專利名稱：一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒，適用于測(cè)定動(dòng)物性食品中呋喃唑酮?dú)埩魳?biāo)示物3-氨基-2-惡唑烷酮(簡(jiǎn)稱AOZ，下同)的殘留量，屬于免疫化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
呋喃唑酮又名痢特靈，屬于硝基呋喃類藥物，為人工合成的廣譜抗菌藥，曾作為促生長(zhǎng)劑廣泛應(yīng)用于畜、禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中。毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，呋喃唑酮具有致癌和致突變性。歐盟于1995年將呋喃唑酮列為禁用藥，隨后美國(guó)、日本、澳大利亞等國(guó)均取消呋喃唑酮在畜禽生產(chǎn)上的使用，中國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年3月發(fā)布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》中將呋喃唑酮列為禁用藥。由于呋喃唑酮確實(shí)具有很好的預(yù)防和治療效果，價(jià)格便宜，目前仍在畜、禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中非法使用。因此為了保障動(dòng)物性食品食用者的健康和擴(kuò)大動(dòng)物性食品的貿(mào)易往來(lái)，加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物性食品中呋喃唑酮?dú)埩舻臋z測(cè)是非常必要的。
呋喃唑酮在動(dòng)物體內(nèi)很快代謝成AOZ，與組織蛋白結(jié)合的AOZ在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，被視為呋喃唑酮的殘留標(biāo)示物，所以分析呋喃唑酮?dú)埩敉ǔ７治銎浯x產(chǎn)物AOZ。目前檢測(cè)AOZ殘留的方法有高效液相色譜法(HPLC)，液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)，液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)和免疫化學(xué)分析法(IA)。
常用的儀器法(HPLC、LC-MS、LC-MS-MS)所需儀器價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員的要求較高，難于推廣，不適合高通量的樣品篩選。免疫化學(xué)分析法特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)(ELISA)具有快速、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、專一性好等優(yōu)點(diǎn)，適合高通量的樣品篩選。近年來(lái)國(guó)外已開(kāi)展呋喃唑酮ELISA方法的研究(Cooper KM，Elliott C T，Kennedy D G.Detection of 3-amino-2-oxazolidinone(AOZ)，a tissue-bound metabolite of thenitrofuran furazolidone，in prawn tissue by enzyme immunoassay.Food Additives and Contaminants，2004，21(9)841-848)，但國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)呋喃唑酮ELISA試劑盒專利報(bào)道。因此研制呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒。本試劑盒具有靈敏度高，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用和攜帶方便，可用于動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫單位對(duì)動(dòng)物源食品中呋喃唑酮?dú)埩舻姆治鰴z測(cè)。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒，它包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板、試劑，其中的試劑包含洗滌液、樣品稀釋液、辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔抗體、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液、3-氨基-2-惡唑烷酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和3-氨基-2-惡唑烷酮抗體，在酶標(biāo)板的每孔內(nèi)，有包被液包被的能與呋喃唑酮?dú)埩魳?biāo)示物3-氨基-2-惡唑烷酮特異性抗體結(jié)合的包被抗原，所說(shuō)的3-氨基-2-惡唑烷酮抗體是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。
所說(shuō)的包被抗原是由3-氨基-2-惡唑烷酮與對(duì)醛基苯甲酸反應(yīng)，再與卵清蛋白偶聯(lián)的復(fù)合物。
所說(shuō)的人工免疫原是由3-氨基-2-惡唑烷酮與對(duì)醛基苯甲酸反應(yīng)，再與牛血清蛋白偶聯(lián)的復(fù)合物。
所說(shuō)的3-氨基-2-惡唑烷酮標(biāo)準(zhǔn)溶液為3-氨基-2-惡唑烷酮與苯甲醛衍生物N-苯亞甲基-3-氨基-2-惡唑烷酮(簡(jiǎn)稱PAOZ，下同)。
在本發(fā)明的試劑盒中，所述的酶標(biāo)板由塑料支架和各自分開(kāi)的帶孔穴的塑料條組成，酶標(biāo)板用聚苯乙烯制成。
試劑盒中的試劑按照常規(guī)配制(朱立平，陳學(xué)清，免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法.北京人民軍醫(yī)出版社，2000)，其中底物顯色A液為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，底物顯色B液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)或鄰苯二胺(OPD)，終止液為硫酸溶液或鹽酸溶液，洗滌液為含0.05～0.1％吐溫20的磷酸鹽緩沖液，樣品稀釋溶液為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明還包括動(dòng)物可食性組織如肝臟、肌肉樣品預(yù)處理方法，將待檢測(cè)動(dòng)物組織經(jīng)鹽酸水解釋放AOZ，苯甲醛衍生過(guò)夜(16h)，最后過(guò)MAX柱凈化。
本發(fā)明試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，用于檢測(cè)動(dòng)物可食性組織如肝臟、肌肉中AOZ的殘留。其優(yōu)點(diǎn)是樣品處理簡(jiǎn)單，適合高通量的樣品篩選，具有高特異性、高靈敏度、高精確度等特點(diǎn)，最低檢測(cè)限達(dá)0.1μg/kg。


