銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中β-受體激動(dòng)劑試劑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中β-受體激動(dòng)劑試劑，實(shí)施本發(fā)明的試劑，由硝酸纖維素膜、吸水紙、樣品墊、PVC底板組成的試卡或試條及微孔容器組成。被測(cè)樣本先溶出附著在微孔容器內(nèi)標(biāo)記抗β-受體激動(dòng)劑小分子抗體的Eu3+熒光乳膠顆粒并充分混合，使檢測(cè)樣本和標(biāo)記物充分反應(yīng)，然后把此反應(yīng)液滴加到試卡或試條上進(jìn)行免疫層析，同時(shí)和包被在硝酸纖維膜上的β-受體激動(dòng)劑小分子BSA結(jié)合物進(jìn)行免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，5分鐘后將試卡或試條插入熒光讀數(shù)儀測(cè)量熒光值，得到測(cè)定結(jié)果，此法靈敏度高且定量，又集操作簡(jiǎn)便和快速等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于種植、養(yǎng)殖、牧業(yè)、食品加工等生產(chǎn)領(lǐng)域現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)食品和原料中β-受體激動(dòng)劑等獸藥殘留。
【專(zhuān)利說(shuō)明】銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中 β-受體激動(dòng)劑試劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明應(yīng)用免疫學(xué)原理，在包有銪螯合物的乳膠顆粒上標(biāo)記特異性抗體，通過(guò)免 疫層析技術(shù)和相應(yīng)包被抗原的免疫反應(yīng)，再借助于時(shí)間分辨熒光儀達(dá)到定量檢測(cè)低濃度 β -受體激動(dòng)劑，應(yīng)用于快速定量檢測(cè)食品和飼料中β -受體激動(dòng)劑及獸藥殘留。

【背景技術(shù)】
[0002] 食品安全日益受到人們重視，尤其通過(guò)2011年"3. 15事件"畜牧業(yè)上非法添加瘦 肉精的暴光，以及近年來(lái)食品安全事故頻發(fā)，例豬肉的瘦肉精中毒、三聚氰胺的毒奶粉、孔 雀石綠的致癌魚(yú)等等，使我國(guó)的食品安全成了全球關(guān)注焦點(diǎn)。
[0003] 我國(guó)雖然加強(qiáng)對(duì)"瘦肉精"類(lèi)的β -受體激動(dòng)劑監(jiān)控力度，嚴(yán)厲打擊生豬養(yǎng)殖業(yè)非 法添加，但一些不法分子在黑心利益驅(qū)動(dòng)下逃避政府監(jiān)控，仍使用"瘦肉精"或類(lèi)似物。故 加強(qiáng)政府監(jiān)控同時(shí)，不斷提高檢測(cè)方法，來(lái)震懾那些不法之徒，保障百姓的食品安全。
[0004] 目前，檢測(cè)瘦肉精類(lèi)的β-受體激動(dòng)劑殘留方法，主要有儀器分析，例高效液相色 譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；酶聯(lián)免疫吸附分析法；膠體金快速定性檢測(cè)和熒光檢測(cè)法。 儀器分析法需要昂貴的儀器設(shè)備、專(zhuān)業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室和訓(xùn)練有素的專(zhuān)業(yè)人才，且對(duì)樣品前處 理要求高、過(guò)程復(fù)雜、速度慢等缺點(diǎn)。酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)具有靈敏度高、分析成本低特 點(diǎn)，但耗時(shí)也需專(zhuān)業(yè)人員和實(shí)驗(yàn)室，不適合現(xiàn)場(chǎng)篩選。膠體金層析和免疫熒光層析法，特點(diǎn) 快速簡(jiǎn)便，適合現(xiàn)場(chǎng)快速篩選檢測(cè)，由于膠體金檢測(cè)是通過(guò)肉眼判別結(jié)果，對(duì)檢測(cè)限量低的 項(xiàng)目，例lppb以下或不得檢出的項(xiàng)目，目前技術(shù)很難實(shí)現(xiàn)。