專利名稱：：孔雀石綠殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種動(dòng)物源性食品中孔雀石綠殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其使用方法。技術(shù)背景孔雀石綠具有潛在的致癌、致畸、致突變的作用，其在養(yǎng)殖業(yè)中的使用未得到美國食品與藥物管理局(FDA)的認(rèn)可；根據(jù)歐盟法案2002/675/EC規(guī)定，動(dòng)物源性食品中孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留總量限制為2ug/kg;日本的肯定列表也明確規(guī)定在進(jìn)口水產(chǎn)品中不得檢出孔雀石綠殘留；我國在農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY5071-2002無公害食品魚藥使用準(zhǔn)則》中也將孔雀石綠列為禁用藥物。2005年，福建、江西、安徽等省出口歐盟、日本、韓國的鰻魚產(chǎn)品先后被檢出孔雀石綠殘留，我國水產(chǎn)品出口因此受嚴(yán)重影響；2006年，上海市場(chǎng)上的多寶魚和香港市場(chǎng)上的桂花魚，也都檢出孔雀石綠殘留。水產(chǎn)品中孔雀石綠的殘留問題日益成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)?？兹甘G在水生動(dòng)物體內(nèi)會(huì)很快代謝成無色孔雀石綠，無色孔雀石綠的毒性甚至超過孔雀石綠。因此，有關(guān)法規(guī)對(duì)動(dòng)物源性食品中孔雀石綠殘留限量的規(guī)定都是以孔雀石綠和無色孔雀石綠的總量為限量指標(biāo)，要求相關(guān)的檢測(cè)方法能檢測(cè)出孔雀石綠和無色孔雀石綠總量。目前，孔雀石綠的檢測(cè)方法以理化檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法為主。通常，檢測(cè)孔雀石綠的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜一質(zhì)譜法(GC-MS)、理化檢測(cè)法和免疫分析技術(shù)(IA)等等。HPLC法與GC-MS法是孔雀石綠殘留檢測(cè)的確證方法，其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)精確度高，但因其儀器化程度高、檢測(cè)時(shí)間長、過程繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用昂貴等而阻礙其推廣應(yīng)用。理化檢測(cè)法多以有機(jī)溶劑萃取后過層析柱，然后觀察顏色進(jìn)行孔雀石綠殘留的判斷，此方法主觀性強(qiáng)，對(duì)微量殘留進(jìn)行很難測(cè)定，而且無法定量，因此很難符合檢測(cè)單位實(shí)際使用的要求。而酶聯(lián)免疫分析(ELISA)快速檢測(cè)技術(shù)因靈敏度高、特異性好、既可定性又可定量，且成本低、操作簡(jiǎn)單快速、一次檢測(cè)樣本量大、儀器化程度低現(xiàn)已成為常用的篩選方法。檢索相關(guān)文獻(xiàn)與專利發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)關(guān)于孔雀石綠免疫檢測(cè)的方法與試劑盒很少，檢索到一篇中國專利《水產(chǎn)品中孔雀石綠間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒》(申請(qǐng)?zhí)?00510060995.1)中提到一種孔雀石綠酶聯(lián)免疫試劑盒，此試劑盒采用的檢測(cè)原理為，酶標(biāo)板中包被有孔雀石綠抗原，樣品與包被抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合孔雀石綠抗體，洗滌去除未反應(yīng)試劑，然后再加入酶標(biāo)記抗抗體反應(yīng)，再洗滌，加入底物顯色，終止后，讀數(shù)；該試劑盒由于采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)模式，操作復(fù)雜、步驟多，檢測(cè)時(shí)間長，生產(chǎn)與保存成本高，很難滿足實(shí)際應(yīng)用的需求?？傊?，現(xiàn)有酶聯(lián)免疫試劑盒采用的檢測(cè)方法復(fù)雜、繁瑣，很難應(yīng)用于實(shí)踐，且現(xiàn)有技術(shù)由于普遍存在穩(wěn)定性差、樣品前處理及檢測(cè)步驟復(fù)雜、設(shè)備條件要求較高、價(jià)格昂貴等不足，嚴(yán)重影響了孔雀石綠殘留檢測(cè)與監(jiān)控，因此研制穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、廉價(jià)的孔雀石綠ELISA試劑盒具有非常重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有孔雀石綠檢測(cè)產(chǎn)品中存在的不足，提供一種高特異性、高靈敏度、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單，能大批量快速檢測(cè)孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供利用