本發(fā)明涉及一種化合物檢測方法，具體涉及一種茶多酚中EGCG含量的檢測方法。
背景技術(shù)：
：癌癥已成為21世紀(jì)威脅人類生存的頭號殺手，平均每年有600多萬人死于各種癌癥。中國已成為世界癌癥高發(fā)國之一，每年新增200多萬名癌癥患者，占全球總數(shù)的20％，并且每年呈快速增長趨勢。臨床上目前治療癌癥的藥物主要是化學(xué)藥品，但由于化學(xué)藥物毒性大，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也無選擇性的殺死白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等自身免疫細(xì)胞，導(dǎo)致各種并發(fā)癥和嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而且療程長，費(fèi)用高，在臨床使用中有較大的局限性。中藥在治療癌癥方面有獨(dú)特的優(yōu)勢，以中藥為代表的天然藥物具有毒副作用小、作用靶點(diǎn)多樣、耐受性好等特點(diǎn)，在治療腫瘤方面越來越受到重視。茶多酚，又名抗氧靈、維多酚、防哈靈，是茶葉中所含的一類多羥基類化合物，簡稱TP，主要化學(xué)成分為兒茶素類(黃烷醇類)、黃酮及黃酮醇類、花青素類、酚酸及縮酚酸類、聚合酚類等化合物的復(fù)合體。其中兒茶素類化合物為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的65％～80％。兒茶素類化合物主要包括兒茶素(EC)、沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素沒食子酸酯(ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)4種物質(zhì)。研究表明，茶多酚等活性物質(zhì)具解毒和抗輻射作用，能有效地阻止放射性物質(zhì)侵入骨髓，并可使鍶90和鈷60迅速排出體外，被健康及醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“輻射克星”。EGCG為茶多酚中的主要的組成成分之一，本發(fā)明的發(fā)明者研究發(fā)現(xiàn)，目前尚未有有效的檢測方法對其進(jìn)行質(zhì)量控制，研究及開發(fā)一種適合于常規(guī)檢測EGCG含量的檢測方法則顯得尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種茶多酚中EGCG含量的檢測方法,該方法操作簡單，具有良好的精密度、重現(xiàn)性和可靠性，可用于EGCG含量的檢測和質(zhì)量控制。技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的一種茶多酚中EGCG含量的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)設(shè)定高效液相色譜條件：色譜柱為C18，以濃度為0.1％-0.2％的乙酸水溶液為流動相A，以體積比為(60-70)：(30-40)甲醇-乙腈為流動相B，洗脫方式為梯度洗脫，流速為0.8-1.2mL·min，柱溫為20-40℃，檢測波長為275-281nm，進(jìn)樣量10-20μl；所述流動相A和B在液相進(jìn)行過程中的體積比為(75-90)：(10-25)；(2)制備對照品溶液：稱取EGCG對照品，加入流動相A制成溶液，作為對照品溶液；(3)制備供試品溶液：稱取茶多酚粉末，加入流動相A，超聲提取，靜置，搖勻，濾過，作為供試品溶液；(4)含量測定：分別取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后，利用色譜圖計(jì)算EGCG的含量。作為優(yōu)選，步驟(1)所述流動相A中乙酸的濃度為0.1％。作為優(yōu)選，步驟(1)所述流動相B中甲醇-乙腈的體積比為60：40。作為優(yōu)選，步驟(1)所述流速為1.00mL·min-1，柱溫為35℃，檢測波長為278nm，進(jìn)樣量20μl。作為優(yōu)選，所述流動相A和B在液相進(jìn)行過程中0分鐘開始的體積比為90:10；20分鐘開始為75:25；35分鐘開始后為90:10。所述檢測方法，還包括對EGCG對照品溶液濃度X和峰面積積分值Y進(jìn)行線性回歸的步驟；所述步驟為制備不同濃度的對照品溶液按上述色譜條件進(jìn)行測定，得到不同的峰面積積分值，以峰面積積分值(Y)和對照品溶液濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。所述檢測方法，還包括對高效液相色譜儀進(jìn)行精密度檢測的步驟；所述步驟為將制備的對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行測定，得到不同的峰面積積分值，計(jì)算RSD，分析儀器精密度。所述檢測方法，還包括對供試品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測的步驟；所述步驟為制備供試品溶液，按上述色譜條件在不同時(shí)間分別進(jìn)樣測定，測得不同峰面積積分值，計(jì)算RSD，分析供試品溶液的穩(wěn)定性。所述檢測方法，還包括檢驗(yàn)EGCG含量的檢測方法的重復(fù)性的步驟；所述步驟為制備多份平行供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定，測得不同峰面積積分值，計(jì)算RSD，分析所述方法重復(fù)性。所述檢測方法，還包括進(jìn)行加樣回收率實(shí)驗(yàn)的步驟；所述步驟為取已知含量的EGCG樣品，加入相應(yīng)量的對照品，按上述方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率。所述檢測方法，還包括進(jìn)行EGCG定量限測定的步驟；所述步驟為將制備的對照品溶液稀釋測定，測得信噪比10∶1時(shí)，分析EGCG的最低檢測濃度。所述檢測方法，還包括EGCG檢測限測定的步驟；所述步驟為將制備的對照品溶液稀釋測定，測得信噪比3：1時(shí)，分析EGCG的最低檢測濃度。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的茶多酚中EGCG含量的檢測方法具有以下優(yōu)點(diǎn)；本發(fā)明所述檢測方法以梯度洗脫方式，能有效地分離開茶多酚中較難分離的EGCG和EC兩種主要成分；且該方法簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，樣品分離度、對稱性及峰形均較好，且保留時(shí)間適中，更加適合于常規(guī)檢測，可有效用于EGCG含量的檢測和質(zhì)量控制。