專利名稱：孔雀石綠快速檢測方法及快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種孔雀石綠快速檢測方法及快速檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
目前孔雀石綠的檢測多采用高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜法。液相方法處理方法繁瑣、花費時間較長，相對而言，氣相色譜方法處理方法比較簡單，但兩者所用設(shè)備均比較昂貴，對實驗人員的技術(shù)要求很高，不適宜現(xiàn)場檢測，且所用試劑(乙腈)毒性很大。
現(xiàn)在市場上所采用的快速檢測方法分為兩種孔雀石綠固相萃取柱和酶聯(lián)免疫試劑盒、試紙。就前者而言，多數(shù)廠家只在生產(chǎn)和銷售用于水體中檢測孔雀石綠的固相萃取柱，而水產(chǎn)品由于其基體成分非常復雜，前處理過程要求較高，而成為制約研發(fā)的難點。目前針對水產(chǎn)品進行孔雀石綠檢測的廠家很少，并且操作步驟繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種操作簡單，分離效果好的孔雀石綠快速檢測方法及快速檢測試劑盒。
一種孔雀石綠快速檢測方法，將待測樣品與提取劑混合后靜置，取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；所述的提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶15～30，優(yōu)選1∶20。
所述的待測樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3(m/v)；待測樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。
所述的層析柱在使用前用乙腈與乙酸乙酯混合液活化，乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。
所述的層析柱設(shè)有4塊篩板，4塊篩板間自下而上分別填充硅膠、衍生化劑、中性氧化鋁，所述的衍生化劑為質(zhì)量比1∶1的二氧化鉛和硅藻土，硅膠、衍生化劑、中性氧化鋁的質(zhì)量比為5∶3∶3。
一種孔雀石綠快速檢測試劑盒，包括提取劑1，提取劑1體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取劑2，酸性氧化鋁；洗滌液，洗滌液體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；檢測管1；檢測管2；根據(jù)通常使用要求，所述的孔雀石綠快速檢測試劑盒包括提取劑130mL，提取劑2，酸性氧化鋁5g；洗滌液5mL，檢測管150mL；檢測管250mL；孔雀石綠層析柱。所述的孔雀石綠快速檢測試劑盒還可以包括試劑盒類產(chǎn)品常配的吸耳球、1ml吸管、取樣勺等。
所述的試劑盒的使用方法如下(1)取水產(chǎn)品可食部分充分絞碎后，準確稱取10.0g于50mL檢測管1中，加入提取劑1、2振搖10分鐘，靜置1分鐘后，取上清液于檢測管2中；(2)用2mL洗滌液活化層析柱，將檢測管2中提取樣液分次全部加入層析柱中，每次最大加液量為3mL；(3)讓樣液流至與層析柱最上層篩板平齊；(4)待樣液全部過柱后，加入3mL洗滌液洗滌該柱；(5)觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可初步判斷樣品中含有孔雀石綠。
本發(fā)明采用乙腈-乙酸乙酯溶液提取，顯著降低了所用試劑的毒性。如果只用乙酸乙酯，則所需的提取時間較長，而且乙酸乙酯極性較小，對隱色孔雀石綠的溶解性好，但對孔雀石綠的溶解性差；而添加少量的乙腈一方面可以穿透細胞膜，加快提取速度，另一方面，它對孔雀石綠的溶解性比乙酸乙酯要好，可以使水產(chǎn)品中的孔雀石綠提取更完全。
由于水產(chǎn)品中基體非常復雜，采用乙腈-乙酸乙酯溶液作為提取液，與乙腈作為提取液相比，可以減少極性較大的物質(zhì)被提取出來，但它對脂肪的提取較多，為消除或降低脂肪的干擾，另外，本發(fā)明檢測方法中使用了兩次氧化鋁，一次在提取過程中添加酸性氧化鋁，可以抑制脂肪溶出，另一次在過層析柱時首先經(jīng)過中性氧化鋁柱，也可將脂肪吸附，所以本發(fā)明檢測方法對脂肪含量較高的產(chǎn)品也具有較強的適用性。
另外，采用硅膠作為吸附劑，不但降低了成本，而且不必擔心水產(chǎn)品本身的色素成分干擾顯色，因為它們具有脂溶性，在硅膠上不能吸附，隨樣液可以隨下，用洗滌液可將其洗滌下，不影響對柱體顏色的觀察。


圖1為本發(fā)明檢測試劑盒中層析柱的結(jié)構(gòu)示意圖；具體實施方式
層析柱的制作柱體直徑與5mL移液槍頭直徑等同，可制作針筒形狀，長度不可太短，可與5mL移液槍頭長度差不多，有刻度。最下層安裝一個篩板(篩板1)，防止所填吸附劑流下。篩板1上添加柱層析用硅膠0.5g，填入后用吸耳球輕輕敲實。加入篩板2，該篩板與柱體的密封性要求要好，防止其上的衍生化劑粉末隨樣液流入吸附劑層，對最終的觀察顯色造成干擾。篩板2上添加衍生化劑(二氧化鉛∶硅藻土＝1∶1)0.3g，輕輕敲實。然后，加入篩板3，并在其上添加0.3g中型氧化鋁，最后加篩板4，防止在運輸和放置過程中，柱中填料撒落丟失，影響使用效果(如下圖)。要求篩板材料對孔雀石綠的吸附性要小，另外，填料的用量隨柱體直徑的改變需適當調(diào)整。方便添加各填料和添加樣液檢測限可以達到4ug/kg，此限量時可觀察比較明顯的綠色環(huán)帶。