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)孔雀石綠殘留的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下測(cè)定原理首先將孔雀石綠抗原包被于固相載體，例如酶標(biāo)板上，然后加入標(biāo)樣或待測(cè)樣品，再加入酶標(biāo)記孔雀石綠抗體，包被抗原與待測(cè)樣品中的孔雀石綠競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗體，待測(cè)樣品孔雀石綠含量高時(shí)，則與固相抗原結(jié)合的酶標(biāo)抗體就少，反之結(jié)合在固相抗原上的酶標(biāo)抗體就多，反應(yīng)后加入底物進(jìn)行顯色加以測(cè)定，當(dāng)酶標(biāo)抗體量一定時(shí)，加入的待測(cè)樣品含孔雀石綠越多，與固相抗原結(jié)合酶標(biāo)抗體就越少，發(fā)色反應(yīng)減弱，百分吸光度值低，反之，則發(fā)色反應(yīng)增強(qiáng)，百分吸光度增高，因而根據(jù)百分吸光度值與孔雀石綠濃度之間的半對(duì)數(shù)關(guān)系作圖即得標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)曲線和待檢樣品的百分吸光度值，即可推算出待測(cè)樣品中孔雀石綠的濃度。本發(fā)明的具體技術(shù)方案為提供一種孔雀石綠殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包含下列成分(1)包被了孔雀石綠抗原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記孔雀石綠抗體工作液；(3)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液；(4)底物液；(5)底物緩沖液；(6)反應(yīng)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)樣品稀釋液。所述酶標(biāo)板是96孔或40孔酶標(biāo)板，酶標(biāo)板孔內(nèi)包被有能與抗孔雀石綠抗體特異結(jié)合的孔雀石綠抗原，其是使用重氮法將孔雀石綠與載體蛋白偶聯(lián)得到的，所用的包被液為pH9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液，碳酸鹽緩沖溶液含l2g碳酸鈉、24g碳酸氫鈉和雙蒸水1L，封閉液為15%脫脂奶粉溶液。所述孔雀石綠抗體的制備，所用的免疫原為采用重氮法將孔雀石綠半抗原與載體蛋白共價(jià)偶聯(lián)合成得到的，以免疫抗原免疫兔子或小鼠，制備孔雀石綠多克隆抗體、利用雜交瘤技術(shù)制備孔雀石綠單克隆抗體或利用基因工程方法制備基因工程抗體。收集抗血清、腹水、發(fā)酵液等，用辛酸硫酸銨沉淀純化或過親和層析柱進(jìn)行純化。所述酶標(biāo)記孔雀石綠抗體工作液為采用戊二醛法或過碘酸鹽氧化法將酶與孔雀石綠抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的。所用標(biāo)記酶可為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取堿性磷酸酯酶，本發(fā)明優(yōu)選為辣根過氧化物酶，且采用改良后的過碘酸鹽氧化法進(jìn)行標(biāo)記，提高了標(biāo)記效率，節(jié)省了酶與抗體的用量，保證標(biāo)記后酶與抗體具有良好的活性。所述孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為8.1ug/L、2.7ug/L、0.9yg/L、0.3ug/L、0.1ng/L禾卩0ug/L。所述底物顯色液當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，底物液為含有3，3，5，5—四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或鄰苯二胺(0PD)的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶時(shí)，所述底物液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。所述濃縮洗滌液為含0.51.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH7.4，濃度為O.lmol/L,為正常使用濃度的1525倍。所述樣品稀釋液為含O.05X吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH7.4。可以作為固定孔雀石綠抗原的載體的物質(zhì)較多，例如聚苯乙烯、硝酸纖維素、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酰胺、交聯(lián)葡萄糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以為凹孔、紙片、小珠等。本發(fā)明所述抗原抗體的制備方法陳述如下-(1)抗原的合成半抗原的合成用化學(xué)方法先合成硝基無色孔雀石綠(N02-LMG)，然后將其還原為氨基無色孔雀石綠(NH2-LMG)，用硅層析法分析兩者的純度，并進(jìn)行回收。包被原和免疫原的合成將孔雀石綠半抗原和牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)等載體蛋白，通過重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原與免疫原。