附圖說明圖1為EGCG的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為實(shí)施例4EGCG對照品溶液的高效液相色譜圖；圖3為實(shí)施例7EGCG樣品重復(fù)性檢測的高效液相色譜圖；圖4為某一批次EGCG樣品的高效液相色譜圖；圖5為另一批次EGCG樣品的高效液相色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1檢測方法(1)設(shè)定高效液相色譜條件：色譜柱為AgilentEclipseXDB-C18：4.6×250mm，5um，以濃度為0.1％的乙酸水溶液為流動相A，以體積比為60:40甲醇-乙腈為流動相B，洗脫方式為梯度洗脫，流速為1.0mL·min-1，柱溫為35℃，檢測波長為278nm，進(jìn)樣量20μl，流動相A和B在液相進(jìn)行過程中0分鐘開始的體積比為90:10；20分鐘開始為75:25；35分鐘開始為90:10；理論板數(shù)按EGCG計(jì)算應(yīng)不低于2000。(2)制備對照品溶液：稱取EGCG對照品20mg，精密稱定，置于50ml容量瓶中，加入流動相A，稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.400mg·ml-1的溶液，作為對照品溶液(3)制備供試品溶液:稱取供試品粉末30mg，置于50ml容量瓶中，加入流動相A30ml，超聲提取20min，靜置，再用流動相A稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。(4)含量測定：分別取對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，進(jìn)行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后，利用色譜圖計(jì)算EGCG的含量。實(shí)施例2設(shè)定高效液相色譜條件中：以濃度為0.2％的乙酸水溶液為流動相A，以體積比為70:30甲醇-乙腈為流動相B，洗脫方式為梯度洗脫，流速為1.2mL·min-1，柱溫為40℃，檢測波長為281nm，進(jìn)樣量15μl。其他步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3設(shè)定高效液相色譜條件中：以濃度為0.15％的乙酸水溶液為流動相A，以體積比為65:35甲醇-乙腈為流動相B，洗脫方式為梯度洗脫，流速為0.8mL·min-1，柱溫為20℃，檢測波長為275nm，進(jìn)樣量10μl。其他步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4：對EGCG對照品溶液濃度X和峰面積積分值Y進(jìn)行線性回歸分別精密稱取對照品，置于10mL容量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，使得含EGCG分別為0.01、0.1、0.2、0.5、1.0mg·mL-1的對照品溶液，分別精密吸取上述各對照品溶液20μL，按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)行測定，分別得到峰面積積分值為259004、2529224、5178128、12831624、25653229，以峰面積積分值(Y)對對照品溶液濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝25655690X+2882，R2＝1。圖2為EGCG對照品溶液的高效液相色譜圖。如圖2所示：EGCG檢測濃度在0.0100-1.0mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。實(shí)施例5：對高效液相色譜儀進(jìn)行精密度檢測精密吸取濃度為0.400mg·mL-1的對照品溶液20μL，按實(shí)施例1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值分別為：10265234、10192922、10232940、10244329、10186548、10，192215。結(jié)果，RSD＝0.3％，表明儀器精密度良好。實(shí)施例6：對供試品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測精密量取同一供試品溶液20μL，分別在0、2、4、6、8、12、24h按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)樣測定，測得峰面積積分值分別為：7828097、7814725、7817417、7826391、7819932、7826749、7825873。結(jié)果：RSD＝0.1％，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。實(shí)施例7：檢驗(yàn)EGCG的含量檢測方法的重復(fù)性稱取同一EGCG樣品粉末約30mg，平行6份，精密稱定，按實(shí)施例1色譜條件所述方法制備供試品溶液，精密吸取20μL，按實(shí)施例1色譜條件測定。圖3為EGCG樣品的高效液相色譜圖。如圖3所示：上述平行六份樣品，最終測得峰面積積分值分別為：8123183、8127338、8119935、8235958、8120341、8126885。結(jié)果，RSD＝0.4％，表明本發(fā)明所述方法重復(fù)性較好。實(shí)施例8：加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的EGCG樣品9份，每份約30mg，精密稱定，加入相應(yīng)量的對照品，按上述方法制備供試品溶液，按實(shí)施例1色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。表1加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝9)實(shí)施例9：EGCG定量限測定將對照品溶液稀釋測定，測得信噪比為10∶1時(shí)，EGCG的最低檢測濃度為0.1000μg·mL-1。實(shí)施例10：EGCG檢測限測定將對照品溶液稀釋測定，測得信噪比為3∶1時(shí)，EGCG的最低檢測濃度為0.0300μg·mL-1。試驗(yàn)例1樣品含量測定取2個(gè)不同批次的供試品粉末各約30mg，精密稱定，按照實(shí)施例1的方法制成供試品溶液，分別取供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)行高效液相色譜儀的操作，并記錄色譜圖，然后，利用色譜圖計(jì)算EGCG的含量。圖4為某一批次的EGCG樣品的高效液相色譜圖序號為1，批次為20160101；圖5為另一批次的EGCG樣品的高效液相色譜圖序號為2，批次為20160102。根據(jù)圖4和圖5的高效液相色譜圖，得到各批次的EGCG樣品含量測定結(jié)果如表2所示：表2不同批次的EGCG樣品含量測定結(jié)果序號批次含量12016010167.3％22016010268.2％上述EGCG含量測定方法實(shí)現(xiàn)了對EGCG的質(zhì)量檢測，經(jīng)過試驗(yàn)表明，該方法線性關(guān)系、重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性、回收率均較好，且本發(fā)明所述方法準(zhǔn)確、簡便、快捷，能夠更有效、全面的控制EGCG的質(zhì)量。當(dāng)前第1頁1 2 3