另外，膠體金微粒在不同介質(zhì)呈 色略微差異，這樣依顏色深淺來(lái)定量就很難了，由于這些缺陷限止它的縱向發(fā)展。熒光檢測(cè) 原理和膠體金法類(lèi)似，靈敏度比膠體金高，由于試劑組成中的硝酸纖維素膜和檢測(cè)的樣品 背景（例尿樣、組織樣等均含有蛋白、糖類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)具有熒光效應(yīng)）干擾，影響檢測(cè)結(jié) 果的準(zhǔn)確性，尤其對(duì)檢測(cè)限量低的項(xiàng)目這種噪信號(hào)干擾尤為突出，加上此法需配儀器，目前 應(yīng)用面遠(yuǎn)不如膠體金廣。
[0005] 既要達(dá)到膠體金法快速簡(jiǎn)便又實(shí)現(xiàn)高靈敏且定量檢測(cè)的方法，這是人們翹 首以盼的，上世紀(jì)80-90年代Pettersson，Eskola首先報(bào)告了時(shí)間分辨免疫分析法 (time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)在測(cè)定人絨毛膜促性腺激素臨床醫(yī)學(xué)研究中 的應(yīng)用，經(jīng)過(guò)幾十年努力TRFIA在臨床醫(yī)學(xué)得到快速發(fā)展和應(yīng)用。但農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用TRFIA檢 測(cè)剛剛起步，尤其是對(duì)小分子檢測(cè)例食品中獸藥殘留、抗生素殘留檢測(cè)更少。與傳統(tǒng)發(fā)光技 術(shù)相比，時(shí)間分辨熒光一般采用鑭系元素中Eu 3+螯合物，此螯合物激發(fā)光波長(zhǎng)300-340nm， 而發(fā)射光波長(zhǎng)613nm，stokes位移300nm左右，而且突光的半衰期1 X 103_1 X 106ns，而一般 蛋白熒光半衰期（1-lOns)，所以半衰期是一般蛋白熒光半衰期的5-6個(gè)數(shù)量級(jí)長(zhǎng)，這樣激 發(fā)光后，稍延遲一般樣品和材料的熒光已衰變完全，此后再采集熒光信號(hào)只是Eu 3+螯合物 特異物發(fā)出的熒光，由此TRFIA檢測(cè)技術(shù)具有較高的信噪比，具有較高的檢測(cè)靈敏度原因， 時(shí)間分辨熒光免疫分析法的檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)發(fā)光檢測(cè)方法高2到3個(gè)數(shù)量級(jí)，由于熒光 由激發(fā)后銪螯合物產(chǎn)生的，這種熒光不隨樣品形式和時(shí)間變化而影響，所以從理論上實(shí)現(xiàn) 定量檢測(cè)。本發(fā)明在包有Eu3+螯合物乳膠上標(biāo)記特異性抗體，在硝酸纖維素膜上包被相應(yīng) 抗原，這兩者結(jié)合組成試劑，檢測(cè)過(guò)程由TRFIA儀采集信號(hào)實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中β_受體激動(dòng)劑試劑，是一 種在Eu 3+螯合物乳膠上標(biāo)記特異性抗體，在硝酸纖素膜上包被相應(yīng)抗原，由這兩者結(jié)合組 成的測(cè)試試劑。此試劑的特點(diǎn)：快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏和定量。本發(fā)明目的為快速準(zhǔn)確檢 測(cè)食品中的β-受體激動(dòng)劑及其他獸藥殘留和超敏要求的檢測(cè)物--例抗生素、真菌毒素 等--提供更有效手段，同時(shí)彌補(bǔ)膠體金法靈敏度低及不能定量的缺陷。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)：1、包有稀土元素 Eu3+螯合物的熒光乳膠顆粒（Thermo Fisher)上標(biāo)記β-受體激動(dòng)劑類(lèi)小分子的特異性單抗，例鹽酸克侖特羅（Clenbuterol) 抗體（俗稱(chēng)瘦肉精）、萊克多巴胺（Ractopamine)抗體等，標(biāo)記的突光乳膠包被于400ul或 300ul的微孔容器中抽干或凍干。
[0008] 2、在硝酸纖維素膜（Millipore)的檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)上分別包被β -受體激動(dòng)劑類(lèi) 的完全抗原（例Clen-BSA、Rac-BSA)和羊抗鼠 IgG。