水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(1)將待測樣品與提取劑混合后靜置；提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20，待測樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3(m/v)，待測樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。取實施例1中制備的層析柱，用2mL乙腈與乙酸乙酯混合液活化，乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；
水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(2)將待測樣品與提取劑混合后靜置；提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶15，待測樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3(m/v)，待測樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。取實施例1中制備的層析柱，用2mL乙腈與乙酸乙酯混合液活化，乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；試劑盒的使用試劑盒的組成為提取劑1 30mL，提取劑1體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取劑2，酸性氧化鋁5g；洗滌液5mL，洗滌液體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；檢測管150mL；檢測管250mL；孔雀石綠層析柱；吸耳球。
操作步驟如下(1)取水產(chǎn)品可食部分充分絞碎后，準確稱取10.0g于50mL檢測管1中，加入提取劑1和提取劑2振搖10分鐘，靜置1分鐘后，取上清液于檢測管2中；(2)用2mL洗滌液活化層析柱，將檢測管2中提取樣液分次全部加入層析柱中，每次最大加液量為3mL，用吸耳球從上口加壓，加快流速，3mL樣液通過柱子的時間為0.5分鐘；(3)讓樣液流至與層析柱最上層篩板平齊；(4)待樣液全部過柱后，加入3mL洗滌液洗滌該柱；(5)觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠。
權(quán)利要求
1.一種孔雀石綠快速檢測方法，其特征在于將待測樣品與提取劑混合后靜置，取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；所述的提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶15～30，所述的待測樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3；待測樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。
2.如權(quán)利要求1所述的孔雀石綠快速檢測方法，其特征在于所述的提取劑中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。
3.如權(quán)利要求1或2所述的孔雀石綠快速檢測方法，其特征在于所述的層析柱在使用前用乙腈與乙酸乙酯混合液活化，乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶20。
4.如權(quán)利要求1所述的孔雀石綠快速檢測方法，其特征在于所述的層析柱設(shè)有4塊篩板，4塊篩板間自下而上分別填充硅膠、衍生化劑、中性氧化鋁，所述的衍生化劑為質(zhì)量比1∶1的二氧化鉛和硅藻土，硅膠、衍生化劑、中性氧化鋁的質(zhì)量比為5∶3∶3。
5.一種孔雀石綠快速檢測試劑盒，其特征在于包括提取劑1，提取劑1體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；提取劑2，酸性氧化鋁；洗滌液，洗滌液體積比組成為乙腈∶乙酸乙酯＝1∶20；檢測管1；檢測管2；孔雀石綠層析柱。
6.如權(quán)利要求5所述的孔雀石綠快速檢測試劑盒，其特征在于還包括吸耳球、吸管、取樣勺。
7.如權(quán)利要求5或6所述的孔雀石綠快速檢測試劑盒的使用方法(1)取水產(chǎn)品可食部分充分絞碎后，稱取10.0g于50mL檢測管1中，加入提取劑1、2振搖10分鐘，靜置1分鐘后，取上清液于檢測管2中；(2)用2mL洗滌液活化層析柱，將檢測管2中提取樣液分次全部加入層析柱中，每次最大加液量為3mL；(3)讓樣液流至與層析柱最上層篩板平齊；(4)待樣液全部過柱后，加入3mL洗滌液洗滌該柱；(5)觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若該吸附劑逐漸形成綠色環(huán)帶，可初步判斷樣品中含有孔雀石綠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種孔雀石綠快速檢測方法，將待測樣品與提取劑混合后靜置，取上清液加入層析柱中，觀察層析柱中最下層吸附劑顏色變化，若形成綠色環(huán)帶，可判斷樣品中含有孔雀石綠；提取劑為乙腈與乙酸乙酯混合液和酸性氧化鋁，其中乙腈與乙酸乙酯體積比＝1∶15～30，所述的待測樣品質(zhì)量與乙腈與乙酸乙酯混合液的體積比為1∶3；待測樣品與酸性氧化鋁的質(zhì)量比為2∶1。本發(fā)明采用乙腈－乙酸乙酯溶液提取，使水產(chǎn)品中的孔雀石綠提取更完全并且顯著降低了所用試劑的毒性，對脂肪含量較高的產(chǎn)品也具有較強的適用性。
文檔編號G01N30/00GK101067619SQ200710068348
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日
發(fā)明者沈建福, 張岳, 李蕾蕾, 陳秋平 申請人:浙江大學, 杭州安達生物科技有限公司