免疫原與包被原通過柱層析進(jìn)行純化，純度經(jīng)SDS—PAGE電泳鑒定。(2)孔雀石綠單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫以半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行間隔免疫，間接ELISA檢測(cè)并得到血液里含有孔雀石綠特異性抗體的小鼠脾臟。細(xì)胞融合與克隆取產(chǎn)生特異性抗體的Balb/c小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP20融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法或顯微克隆法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，得到并建立產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37。C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油，714天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，710天后采集腹水。經(jīng)辛酸一飽和硫酸胺法或親和層析法進(jìn)行腹水純化，純度經(jīng)SDS—PAGE電泳鑒定，小瓶分裝，-2(TC保存。(3)孔雀石綠兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以孔雀石綠與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，多次免疫后測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸胺分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。(4)孔雀石綠基因工程抗體的制備基因工程抗體主要指小分子抗體，包括Fab(由完整的輕鏈和Fd構(gòu)成)，F(xiàn)v(由VH和VL構(gòu)成)，ScFv(單鏈抗體，VH和VL之間由一條連接肽連接而成)，單域抗體(僅由VH組成)等經(jīng)基因工程技術(shù)改造后的抗體。制備方法為提取孔雀石綠單克隆細(xì)胞或經(jīng)孔雀石綠免疫原免疫后的小鼠脾細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計(jì)抗體輕重鏈擴(kuò)增引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出抗體的輕重鏈基因，插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中表達(dá)，利用免疫親和方法進(jìn)行純化，純度由SDS-PAGE電泳鑒定。其中，酶標(biāo)記孔雀石綠抗體的制備-將孔雀石綠抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。具體方法為①溶解5mgHRP于lmL超純水中，加入新配置的0.lmol/L過碘酸鈉75uL，置室溫或4。C冰箱反應(yīng)20min或30min。②反應(yīng)完后裝入透析袋，0.OOlmol/LPH4.0醋酸緩沖溶液4"C透析過夜，期間需更換透析液幾次。③將抗體用0.lmol/L碳酸緩沖液稀釋至10mg/mL，另外用0.lmol/L碳酸緩沖液將活化好的HRP的溶液pH調(diào)至9.5。將0.5mL抗體加入HRP溶液中，置室溫或4t:冰箱反應(yīng)2h。加入100yL4mg/mL硼氫化鈉，4。C冰箱反應(yīng)2h。⑤對(duì)0.01mol/LPBS透析過夜，加入保存液-20。C保藏備用。其中，酶標(biāo)板的制備方法為用包被緩沖液將孔雀石綠抗原按需要稀釋，向酶聯(lián)板微孔中加入抗原稀釋液，放入37t:環(huán)境進(jìn)行孵育，再放入4。C環(huán)境中過夜孵育，得到的酶聯(lián)板的穩(wěn)定性好，傾去包被液，用洗滌液洗滌，然后在每孔中加入封閉液，37。C孵育，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。本發(fā)明同時(shí)提供了利用上述酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行動(dòng)物源性食品中孔雀石綠檢測(cè)的使用方法(1)樣品前處理；(2)使用試劑盒檢測(cè)；(3)結(jié)果處理與分析。本發(fā)明提供待測(cè)樣品前處理方法為(1)取剪碎樣品置入離心管中，按每克樣品加入2mL加入乙酸乙酯，充分打碎均質(zhì)；(2)4000rpm/min離心10min，取上清在50。C水浴下氮?dú)饬鞔蹈蓸悠罚?3)以等量環(huán)己垸和蒸餾水混合提取渦旋l分鐘，取環(huán)己烷層，按每克樣品加入12.5uL計(jì)加入lMHCL，渦旋1分鐘，靜置30min;(4)加入2倍于HCL液量的蒸餾水，8000rpm/min離心10min，棄去上層環(huán)己垸，吸取下層清液，用1NNaOH調(diào)整到pH6.08.0與稀釋液進(jìn)行4倍稀釋后，取50pL進(jìn)行分析。