孔雀石綠殘留快速檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種孔雀石綠殘留快速檢測試紙條。試紙條包括微孔試劑和試紙，微孔試劑中凍干有金標記抗孔雀石綠單克隆抗體，試紙底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護膜固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯(lián)孔雀石綠的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“‖”。試紙條具有以下優(yōu)點：特異性強、敏感性高、操作簡便、快速，結(jié)果顯示形象、直觀、準確，并且成本低，應(yīng)用范圍廣，易于推廣應(yīng)用。
【專利說明】孔雀石綠殘留快速檢測試紙條
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及一種檢測獸藥的器具，特別是涉及一種孔雀石綠殘留快速檢測試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]孔雀石綠(Malachite Green, MG)又名堿性綠、鹽基塊綠、孔雀綠和中國綠，為帶有金屬光澤的綠色結(jié)晶體，化學(xué)名稱為四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式為C23H25N2Cl，分子量為364.92，易溶于水、甲醇和乙醇，溶液呈藍綠色?？兹甘G是一種人工合成的三苯基甲烷類工業(yè)染料，主要用于制陶、紡織、皮革和食品等產(chǎn)業(yè)上的顏色劑和細胞化學(xué)上的染色劑等?？兹甘G具有抗菌、殺蟲等功效，是藥用染料中抗菌效力較強的一類，被廣泛用作驅(qū)蟲劑和殺蟲劑，以殺滅水產(chǎn)動物體外的寄生蟲，原生動物和魚卵中的霉菌等?？兹甘G對防治水霉病等有特效，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾大量使用。但近年來國內(nèi)外的研究表明，孔雀石綠為潛在的致癌、致畸、致突變物質(zhì)，而其代謝物無色孔雀石綠被確證具有高毒、高殘留和三致作用，因此，孔雀石綠的使用污染水環(huán)境，其代謝物無色孔雀石綠對水生物及人體健康造成極大危害。美國、加拿大、日本、歐盟等許多國家都將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，歐盟規(guī)定水產(chǎn)品中孔雀石綠和無色孔雀石綠總量不得超過2 μ g/kg，我國于2002年5月也將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中。
[0003]目前，測定孔雀石綠的主要方法是色譜分析方法(包括高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法)以及酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。色譜技術(shù)是非常有效、準確、敏感的方法，但是待檢樣品需經(jīng)一系列的預(yù)處理，繁瑣費時，從樣品預(yù)處理到得出檢驗結(jié)果至少需2?3天時間，檢測費用很高；另一方面這種檢測方法還必須有昂貴的儀器設(shè)備，只有特定的專業(yè)人員才能應(yīng)用，而且每次檢測的樣品有限，不適應(yīng)大批樣品的篩查，嚴重阻礙了該檢測方法的推廣應(yīng)用，更不適合于現(xiàn)場檢驗。ELISA也是一種常用的檢測技術(shù)，它是以競爭性酶聯(lián)反應(yīng)為檢測原理，檢測全過程約需I?2小時。由于ELISA是一種敏感性很強的檢測方法，不同的操作者往往會出現(xiàn)不同的結(jié)果，所以該方法常常造成人為的誤檢和漏檢。因此在實際生產(chǎn)中亟需一種快速檢測孔雀石綠的方法。目前各級食品檢驗部門，尤其是外貿(mào)出口單位，加強了孔雀石綠的檢測力度，以確保人民群眾的動物性食品安全。因此研制靈敏、快速、準確的孔雀石綠檢測方法有著十分重要的意義。
實用新型內(nèi)容
[0004]本實用新型的目的是提供一種特異、敏感、快速、簡便的孔雀石綠殘留快速檢測試紙條。
[0005]本實用新型的技術(shù)方案:
[0006]一種孔雀石綠殘留快速檢測試紙條，包括微孔試劑和試紙，其特征在于:微孔試劑中凍干有金標記抗孔雀石綠單克隆抗體，試紙底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護膜固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯(lián)孔雀石綠的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“ Il ”，檢測印跡位于距離測試端纖維層一側(cè)5-8mm處，對照印跡位于距離檢測印跡4_7mm處。
[0007]支撐層是用不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條制成，測試端纖維層用玻璃棉、尼龍膜、聚偏二氯乙烯膜或聚酯膜制成，纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成，吸水材料層用吸水紙制成，在測試端纖維層上覆蓋有保護膜，保護膜上印制有樣品標記線，微孔試劑上具有微孔塞。
[0008]本實用新型的孔雀石綠殘留快速檢測試紙條具有以下優(yōu)點:
[0009](I)特異性強、靈敏度高。該試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無價健形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率；另一方面金標記抗孔雀石綠單克隆抗體凍干在微孔試劑中，在檢測過程中，能夠使金標抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個體系的反應(yīng)靈敏度。因此，本實用新型試紙條具有較高的特異性和靈敏度，對孔雀石綠的檢測靈敏度為2 μ g/L。
[0010](2)操作簡便、快速。使用試紙條檢測時無需任何其它試劑，只要將待檢樣品溶液滴加于微孔試劑中，混勻后，室溫(20-25) °C孵育5min,將試紙標有樣品標記線的一端向下，插入孵育后的微孔試劑中，室溫(20-25) °C孵育5min，觀察結(jié)果。
[0011](3)結(jié)果顯示形象、直觀、準確。檢測試紙以顯示紅色“ I ”、“ Il ”印跡及兩條紅色“ I ”印跡深淺比較作為陽性和陰性標記，即在纖維素膜上顯示一條紅色“ I ”印跡或紅色的檢測印跡“ I ”弱于紅色的對照印跡“ I ”，表示被檢測樣本液中孔雀石綠的含量高于或等于試紙條對孔雀石綠的最低檢測限，紅色的檢測印跡“ I ”強于紅色的對照印跡“ I ”或兩條紅色“ I ”印跡無差異，表示被檢測樣本中不含孔雀石綠或其含量低于試紙條對孔雀石綠的最低檢測限，結(jié)果判定形象、直觀、準確、簡單明了，不易出現(xiàn)誤判。
[0012](4)成本低、投資少。使用本實用新型試紙條，不需另配儀器設(shè)備及其它試劑，隨時隨地進行檢測，費用低廉，可節(jié)省大量貴重儀器及設(shè)備費用。
[0013](5)應(yīng)用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。試紙條操作簡單，能較好滿足不同層次人員的需要，如專業(yè)化驗、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測、水產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本實用新型試紙結(jié)構(gòu)示意圖；
[0015]圖2為本實用新型試紙俯視圖；
[0016]圖3為本實用新型微孔試劑圖；
[0017]圖4為本實用新型試紙條檢測結(jié)果判定圖。
【具體實施方式】
[0018]一、孔雀石綠殘留快速檢測試紙條的結(jié)構(gòu)
[0019](I)試紙(圖1、圖 2)
[0020]圖中I為測試端纖維層，用玻璃棉制成，2為纖維素膜層，采用硝酸纖維素膜，3為吸水材料層，用吸水紙制成，6為支撐層，用塑膠條制成，將編號1、2、3各層從左至右依次粘貼固定在支撐層6上，測試端纖維層I的末端與纖維素膜層2的始端相連，纖維素膜層2的末端與吸水材料層3相連，測試端纖維層I的始端與支撐層6的始端對齊，吸水材料層3的末端與支撐層6的末端對齊。在纖維素膜層2上，4為用偶聯(lián)孔雀石綠的載體蛋白溶液印上檢測印跡“ I ”，5為用羊抗鼠IgG溶液印上對照印跡“ I ”，兩印記平行排列形成組合印跡帶“ Il ”。7為覆蓋在測試端纖維層上的保護膜，保護膜上印有箭頭及MAX字樣。
[0021](2)微孔試劑(圖3)
[0022]圖中8為微孔試劑，其中凍干有金標記抗孔雀石綠單克隆抗體，9為微孔塞。
[0023]二、檢測樣品液的制備
[0024]( I)用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
[0025](2)稱取1.0g±0.05g均質(zhì)物至15ml新聚苯乙烯離心管中，加入Iml孔雀石綠提取劑I (3%氯化鈉溶液)，加入100 μ I提取劑2 (0.lmol/L鹽酸溶液)，加入100 μ I孔雀石綠提取劑3 (0.lmol/L硫酸溶液),潤動Imin,,加入4ml孔雀石綠提取劑4 (分析純乙腈)，渦動2min，再加入4g孔雀石綠凈化劑(無水硫酸鈉)，立即擰緊蓋子，輕輕敲打，上下振蕩，lmin，3000g 以上，室溫(20_25°C /68-77 °F)離心 5min ；
[0026](3)取Iml上清液至IOml新聚苯乙烯離心管中，加入100 μ I孔雀石綠氧化劑[11倍濃縮的3%過氧化氫溶液，現(xiàn)加現(xiàn)配，用孔雀石綠提取劑4將11 X濃縮氧化劑按1:10體積比進行稀釋(或按需量稀釋)(I份IlX濃縮氧化劑+10孔雀石綠提取劑4，加入到2ml聚苯乙烯離心管中，混勻)]。渦動5s，于50?60°C水浴氮氣流下吹干；
[0027](4)加入0.4ml復(fù)溶工作液(0.02mol/L磷酸緩沖液)渦動溶解2min，取100 μ I用于分析。
[0028]三、檢測操作方法
[0029]從原包裝(若低溫存放需要預(yù)先平衡至室溫)中取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙，并做好標記；用微量移液器吸取100 μ I待檢水產(chǎn)樣本溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻；室溫(20-25°C)孵育5min后，將標記好的試紙插入微孔中——印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中；再次室溫(20-25°C)孵育5min，取出試紙，判定結(jié)果。
[0030]四、檢測結(jié)果判斷