圖1是本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒直觀示意圖，圖中1--盒體；3--AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液；4--辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔抗體；5--AOZ抗體液；6--底物顯色A液；7--底物顯色B液；8--終止液；9--洗滌液；10--樣品稀釋液；11--泡沫托架；圖2是本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒中的酶標(biāo)板直觀示意圖，圖中2--酶標(biāo)板；圖3是本發(fā)明的人工抗原合成路線；圖4是本發(fā)明人工抗原紫外掃描圖譜，圖4顯示BSA最大吸收波長(zhǎng)為27gnm，CPAOZ-BSA最大吸收波長(zhǎng)為292nm，BSA偶聯(lián)半抗原后最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯改變；圖5是本發(fā)明3-氨基-2-惡唑烷酮抗體與3-氨基-2-惡唑烷酮標(biāo)準(zhǔn)品的間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)曲線，圖中X軸為3-氨基-2-惡唑烷酮標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對(duì)數(shù)值，Y軸為3-氨基-2-惡唑烷酮標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)光密度值的抑制百分率。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1、抗原、抗體的制備1.1人工抗原(免疫原、包被原)的合成在有磁力攪拌器裝置的100mL燒杯中加入蒸餾水10mL，對(duì)醛基苯甲酸3.0g，緩慢滴加N，N-二甲基甲酰胺(DMF)至對(duì)醛基苯甲酸完全溶解，攪拌中加入AOZ 1.0g，反應(yīng)2h后過(guò)濾，水洗3次得到AOZ與對(duì)醛基苯甲酸的反應(yīng)物3-(4羧基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(簡(jiǎn)稱CPAOZ，下同)。取CPAOZ 23.4mg溶于DMF 2mL中，攪拌中加入二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)27.5mg和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)14.4mg，4℃下磁力攪拌反應(yīng)過(guò)夜。離心后，上清液為A液。稱取牛血清蛋白(BSA)170mg溶于0.1mol/L PBS(pH 8.0)10mL中，加入DMF 1mL，攪拌溶解制備B液。磁力攪拌下，A液逐滴加入到B液中，密封燒杯，4℃下攪拌反應(yīng)4h。離心后，取上清液，4℃下用PBS(pH7.4)透析3d，每天更換2次PBS，以除去未反應(yīng)的DMF、DCC、NHS和CPAOZ小分子物質(zhì)。最后得到無(wú)色CPAOZ-BSA(CPAOZ與牛血清蛋白偶聯(lián)復(fù)合物)溶液，分裝保存于-20℃冰箱中，供免疫用。
在上述步驟中，稱取卵清蛋白(OVA)150mg與CPAOZ 23.4mg反應(yīng)即得CPAOZ-OVA(CPAOZ與卵清蛋白偶聯(lián)復(fù)合物)，供包被用。
1.2抗體的制備采用健康雄性體重1.5kg左右的家兔作為免疫動(dòng)物，以CPAOZ-BSA為免疫原，免疫劑量為0.5～1mg/只。首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2～4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫，共免疫6次，免疫期間監(jiān)測(cè)血清抗體效價(jià)及特異性。最后一次免疫不加佐劑。在最后一次免疫7～10天后頸動(dòng)脈放血，收集兔血清，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的AOZ多克隆抗體。
實(shí)施例2、呋喃唑酮間接競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法的建立2.1抗原最佳包被濃度和抗體最佳工作濃度的確定通過(guò)方陣滴定試驗(yàn)確定，以吸光度值約1.0且左右相鄰吸光度差值最大的點(diǎn)為參照點(diǎn)。操作步驟在96孔酶標(biāo)板上的第1行包被2000μg/L的包被原，第2至第8行依次包被1000、500、250、120、60、30、15μg/L的包被原。4℃過(guò)夜，1％卵清白蛋白37℃封閉1小時(shí)，洗滌2次，拍干，在酶標(biāo)板的第1列至第9列依次加入100μL稀釋倍數(shù)為10000、20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000、25600003-氨基-2-惡唑烷酮抗體，第10列加入樣本稀釋液做空白對(duì)照，37℃孵育1h，洗滌3次，拍干，各孔加入100μL底物顯色液，避光顯色15min，加入50μL終止液，用自動(dòng)酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值(OD值)，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1本發(fā)明試劑盒中抗原最佳包被濃度和抗體最佳工作濃度的確定

