本發(fā)明屬于生化分析測試技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及氧化酶及其相關(guān)反應(yīng)的電位型傳感器。

背景技術(shù)：

氧化酶在生命活動中具有重要的生理意義，異常的氧化酶活度與代謝紊亂緊密相關(guān)因而在臨床分析中被廣泛的用于疾病的早期診斷。傳統(tǒng)的分析方法多采用酶促反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化及比色反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)酶活度的檢測，這種方法靈敏度較低，且有時(shí)需要借助光譜學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)定量檢測。簡單、靈敏的檢測方法有助于臨床分析及疾病治療方案的優(yōu)化。

芳香性硫酚具有很強(qiáng)的還原性，可作為很多氧化反應(yīng)的底物。同時(shí)，我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芳香性硫醇雖然為電中性物質(zhì)，但是可以在陰離子交換劑摻雜的聚合物膜上產(chǎn)生陰離子的電位響應(yīng)。利用芳香性硫酚的還原性和電位響應(yīng)性能，可以發(fā)展一種關(guān)于氧化酶及其相關(guān)反應(yīng)的高靈敏電位型傳感器。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、靈敏的氧化酶及其相關(guān)反應(yīng)的電位型傳感器及其檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種氧化酶及其相關(guān)反應(yīng)的電位型傳感器：以摻雜陰離子交換劑的聚合物膜作為傳導(dǎo)電位信號的電位型傳感器，并以芳香性硫酚作為指示劑。

其是，利用芳香性硫酚的還原性，它可以作為多種氧化酶的底物；氧化產(chǎn)生的S-S偶聯(lián)產(chǎn)物具有與底物不同的電位響應(yīng)性能，使用陰離子交換劑摻雜的聚合物膜傳導(dǎo)電位信號，可以實(shí)現(xiàn)對多種氧化酶及其類似物與相關(guān)反應(yīng)的電位檢測；該方法是一種高靈敏、通用的氧化酶電位型檢測平臺。

所述的硫酚為芳香性硫酚或其苯基取代物。

它們?yōu)楸搅蚍?、對氨基苯硫酚、對氯苯硫酚、對氟苯硫酚、對甲基苯硫酚或?qū)籽趸搅蚍印?/p>

所述的氧化酶可以為辣根過氧化物酶、多酚氧化酶、漆酶或核酸酶，所述的相關(guān)反應(yīng)為能夠引起酶活性改變的反應(yīng)。

所述電位型傳感器需由聚合物膜電極傳導(dǎo)電位信號，聚合物膜電極由三部分構(gòu)成：膜基體、增塑劑及陰離子交換劑；膜基體可以為聚氯乙烯、聚氨酯、硅橡膠、醋酸纖維、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯；增塑劑可以為鄰硝基苯辛醚、鄰苯二甲酸二辛酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、己二酸二辛酯、癸二酸二辛酯；陰離子交 換劑可以為三十二烷基一甲基氯化銨、四十二烷基氯化銨、三十二烷基一甲基溴化銨、四十二烷基溴化銨。

檢測過程包括以下步驟：

(1)以聚合物膜電極為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極進(jìn)行電位檢測；

(2)記錄工作電極在pH為7.4的50mM磷酸緩沖溶液中的初始電位值，向該溶液中加入一定濃度的芳香性硫酚，記錄電位值至電位穩(wěn)定；

(3)向上述溶液中分別加入氧化酶、模擬酶或相關(guān)反應(yīng)的反應(yīng)物儲備液，使溶液中含有不同活度的氧化酶、模擬酶或相關(guān)反應(yīng)的反應(yīng)物，記錄電位的變化情況；

(4)以不同濃度氧化酶、模擬酶或相關(guān)反應(yīng)的反應(yīng)物產(chǎn)生的電位信號變化值為縱坐標(biāo)，活度或濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；

(5)按照(1)-(3)的步驟對實(shí)際樣品進(jìn)行測試，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算樣品中氧化酶、模擬酶或相關(guān)反應(yīng)的反應(yīng)物的活度或濃度值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的檢測原理圖。

圖2為實(shí)施例1中底物優(yōu)化的結(jié)果圖。

圖3為實(shí)施例1中不同濃度辣根過氧化物酶的電位響應(yīng)圖及工作曲線(a為無過氧化氫條件下的結(jié)果，b為加入10mM過氧化氫條件下的結(jié)果)。

具體實(shí)施方式

利用芳香性硫酚的還原性，它可以作為多種氧化酶的底物；氧化產(chǎn)生的S-S偶聯(lián)產(chǎn)物具有與底物不同的電位響應(yīng)性能，使用陰離子交換劑摻雜的聚合物膜傳導(dǎo)電位信號，可以實(shí)現(xiàn)對多種氧化酶及其類似物與相關(guān)反應(yīng)的電位檢測。檢測原理見圖1。

實(shí)施例1

本發(fā)明以辣根過氧化物酶的檢測為例。其操作步驟如下：

(1)聚合物膜電極的制備

稱取196mg聚氯乙烯、196mg鄰硝基苯辛醚、4.54mg三十二烷基甲基氯化銨溶于3.5mL四氫呋喃中，攪拌均勻后倒入固定在玻璃板上的內(nèi)徑為3.5cm的玻璃環(huán)中。待四氫呋喃揮發(fā)完畢后，使用打孔器將膜切割為內(nèi)徑為3mm的小圓片并粘貼到底部套有PVC管的移液槍槍頭上。使用10mM的NaCl溶液作為內(nèi)充液及活化液活化電極，待用。

(2)底物的優(yōu)化

配制pH值為7.4的磷酸緩沖溶液中，以聚合物膜電極為指示電極、飽和甘汞電極為參比電極，記錄初始電位值。分別向緩沖溶液中加入10-4M不同種類的芳香性硫酚，如對硝基苯硫酚、對氯苯硫酚、對甲基苯硫酚、對甲氧基苯硫酚等，記錄電位值。向上述溶液中加入10mM過氧化氫及10^-3U/mL 的辣根過氧化物酶，記錄電位值。根據(jù)電位值得變化挑選底物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

(3)辣根過氧化物酶的電位檢測

以對硝基苯硫酚為底物，向pH為7.4的磷酸緩沖溶液中加入苯硫酚儲備液，使其最終濃度為10-4M，記錄電位值。待電位穩(wěn)定后，向溶液中加入(10mM過氧化氫)不同活度度的辣根過氧化酶溶液，繼續(xù)記錄電位值。根據(jù)電位響應(yīng)值繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。