[0031]孔雀石綠在樣本中的含量高于或等于試紙條對其的最低檢測限時，金標記抗孔雀石綠單克隆抗體與孔雀石綠結(jié)合，進而封閉金標抗體上的抗原結(jié)合位點，阻止金標抗體與纖維素膜層上偶聯(lián)孔雀石綠的載體蛋白的檢測印跡結(jié)合，不能顯示檢測印跡或檢測印跡顯色弱于對照印跡，而羊抗鼠IgG則可與金標抗體結(jié)合，形成對照印跡。陰性樣本在檢測過程中由于缺少抗原抗體競爭反應(yīng)，檢測印跡顯色將會強于對照印跡或兩者無差異，同樣羊抗鼠IgG也與金標抗體結(jié)合,形成對照印跡。如圖4所示。
[0032]陽性:對照印跡(C)顯示一條紅色條帶，而檢測印跡(T)顯色明顯弱于對照印跡(C)或不顯色，判為陽性，如圖4a、4b所示。
[0033]陰性:對照印跡(C)顯示一條紅色條帶，檢測印跡(T)顯色強于對照印跡(C)或與對照印跡(C)顯色無差異，判為陰性，如圖4c、4d所示。
[0034]無效:對照印跡(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測印跡(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙均判為無效，如圖4e、4f所示。[0035]五、檢測試紙條中用到的材料制備方法
[0036]1、孔雀石綠與載體蛋白的偶聯(lián)
[0037]孔雀石綠是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。
[0038](I)孔雀石綠半抗原的制備
[0039]取0.5g間羧基苯甲醒、1.3g無水氯化鋅于干燥的圓底燒瓶中，加40ml無水乙醇，充分攪拌后，加入1.5ml N，N-二甲基苯胺，向裝置內(nèi)充入氮氣，油浴加熱，回流過夜。停止反應(yīng)，冷卻到室溫，加lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值到6，此時有大量沉淀物析出，抽濾，得綠色固體，用甲醇溶解，旋蒸濃縮，上硅膠柱，石油醚:乙酸乙酯=1:1洗脫得產(chǎn)品0.46g，經(jīng)氫譜實驗鑒定，結(jié)構(gòu)正確。
[0040](2)免疫原的制備——孔雀石綠與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)
[0041]取13mg半抗原,溶解于Iml 二甲基甲酰胺(DMF)中；取20mg碳化二亞胺(EDC)用
0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取BSA30mg，使之充分溶解在2.8ml0.lmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.01mol/L PBS4°C透析3d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0042](3)包被原的制備——孔雀石綠與卵清蛋白(OVA)的偶聯(lián)
[0043]取13mg半抗原，溶解于Iml DMF中；取20mg EDC用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取0VA30mg，使之充分溶解在
2.8ml0.lmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h,用0.01mol/L PBS4O透析3d,每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0044](4)孔雀石綠與載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定
[0045]將孔雀石綠半抗原、載體蛋白、孔雀石綠與載體蛋白的偶聯(lián)物用PH7.4的PBS配成
0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長200?800nm范圍內(nèi)掃描，得到孔雀石綠半抗原、載體蛋白、孔雀石綠與載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明孔雀石綠與載體蛋白偶聯(lián)成功。
[0046]2、孔雀石綠單克隆抗體的制備
[0047]( I)動物免疫
[0048]將步驟I得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)生
抗血清。
[0049](2)細胞融合和克隆化
[0050]取免疫Balb/c小鼠脾細胞,按8:1 (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合,篩選得到穩(wěn)定分泌孔雀石綠單克隆抗體的孔雀石綠單克隆雜交瘤細胞株。
[0051](3)細胞凍存和復(fù)蘇
[0052]將雜交瘤細胞用凍存液制成IX IO6個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0053](4)單克隆抗體的制備與純化
[0054]增量培養(yǎng)法:將雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。
[0055]所述細胞培養(yǎng)基為向RPMI1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細胞培養(yǎng)基中的終濃度為
0.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
[0056]3、羊抗鼠IgG的制備