結(jié)果表明，抗原最佳包被濃度為250μg/L，抗體最佳上作濃度為1∶320000。
2.2抗體最佳反應(yīng)體積的確定設(shè)置4個(gè)抗體與藥物的反應(yīng)體積比(60μL∶40μL、50μL∶50μL、40μL∶60μL、30μL∶70μL)，作間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，結(jié)果見(jiàn)表2。
表2本發(fā)明試劑盒中抗體最佳反應(yīng)體積的確定

結(jié)果表明，抗體與藥物的反應(yīng)體積比為40μL∶60μL時(shí)，抗體反應(yīng)最靈敏。
2.3最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的確定間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法確定最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間。設(shè)置0.5μg/L、5μg/L、50μg/L 3個(gè)藥物濃度，競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)這一步中，將5塊板置于37℃下孵育，經(jīng)0.5、1、1.5、2、3h分別各取出1塊扳，測(cè)其OD值，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3本發(fā)明試劑盒最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間的確定(n＝5)

結(jié)果表明，不同濃度的藥物經(jīng)過(guò)1h的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)后，OD值不再上升，說(shuō)明經(jīng)過(guò)1h競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，因此最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為1h。
實(shí)施例3、本發(fā)明呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備3.1本發(fā)明酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的組成本發(fā)明的試劑盒主要由盒體(1)、酶標(biāo)板(2)、6瓶AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液(3)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體(4)、AOZ抗體液(5)、底物顯色A液(6)、底物顯色B液(7)、終止液(8)、洗滌液(9)、樣品稀釋液(10)和泡沫托架(11)組成。
3.2試劑的配制按常規(guī)方法制備其中包被稀釋液Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至pH9.6；封閉液卵清蛋白0.1g溶于pH7.4PBS 100mL；洗滌液NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，KCl 0.2g，吐溫200.5mL，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至pH 7.4；樣本稀釋液NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，KCl 0.2g，硫柳汞0.1g，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至pH 7.4；底物顯色液(TMB-過(guò)氧化氫尿素溶液)其中①底物液A四甲基聯(lián)苯胺(TMB)200mg，無(wú)水乙醇或二甲亞砜100mL，加雙蒸水至1000mL；②底物液B緩沖液Na2HPO414.60g，檸檬酸9.33g，0.75％過(guò)氧化氫尿素6.4mL，加雙蒸水至1000mL，調(diào)至pH5.0～5.4；③將底物液A和底物液B按1∶1混合即成TMB-過(guò)氧化氫尿素溶液；終止液18mol/L濃硫酸100mL，緩慢滴加到雙蒸水至900mL。
3.3酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將CPAOZ-OVA稀釋成0.5μg/mL，每孔加入100μL，室溫過(guò)夜或37℃孵育4h，傾去包被液，洗滌液洗滌3次，拍干，然后每孔加入200μL封閉液，37℃孵育1h，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，用鋁膜真空密封保存、備用。
實(shí)施例4、本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的測(cè)定程序4.1測(cè)定之前注意事項(xiàng)①使用之前將所有試劑回升至室溫20～24℃；②使用之后立即將所有試劑放回4℃冰箱；③在使用中不要讓微孔干燥；④在免疫分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的冼板順序操作是免疫測(cè)定操作程序的要點(diǎn)；⑤在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔板。
4.2樣品提取凈化①取組織均質(zhì)物1g，分別加入蒸餾水5mL，1mol/L HCl 0.5mL和10mmol/L苯甲醛(甲醇溶液)100μL，充分振蕩；②置37℃水浴孵育(大約16小時(shí))③分別加入0.1mol/L K2HPO45mL，高氯酸200μL，劇烈振蕩30s，室溫4000r/min離心10min；④取出上清液到另一容器，用5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，準(zhǔn)備過(guò)MAX柱，分別用甲醇3mL和蒸餾水3mL活化MAX柱，流速控制在1滴/秒，加入上述樣品；⑤用2％的氨水溶液3mL洗滌MAX柱，正壓吹干，用甲醇溶液3mL洗脫并收集洗脫液，正壓吹干以便收集完全；⑥40℃氮?dú)獯蹈?，向吹干后的收集瓶中加入樣本稀釋?mL，渦動(dòng)30s，作為試樣溶液，供ELISA方法測(cè)定。
4.3試劑配制①酶標(biāo)二抗工作液配制根據(jù)每次所需用量，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體(4)和樣品稀釋溶液(10)按1∶10的比例稀釋，混勻；②AOZ抗體工作液配制根據(jù)每次所需用量，AOZ抗體液(5)和樣品稀釋液(10)按1∶10的比例稀釋，混勻；③底物混合液配制根據(jù)每次所需用量，顯色液A液(6)和顯色液B液(7)按1∶1的比例稀釋，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；④洗滌液配制；洗滌液(9)和蒸餾水按1∶10的比例稀釋，混勻，置4℃冰箱可保存1月。
4.4測(cè)定步驟①取微孔條將足夠標(biāo)準(zhǔn)品和樣品所用數(shù)量的孔條插入微孔架，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩個(gè)平行試驗(yàn)，記下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置；②加標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品加入標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣品液60μL到微孔中，每孔加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)注意更換移液器的吸頭；③加抗體加入AOZ抗體工作液40μL到每一個(gè)微孔中充分混合，在培養(yǎng)箱孵育1.5小時(shí)(37℃)，覆蓋上薄膜(防止蒸發(fā))；④洗滌倒出孔中的液體，洗滌3次并拍干；⑤加酶標(biāo)二抗加入酶標(biāo)二抗工作液100μL到每一微孔中充分混合，在培養(yǎng)箱孵育1小時(shí)(37℃)，覆蓋上薄膜(防止蒸發(fā))；⑥洗滌倒出孔中的液體，洗滌4次并拍干；⑦加底物加入底物混合液100μL到每一微孔中，充分混合并在室溫暗處孵育15分鐘；⑧終止加入反應(yīng)終止液50μL到每一微孔中；⑨測(cè)定在450nm處測(cè)量吸光度值，以空氣為空白，必須在加入終止液后60分鐘內(nèi)讀取吸光值。
4.5結(jié)果判斷所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品吸光值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光值再乘以100，以抑制率為縱坐標(biāo)，AOZ濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線在0.1～25μg/L范圍內(nèi)趨近直線，每一個(gè)樣品的濃度(μg/kg)可以從校正曲線上讀出。

