稱取純度為色譜純的4-EP標準品1mg和純度為色譜純的4-EG標準品1mg，用純度為色譜純的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存。用純度為色譜純的乙醇稀釋，分別配制50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L和3000μg/L的4-EP標準品溶液；5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的4-EG標準品溶液。

在裝有磁力攪拌器的15mL頂空瓶中分別加入上述標準品溶液10mL，分別加入步驟a中制備的內標物100μL和2.5g的NaCl。將頂空瓶置于磁力加熱攪拌裝置上，在50℃預先加熱平衡10min，調整磁力攪拌轉速為850rpm，插入萃取頭，在55℃下頂空固相微萃取45min。

其中，萃取頭為美國Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。

d.氣相色譜-質譜檢測：萃取結束后，將上述步驟b、c的萃取手柄分別插入氣相色譜儀的進樣口進樣，解析5min，得到待測紅葡萄酒樣品溶液中4-EP、4-EG和內標物的峰面積，以及4-EP標準品、4-EG標準品和內標物的峰面積。

檢測條件：

檢測儀器為現(xiàn)有的美國安捷倫公司GC6890/MS5973型氣相色譜/質譜聯(lián)用儀。

1.氣相色譜檢測條件：

1)氣相色譜進樣方式為SPME無分流進樣；

2)色譜柱為美國安捷倫公司的HP-INNO-WAX，規(guī)格為60.0m×0.25mm×0.25μm；

3)氣相色譜升溫程序：初始溫度50℃保持3分鐘，之后以10℃/min升至150℃，再以5℃/min升至180℃，再以10℃/min升至210℃，保持16min。

4)載氣為高純度氮氣，流量1mL/min。

5)檢測器溫度250℃，進樣口溫度250℃。

2.質譜條件：

1)質譜儀電離源為EI電離源，電子能量為70eV，掃描范圍(m/z)：50～500AMU，離子源溫度250℃。

2)質譜分析結束后，分析結果運用NIST2005標準譜庫進行檢索。

e.標準曲線的計算：以標準品峰面積與內標物峰面積之比為響應值A，即

響應值A＝標準品峰面積/內標物峰面積；

根據(jù)響應值與標準品溶液濃度之間存在的線性關系，制成標準曲線。

f.待測紅葡萄酒樣品中4-EP、4-EG濃度的計算：以待測紅葡萄酒樣品中4-EP、4-EG的峰面積分別與內標物的峰面積之比為響應值B_4-EP、B_4-EG，即

B_4-EP＝待測紅葡萄酒樣品中4-EP峰面積/內標物峰面積，

B_4-EG＝待測紅葡萄酒樣品中4-EG峰面積/內標物峰面積,

通過步驟e中得到的標準曲線計算待測紅葡萄酒樣品中4-EP、4-EG濃度。

通過下述方法驗證上述一種同時檢測紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量的方法。

1.紅葡萄酒中4-EP和4-EG含量的精密度檢測：

精確稱取1mg純度為色譜純的對-甲酚標準品，用純度為色譜純的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存，作內標物使用。

分別精確稱取純度為色譜純的4-EP標準品1mg和純度為色譜純的4-EG標準品1mg，用純度為色譜純的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存。用純度為色譜純的乙醇稀釋，分別配制50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L和3000μg/L的4-EP標準品溶液；5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的4-EG標準品溶液。

在裝有磁力攪拌器的15mL頂空瓶中分別加入上述標準品溶液10mL，分別加入上述內標物100μL和2.5g的NaCl。將頂空瓶置于磁力加熱攪拌裝置上，在50℃預先加熱平衡10min，調整磁力攪拌轉速為850rpm，插入萃取頭，在55℃下頂空固相微萃取45min。

其中，萃取頭為美國Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。

萃取結束后，將萃取手柄插入氣相色譜儀的進樣口進樣，解析5min。得到4-EP標準品、4-EG標準品和內標物的峰面積。

以標準品峰面積與內標物峰面積之比為響應值A，即

響應值A＝標準品峰面積/內標物峰面積。

根據(jù)響應值與標準品溶液濃度之間存在的線性關系，制成標準曲線。

經過檢測，得到的標準曲線方程為：

4-EP標準曲線線性回歸方程為Y＝0.0001X+0.0084，線性相關系數(shù)R²＝0.9971。

4-EG標準曲線線性回歸方程為Y＝0.0006X+0.0217，線性相關系數(shù)R²＝0.9946。

4-EP標準曲線圖如圖1所示，4-EG標準曲線圖如圖2所示，4-EP與4-EG標準品氣相色譜圖如圖3所示。使用本發(fā)明所提供的4-EP和4-EG含量的測定方法得到的4-EP和4-EG標準曲線的線性相關系數(shù)R²＞0.99，表明本方法精密度高。

2.紅葡萄酒中4-EP和4-EG含量的回收率檢測：

取待測紅葡萄酒樣品分別進行兩個濃度的加標試驗。

精確稱取純度為色譜純的對-甲酚標準品1mg，用純度為色譜純的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存，作內標物使用。

(1)4-EP和4-EG標準品的添加量為1.0mg/L和2.0mg/L。

在裝有磁力攪拌器的15mL頂空瓶中加入待測紅葡萄酒樣品10ml，加入上述內標物100μL和2.5g的NaCl，加入4-EP標準品1.0mg/L、4-EG標準品2.0mg/L。將頂空瓶置于磁力加熱攪拌裝置上，在50℃預先加熱平衡10min，調整磁力攪拌轉速為850rpm，插入萃取頭，在55℃下頂空固相微萃取45分鐘。萃取結束后，將萃取手柄插入氣相色譜儀的進樣口進樣，解析5min，得到4-EP、4-EG和內標物的峰面積。

其中，萃取頭為美國Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。

(2)4-EP和4-EG標準品的添加量為0.2mg/L、0.4mg/L。

在裝有磁力攪拌器的15mL頂空瓶中加入待測紅葡萄酒樣品10ml，加入上述內標物100μL和2.5g的NaCl，加入4-EP標準品0.2mg/L、4-EG標準品0.4mg/L。將頂空瓶置于磁力加熱攪拌裝置上，在50℃預先加熱平衡10min，調整磁力攪拌轉速為850rpm，插入萃取頭，在55℃下頂空固相微萃取45分鐘。萃取結束后，將萃取手柄插入氣相色譜儀的進樣口進樣，解析5min，得到4-EP、4-EG和內標物的峰面積。

其中，萃取頭為美國Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。

上述兩個加標水平回收率見表1。

表1紅葡萄酒中4-EP和4-EG在兩個加標水平的回收率(n＝5)

(注：n為平行試驗個數(shù))

綜上所述，本專利所提供的紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量檢測方法回收率較高，相對標準偏差較低。

3.實際檢測：

采用上述經過驗證的紅葡萄酒中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚含量檢測方法，對紅葡萄酒樣品進行實際檢測。

圖4為實際檢測中紅葡萄酒樣品中4-乙基苯酚與4-乙基愈創(chuàng)木酚以及內標物的氣相色譜圖。