使用試劑盒檢測(cè)的方法為(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡；(2)將標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品加入已經(jīng)包被有孔雀石綠抗原的酶標(biāo)板孔內(nèi)，然后每孔加入酶標(biāo)記物，輕拍混勻，孵育；(3)洗滌；(4)每孔加入等量的底物緩沖液與底物液，輕拍混勻，避光孵育；(5)每孔加入反應(yīng)終止液，混合均勻，在波長450nm或492nm下，以空氣為空白，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值；本發(fā)明提供的檢測(cè)結(jié)果處理與分析方法為以所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計(jì)算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)，孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，根據(jù)方程式求出對(duì)應(yīng)樣品的孔雀石綠濃度。所述百分吸光度值的計(jì)算式為百分吸光度值(%)=(B/B。)X100其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光值，Bo為Oug/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件進(jìn)行計(jì)算與分析，對(duì)孔雀石綠線性檢測(cè)范圍為0.18.1Pg/L，檢測(cè)限為0.1ug/L，整個(gè)檢測(cè)過程只需35min就可以完成。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的試劑盒采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)模式，采用高特異性、高親合力的抗體，減少了操作步驟，提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度；采用包被抗原進(jìn)行酶標(biāo)板的包被，相對(duì)于抗體包被，更有利于達(dá)到較好的包被效果與較長的保存時(shí)間，從而提高了試劑盒檢測(cè)的精密度與穩(wěn)定性；另外本試劑盒利用酶標(biāo)記抗體技術(shù)，且采用改良后的過碘酸鹽氧化法進(jìn)行標(biāo)記，將酶直接標(biāo)記于孔雀石綠特異性抗體上，將孔雀石綠特異性抗體與酶兩種最重要的反應(yīng)物合二為一，提高了標(biāo)記效率，節(jié)省了酶與抗體的用量，保證標(biāo)記后酶與抗體具有良好的活性，不僅大大簡(jiǎn)化了操作步驟和反應(yīng)時(shí)間，減少了因操作復(fù)雜引起的誤差，而且無需在試劑盒內(nèi)再配置抗抗體，同時(shí)也節(jié)約了孔雀石綠特異性抗體與酶的用量，從而大大降低了試劑盒的成本?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)本試劑盒非常適用于孔雀石綠殘留的痕量分析與批量檢測(cè)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。實(shí)施例l抗原的制備孔雀石綠抗原的制備a.200mg純化的氨基無色孔雀石綠加0.3mol/LHCL12mL的比例，將純化的氨基無色孔雀石綠攪拌溶解；b.在冰浴攪拌的條件下緩慢加入10g/LNaN02，使氨基無色孔雀石綠重氮化，同時(shí)監(jiān)測(cè)NaN02是否過量，檢測(cè)方法取淀粉/碘化鉀溶液滴于白色干燥玻璃片上，滴加1滴上述重氮化溶液，混合后30s內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)黑色即完成氨基無色孔雀石綠的重氮化；c.上述重氮化的氨基無色孔雀石綠繼續(xù)反應(yīng)20min，稱取800mg的BSA，溶于碳酸鹽緩沖液，制成20g/L蛋白溶液，在冰浴攪拌條件下緩慢加入重氮化氨基無色孔雀石綠溶液；邊加邊用O.Olmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.58.0，獲得無色孔雀石綠與牛血清白蛋白得偶聯(lián)物(LMG-BSA)，置于4'C冰箱過夜；d.于4。C條件下，先用pH值較低的稀HCL(0.01mol/L)溶液透析，然后用0.lmol/LpH7.2的PBS透析3d，每天換透析液3次，分裝凍干后，一2(TC保存。實(shí)施例2抗體的制備孔雀石綠鼠單克隆抗體制備動(dòng)物免疫程序采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以孔雀石綠半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為60ug/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，腹腔注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。細(xì)胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按4:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用顯微克隆法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成5Xl(^個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在—7(TC超低溫冰箱中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37X:水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將Balb/c8周齡的小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5乂106個(gè)/只，14天后采集腹水。