實(shí)施例5、本發(fā)明試劑盒的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)5.1本發(fā)明試劑盒的靈敏度試驗(yàn)以IC50(抑制率為50％對(duì)應(yīng)的藥物濃度)作為本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的靈敏度指標(biāo)。測(cè)定20次標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50值，本發(fā)明試劑盒的IC50值為1.26μg/L(表4)。計(jì)算20個(gè)0μg/L標(biāo)準(zhǔn)液OD值的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，根據(jù)最低檢測(cè)限公式Z＝X-3SD，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限為0.1μg/L。
表4本發(fā)明試劑盒的靈敏度試驗(yàn)

5.2本發(fā)明試劑盒的特異性試驗(yàn)以交叉反應(yīng)率為指標(biāo)判定試劑盒的特異性。將AOZ與鄰硝基苯甲醛衍生物3-(2-硝基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(簡(jiǎn)稱NPAOZ，下同)、AOZ、呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林、苯甲醛、四環(huán)素、磺胺二甲嘧啶、青霉素、鏈雷素、紅霉素、恩諾沙星、克倫特羅等藥物配成不同的濃度，用試劑盒測(cè)定各藥物的IC50值，每個(gè)藥物3個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其交叉反應(yīng)率(表5)。

表5本發(fā)明試劑盒的特異性試驗(yàn)

本發(fā)明試劑盒除與NPAOZ(5.73％)、呋喃唑酮(6.13％)有交叉反應(yīng)，與其他藥物無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒對(duì)PAOZ特異性高，專一性好。
5.3本發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確度試驗(yàn)將配制好的AOZ母液(1mg/mL)稀釋成100μg/L，添加到1g組織(豬肉、豬肝、雞肉、雞肝)中使其終濃度為0.4μg/kg、1μg/kg、5μg/kg，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，重復(fù)5天，按照試劑盒的測(cè)定程序，測(cè)定各組織中AOZ濃度，并計(jì)算回收率和變異系數(shù)(表6)。

表6本發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確度和重復(fù)性試驗(yàn)

豬肝、豬肉、雞肝、雞肉組織中回收率均在55.8％～96.6％，批間變異系數(shù)＜20％，表明本發(fā)明試劑盒測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好。
5.4本發(fā)明試劑盒的精密度試驗(yàn)按照本試劑盒的操作說(shuō)明測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液5個(gè)復(fù)孔，以濃度的抑制率計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表7。
表7本發(fā)明試劑盒精密度試驗(yàn)