[0057]以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠IgG0
[0058]4、金標記抗孔雀石綠單克隆抗體的制備
[0059](I)膠體金的制備
[0060]用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01% (質(zhì)量百分含量)，取IOOml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2.5mll%檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。
[0061](2)金標記抗孔雀石綠單克隆抗體的制備
[0062]在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀溶液調(diào)膠體金的pH至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入20?50 μ g的標準向膠體金溶液中加入上述孔雀石綠單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置IOminJPA 10%BSA，使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置IOmin0 12000r/min, 4°C離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4°c備用。
[0063]復(fù)溶緩沖液:含牛血清白蛋白0.1%?0.3%(體積百分含量)、吐溫-800.05%?0.2%(質(zhì)量百分含量)、PH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。
[0064]5、將金標記抗孔雀石綠單克隆抗體凍干到微孔中
[0065]向微孔試劑微孔中加入100 μ I金標記抗孔雀石綠單克隆抗體，放入冷凍干燥機中，在冷阱溫度為-50°C條件下，預(yù)凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有金標記抗孔雀石綠單克隆抗體的微孔試劑，密封保存。
[0066]6、測試端纖維層的制備
[0067]將玻璃棉置于含0.5%牛血清白蛋白(體積百分含量)、pH7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37°C烘2h備用。
[0068]7、纖維素膜層的制備
[0069]包被過程:用磷酸緩沖液將孔雀石綠與卵清蛋白的偶聯(lián)物稀釋到10mg/ml，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測印跡(T)，包被量為l.0yg/cm2;用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG稀釋到200 μ g/ml，用Isoflow點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的對照印跡(C)，包被量為l.0yg/cm2。將包被好的纖維素膜置于37°C條件下干燥2h，備用。
【權(quán)利要求】
1.一種孔雀石綠殘留快速檢測試紙條，包括微孔試劑和試紙，其特征在于:微孔試劑中凍干有金標記抗孔雀石綠單克隆抗體，試紙底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護膜固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯(lián)孔雀石綠的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“ Il ”。
2.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:檢測印跡位于距離測試端纖維層一側(cè)5-8mm處,對照印跡位于距離檢測印跡4_7mm處。
3.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:支撐層是用不吸水的硬質(zhì)塑膠條或硬紙條制成。
4.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:測試端纖維層用玻璃棉、尼龍膜、聚偏二氯乙烯膜或聚酯膜制成。
5.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
6.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:吸水材料層用吸水紙制成。
7.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:在測試端纖維層上覆蓋有保護膜，保護膜上印制有樣品標記線。
8.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于:微孔試劑上具有微孔塞。
【文檔編號】G01N33/577GK203502416SQ201320148188
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月28日
【發(fā)明者】何方洋, 萬宇平, 付軍權(quán), 聶雯瑩, 楊昌松, 崔廷婷, 崔海峰, 馮月君 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司