用免疫層析法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，-2(TC保存。實(shí)施例3辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的提取1、辣根過氧化物酶的提取a.水提取稱取20千克已洗干凈的鮮辣根或辣根皮，切成小塊，在粉碎機(jī)中絞碎。碎渣漿加10千克水在低溫下攪拌浸提8小時(shí)，以3000轉(zhuǎn)/分速度離心10分鐘，收集上清液。b.硫酸銨分級(jí)分離每升濾液加226克硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，置室溫下過夜。次日吸取上清液，再按每升上清液加258克硫酸銨粉末，隨加隨攪拌，待硫酸銨完全溶解后，置冷室過夜。次日吸去上清液，沉淀部分在冷凍離心機(jī)中以13000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀溶于200300毫升蒸餾水中，分裝于透析袋中，在流動(dòng)水中透析12天，直至透出的水加入氯化鋇溶液無沉淀生成為止。然后再在蒸餾水中透析8小時(shí)。合并透析液，在冷凍離心機(jī)中以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集上清液。c.丙酮分級(jí)分離將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用滴管沿杯壁加入等體積預(yù)冷至一i5t:的丙酮，在冷凍離心機(jī)中以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集上清液，再加入原上清液體積0.8倍的一i5r丙酮，離心(條件同上)收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析(方法同上)除去丙酮，即得粗HRP。d.精制每升粗酶液加入1毫升1摩爾硫酸鋅溶液，在冷凍離心機(jī)中以5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清液，分裝于透析袋內(nèi)，于流水中透析除硫酸鋅，約需1天，然后在蒸餾水中透析8小時(shí)。將透析液合并，進(jìn)行真空干燥即得精制HRP。產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物。2、堿性磷酸酶利用產(chǎn)生堿性磷酸酯酶的f.6bh'7，317菌株發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)離心(8000r/min，10min)后，沉淀的菌體經(jīng)5X10—4MEDTA—0.03MpH8.0Tris—0.5M蔗糖高滲液處理后用溶菌酶破壁，上清酶液經(jīng)DEAE纖維素?cái)嚢栉胶拖疵摚瑹崽幚砗蚐印hadexG-100分子篩層析純化。實(shí)施例4酶標(biāo)記孔雀石綠抗體的制備辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記孔雀石綠抗體的制備采用過碘酸鹽氧化法，具體方法為a.溶解5mgHRP于lmL超純水中，加入新配置的0.1mol/L過碘酸鈉75uL，置室溫或4。C冰箱反應(yīng)20min或30min。b.反應(yīng)完后裝入透析袋，0.001mol/LpH4.0醋酸緩沖溶液4。C透析過夜，期間需更換透析液幾次c.將孔雀石綠抗體用0.lmol/L碳酸緩沖液稀釋至10mg/mL，另外用0.lmol/L碳酸緩沖液將活化好的HRP的溶液pH調(diào)至9.5。將0.5mL抗體加入HRP溶液中，置室溫或4。C冰箱反應(yīng)2h。d.加入100ixL4mg/mL硼氫化鈉，4。C冰箱反應(yīng)2h。e.對(duì)0.01mol/LPBS透析過夜，加入保存液-20。C保藏備用。實(shí)施例5酶聯(lián)免疫試劑盒組分的配制(1)濃縮洗滌緩沖液的配制含0.51.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH7.4，濃度為0.1mol/L，為正常使用濃度的1525倍。(2)樣品稀釋液的配制pH7.4、0.01mol/L、含有0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液。(3)封閉液的配制脫脂奶粉1.05.0g溶于100mL蒸餾水。(4)底物緩沖液的配制30%過氧化氫30uL溶于19mL的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液中，4。C保存。磷酸-擰檬酸緩沖液0.2MNa2HP0425.7mL，0.1M擰檬酸24.3mL，加蒸餾水50mL。(5)底物液的配制將3，3，5，5—四甲基聯(lián)苯胺(TMB)80mg溶于10mLPH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液中，4'C保存。磷酸-檸檬酸緩沖液0.2MNa2HP0425.7mL，0.1M擰檬酸24.3mL，加蒸餾水50mL。