結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒的板內(nèi)變異系數(shù)＜5％，板內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，精密度高。
5.5本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)將本發(fā)明試劑盒放置4℃和20℃條件下保存，于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9月后分別取試劑盒，測(cè)定IC50值和最大吸光值，結(jié)果見(jiàn)表8。
表8本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)

注“-”表示未測(cè)定表8結(jié)果顯示，本發(fā)明試劑盒在4℃保存下，最大吸光值和IC50值均在正常波動(dòng)范圍內(nèi)。20℃保存下，1個(gè)月后，最大吸光值下降到0.6，說(shuō)明試劑盒中的部分試劑已變質(zhì)。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明本發(fā)明試劑盒在4℃條件下可保存6個(gè)月以上。
實(shí)施例5、動(dòng)物喂養(yǎng)試驗(yàn)取15頭，45日齡，體重為15.0±2.0kg的品種為“長(zhǎng)大”的二元雜交去勢(shì)健康仔豬，隨機(jī)分為5組。第1組為空白對(duì)照組，其余4組飼喂含100mg/kg的呋喃唑酮7天，于停藥0天、7天、14天、28天分別屠宰3頭，空白對(duì)照組分別在停藥0天、7天、28天屠宰1頭，取肝臟、肌肉組織。同一份樣品分別采用本發(fā)明試劑盒和高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9。
表9本發(fā)明試劑盒的適用性試驗(yàn)


停約0天，肌肉和肝臟中AOZ含重為116.9μg/kg、402.2μg/kg，28天后，肌肉和肝臟中AOZ含量為3.6μg/kg、29.2μg/kg，空白肌肉和肝臟的測(cè)定值為0.2μg/kg、0.16μg/kg，與儀器方法測(cè)定結(jié)果一致。測(cè)定結(jié)果證明了AOZ在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)(超過(guò)28天)，并且隨時(shí)間的變化AOZ濃度逐漸下降。本發(fā)明試劑盒能區(qū)分加藥組和空白對(duì)照組，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒具有測(cè)定實(shí)際樣品的能力，適用性強(qiáng)，滿足呋喃唑酮零殘留檢測(cè)的要求。
權(quán)利要求
1.一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒，它包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板、試劑，其中的試劑包含洗滌液、樣品稀釋液、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體、底物顯色A液、底物顯色B液、終止液，其特征在于，酶標(biāo)板的每孔內(nèi)有包被液包被的能與呋喃唑酮?dú)埩魳?biāo)示物3-氨基-2-惡唑烷酮特異性抗體結(jié)合的包被抗原，試劑還包含3-氨基-2-惡唑烷酮標(biāo)準(zhǔn)溶液和3-氨基-2-惡唑烷酮抗體液，所說(shuō)的3-氨基-2-惡唑烷酮抗體液是由人工免疫原免疫家兔得到的血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的包被抗原是由3-氨基-2-惡唑烷酮與對(duì)醛基苯甲酸反應(yīng)，再與卵清蛋白偶聯(lián)的復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的人工免疫原是由3-氨基-2-惡唑烷酮與對(duì)醛基苯甲酸反應(yīng)，再與牛血清蛋白偶聯(lián)的復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的3-氨基-2-惡唑烷酮標(biāo)準(zhǔn)溶液為3-氨基-2-惡唑烷酮與苯甲醛的衍生物。
5.權(quán)利要求1所述的試劑盒在呋喃唑酮?dú)埩舴治鲋械膽?yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種適用于呋喃唑酮?dú)埩舴治龅拿嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，屬于免疫化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的試劑盒主要由3－氨基－2－惡唑烷酮(AOZ)特異性抗體、AOZ標(biāo)準(zhǔn)溶液、包被有AOZ與卵清蛋白復(fù)合物的酶標(biāo)板組成。樣品處理經(jīng)鹽酸水解，釋放AOZ，苯甲醛衍生過(guò)夜，MAX柱凈化，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物可食性組織如肝臟、肌肉中AOZ殘留。本發(fā)明的核心技術(shù)包括人工抗原的合成、抗體的制備、ELISA方法的建立、ELISA試劑盒的組裝等。本發(fā)明的試劑盒具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品，最低檢測(cè)限0.1μg/kg。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1731185SQ20051008634
公開(kāi)日2006年2月8日 申請(qǐng)日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者袁宗輝, 常超, 王玉蓮, 趙春保, 王帥兵, 高愛(ài)中, 陳冬梅, 陶燕飛, 伍金娥, 彭大鵬 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)