(6)酶標(biāo)板微孔板的包被包被抗原用pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成0.15ug/mL，其中碳酸鹽緩沖溶液含12g碳酸鈉和24g碳酸氫鈉以及雙蒸水1L。在酶標(biāo)板的每孔加100uL，37。C包被lh后4。C下包被過夜，傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍干，然后在每孔中加入200uL1.05.0X脫脂奶粉，放入37。C溫箱中l(wèi)h后用PBST洗滌3次，干燥后封入鋁箔袋中4°。保存。(7)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取無色孔雀石綠標(biāo)樣10mg，溶于0.lmL0.lmol/L鹽酸溶液，然后用樣品稀釋液分別配制8.lug/L、2.7ug/L、0.9ug/L、0.3ug/L、0.1ug/L、Oug/L孔雀石綠溶液，4"C保存。(8)試劑分裝各種試劑按要求配制，測(cè)定合格后無菌分裝。酶標(biāo)記孔雀石綠抗體工作液7mL/瓶，孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)樣品lmL/瓶，底物液7mL/瓶，底物緩沖液7mL/瓶，終止液7mL/瓶，濃縮洗液50mL/瓶，樣品稀釋液50mL/瓶。分裝后貼標(biāo)簽，注明批號(hào)和有效期，4°C保存。(9)試劑盒的組裝分別將可拆卸包被好包被抗原的微孔板1塊，酶標(biāo)記孔雀石綠抗體工作液、底物液、底物緩沖液、終止液、濃縮洗液、樣品稀釋液各l瓶，孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，使用說明書〗份置試劑盒內(nèi)指定位置。試劑盒檢驗(yàn)合格后封裝，4'C保存。實(shí)施例6酶聯(lián)免疫試劑盒組分的配制實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例5，不同的是采用細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶為標(biāo)記酶，所述底物液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液，按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法配制。實(shí)施例7組建檢測(cè)孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑盒，包含下述組分(1)包被孔雀石綠抗原的96孔酶標(biāo)板，或根據(jù)產(chǎn)品規(guī)格的需要選用40孔酶標(biāo)板；(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記孔雀石綠單克隆抗體，7mL/瓶；(3)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0ug/L、0.1ug/L、0.3ug/L、0.9ng/L、2.7ng/L和8.liig/L，lmL/瓶;(4)底物緩沖液，7mL/瓶；(5)底物液，7mL/瓶；(6)終止液，7mL/瓶;(7)濃縮洗滌液，50niL/瓶；(8)樣品稀釋液，50mL/瓶；(9)使用說明書，l份；(10)蓋板膜，2張；(11)自封袋(含干燥劑)，l個(gè)。實(shí)施例8待測(cè)樣品前處理(1)取剪碎魚肉樣品5g置入離心管中，加入lOmL乙酸乙酯，充分打碎均質(zhì)；(2)4000rpm/min離心10min，取上清在5CTC水浴下氮?dú)饬鞔蹈蓸悠罚?3)以等量環(huán)己烷和蒸餾水混合提取渦旋l分鐘，取環(huán)己垸層，加入62.5uL1MHCU渦旋1分鐘，靜置30min;(4)加入125uL蒸餾水，8000rpm/min離心10min，棄去上層環(huán)己烷，吸取下層清液，用1NNaOH調(diào)整到p朋.08.0與稀釋液進(jìn)行4倍稀釋后，取50uL進(jìn)行分析。實(shí)施例9使用試劑盒的檢測(cè)方法(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫，即2024。C，平衡30min以上，將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的條板固定于支架，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，按順序編號(hào)。(2)在標(biāo)準(zhǔn)品孔加入50yL標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入50iiL待測(cè)樣品。然后每孔加入50uL酶標(biāo)記物，輕拍混勻。蓋上蓋板膜，在室溫孵育20min。(3)倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打，每輪洗板拍打3次，以保證完全除去孔中的液體。用250uL蒸餾水充入孔中，再次倒掉微孔中的液體，再重復(fù)操作3遍。(4)每孔加入100pL顯色液(將底物緩沖液與底物液等體積混合)，輕拍混勻，蓋上蓋板膜，暗處室溫孵育15min。(5)加入50uL反應(yīng)終止液到微孔中?；旌虾迷诓ㄩL450nm或492nm，以空氣為空白，測(cè)定各孔吸光值，必須在加入終止液后60min內(nèi)讀取吸光值。檢測(cè)結(jié)果計(jì)算與分析以所獲標(biāo)準(zhǔn)樣品吸光值的平均值計(jì)算百分吸光度值，以百分吸光度值為縱坐標(biāo)，孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。見附圖l。Y—14.756X+87.767;R2=0.9974。用同樣的方法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，根據(jù)方程式求出對(duì)應(yīng)樣品的孔雀石綠濃度。所述百分吸光度值的計(jì)算式為百分吸光度值(%)二(B/B。)X100其中，B為標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品的平均吸光值，Bo為Oug/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。檢測(cè)結(jié)果的分析還可以利用計(jì)算機(jī)專業(yè)軟件進(jìn)行計(jì)算與分析，對(duì)孔雀石綠線性檢測(cè)范圍為0.18.1iig/L，檢測(cè)限為0.1ng/L，整個(gè)檢測(cè)過程只需35min就可以完成。實(shí)施例IO試劑盒精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗(yàn)從3批按照實(shí)施例4(6)中的方法制備的酶標(biāo)板中，各抽出20個(gè)微孔，測(cè)定0.9ug/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)20次，計(jì)算變異系數(shù)CVX，結(jié)果見表l。表1標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)性試驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)果表明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的批內(nèi)變異系數(shù)范圍在3.74.8%之間，批間變異系數(shù)為8.7%。2、樣本重復(fù)性與準(zhǔn)確度試驗(yàn)準(zhǔn)確度是指測(cè)得值與真值的符合程度，在ELISA測(cè)定中，準(zhǔn)確度常以回收率表示，精密度常以變異系數(shù)來表示。在空白淡水魚肉中，將孔雀石綠添加至終濃度為1Pg/L(Pg/kg)、5Pg/L(Pg/kg)，每個(gè)濃度各10個(gè)平行，測(cè)定3批。計(jì)算平均值、添加回收率及批內(nèi)與批間變異系數(shù)。結(jié)果見表2。表2樣本重復(fù)性與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果添加第l批第2批第3批<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)果表明淡水魚肉樣本的添加回收率在81.0109%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在4.18.8%之間，批間變異系數(shù)在12.8].3.7%之間。實(shí)施例11保存期試驗(yàn)(1)將試劑盒放置于28。C，分別取O、2、4、6、8、9、10、11和12個(gè)月的試劑盒，對(duì)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1ug/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。(2)將試劑盒在37i:保存的條件下放置12天，每天對(duì)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1ng/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。(3)將試劑盒在一2(TC冰箱保存12天，每天對(duì)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1iig/L)的吸光度值、50%抑制濃度、添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)各參數(shù)進(jìn)行測(cè)定。從結(jié)果可看出，經(jīng)過三種條件保存試驗(yàn)，孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.1Pg/L)的吸光度值下降小于5%，且OD不低于1.5;50%抑制率在0.51，0pg/L之間；添加回收率在70105%之間；批內(nèi)變異系數(shù)小于10%;各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量要求，因此，試劑盒可以在28。C保存12個(gè)月。權(quán)利要求1、一種孔雀石綠殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含下列成分(1)包被了孔雀石綠抗原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)記孔雀石綠抗體工作液；(3)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液；(4)底物液；(5)底物緩沖液；(6)反應(yīng)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)樣品稀釋液。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)板采用96'孔或40孔酶標(biāo)板，包被有能與抗孔雀石綠抗體特異結(jié)合的孔雀石綠抗原，并封閉微孔表面未吸附孔雀石綠抗原的位點(diǎn)；所述孔雀石綠抗原是采用重氮化法將孔雀石綠半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述酶聯(lián)免疫分析試劑盒，其特征在于所述所述酶標(biāo)記孔雀石綠抗體工作液為采用戊二酸法或過碘酸鹽氧化法將標(biāo)記酶與孔雀石綠抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到；所述標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述酶聯(lián)免疫分析試劑盒，其特征在于所述孔雀石綠抗體為鼠單克隆抗體、兔多克隆抗體或基因工程抗體任意一種。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，所述底物液為含有3，3，5，5—四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液；當(dāng)標(biāo)記酶為細(xì)菌提取的堿性磷酸酯酶時(shí)，所述底物液為對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液，所述底物緩沖液為含有過氧化氫或過氧化脲的pH5，0磷酸-檸檬酸緩沖溶液，所述終止液為12mol/L硫酸溶液或2mol/L的氫氧化鈉溶液。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為含0.51.5%吐溫20的磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH7.4，濃度為0.lmol/L。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述樣品稀釋液為含0.05%吐溫20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液pH7.4。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為8.lyg/L、2.7iig/L、0.9ug/L、0.3ug/L、0.lug/L和0ug/L。9、一種權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品前處理；(2)使用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)結(jié)果處理與分析。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于步驟(2)包括以下步驟(1)將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡；(2)將標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品加入已經(jīng)包被有孔雀石綠抗原的酶標(biāo)板孔內(nèi)，然后每孔加入酶標(biāo)記物，輕拍混勻，孵育；(3)洗滌；(4)每孔加入等量的底物緩沖液與底物液，輕拍混勻，避光孵育.(5)每孔加入反應(yīng)終止液，混合均勻，在波長450nm或492nm下，以空氣為空白，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光值。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中孔雀石綠殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被孔雀石綠抗原的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記孔雀石綠抗體工作液、孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液、底物液、底物緩沖液、反應(yīng)終止液、濃縮洗滌液和樣品稀釋液。本發(fā)明還公開了應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)孔雀石綠殘留的方法，包括進(jìn)行樣品的前處理，利用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果的處理與分析等步驟。本發(fā)明提供的檢測(cè)孔雀石綠的試劑盒采用直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)，靈敏度高、穩(wěn)定性好，大大簡(jiǎn)化了操作步驟和反應(yīng)時(shí)間，減少了因操作復(fù)雜引起的誤差，降低了成本，非常適合大量樣品的篩查，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。文檔編號(hào)G01N33/543GK101226194SQ200810025908公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2008年1月18日優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日發(fā)明者孫遠(yuǎn)明,楊金易,沈玉棟,宇王,弘王,肖治理,雷紅濤申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)