[0009] 3、由包被完全抗原的硝酸纖維素膜，加上樣品墊及吸水墊，照?qǐng)D示1貼在粘性PVC 底板上和標(biāo)記微孔容器組成檢測(cè)試劑。
[0010] 4、免疫層析時(shí)（檢測(cè)），先將被測(cè)樣品加入微孔容器內(nèi)，把附著在容器壁上的標(biāo)記 熒光乳膠顆粒溶出、充分混合，同時(shí)如被檢測(cè)樣本含有相應(yīng)的抗原與熒光乳膠顆粒上的抗 體結(jié)合發(fā)生免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，此反應(yīng)液再滴加到試條的樣品墊上進(jìn)行免疫層析，由于 被測(cè)樣本中的抗原和復(fù)溶熒光乳膠標(biāo)記物的抗體發(fā)生了免疫反應(yīng)，此時(shí)混合液層析到檢測(cè) 區(qū)時(shí)包被抗原無(wú)法競(jìng)爭(zhēng)到標(biāo)記抗體，檢測(cè)區(qū)內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)熒光帶，相反如被測(cè)樣本中沒(méi)有被 測(cè)的抗原，則標(biāo)記抗體層析到檢測(cè)區(qū)時(shí)和包被膜上的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)形成熒光帶。質(zhì)控 區(qū)（C)包被羊抗鼠 IgG為質(zhì)控線，所以不管結(jié)果怎樣質(zhì)控線C始終出現(xiàn)熒光帶，這也證明試 劑有效性
[0011] 5、測(cè)定結(jié)果：將加樣過(guò)的試條或試卡插入時(shí)間分辨熒光分析儀上讀取試劑兩個(gè)區(qū) 域上的熒光信號(hào)并加以分析處理，獲得檢測(cè)物的定量結(jié)果。
[0012] 本發(fā)明中提到Eu3+螯合物的乳膠粒標(biāo)記方法，包有Eu3+螯合物的乳膠粒上含有相 當(dāng)數(shù)量的游離羧基（-C00H)，而抗體的Fc端含有游離的胺基（-NH 2)，這兩個(gè)基團(tuán)通過(guò)1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC. HC1)共價(jià)鍵偶聯(lián)（-C0NH-)，即將抗體標(biāo) 記到乳膠上。
[0013] 本發(fā)明中提到標(biāo)記抗體的乳膠包于微孔容器抽干或凍干。也可以將標(biāo)記物包被于 聚脂載體材料或玻纖材料上后再抽干或烘干，后者稱(chēng)標(biāo)記墊，組成試劑時(shí)將標(biāo)記墊貼在樣 品墊和硝酸纖維素膜之間直接組成試劑。
[0014] 本發(fā)明中提到的完全抗原是小分子半抗原物質(zhì)（例瘦肉精（Clenbuterol)、萊克 多巴胺（Ractopamine)等），和載體蛋白（例牛血清白蛋白BSA)通過(guò)EDC聯(lián)偶成結(jié)合物，因 為小分子半抗原無(wú)法固定在硝酸纖維素膜上。
[0015] 本發(fā)明的試劑由五部分組成：硝酸纖維素膜、吸水紙、樣品墊（玻纖濾樣墊）、PVC 底板和微孔容器.
[0016] 硝酸纖維素膜：包被在檢測(cè)區(qū)（T)上完全抗原（例CLEN-BSA結(jié)合物）的檢測(cè)線， 和質(zhì)控區(qū)（C)上羊抗鼠 IgG質(zhì)控線。
[0017] 吸水紙：貼有印有對(duì)應(yīng)測(cè)試物名稱(chēng)的標(biāo)貼，方便用戶辨認(rèn)品種。
[0018] 樣品墊（玻纖濾樣墊）：緩沖液處理過(guò)的特定玻纖濾樣墊。
[0019] PVC底板：支撐硝酸纖維素膜、吸水紙和濾樣墊玻纖的粘性板。
[0020] 微孔容器：含有標(biāo)記抗體的Eu3+螯合物熒光乳膠顆粒。
[0021] 本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0022] 1、靈敏度高，可以檢測(cè)到lng以下，甚至到pg級(jí)，而金標(biāo)法β-受體激動(dòng)劑類(lèi)例 瘦肉精（Clenbuterol)、萊克多巴胺（Ractopamine)，沙丁胺醇（Salbutamol)，目前水平 3-5ng，ELISA可以做到0. lng左右，但耗時(shí)且需專(zhuān)業(yè)人員和實(shí)驗(yàn)室。
[0023] 2、定量，膠體金快速檢測(cè)法僅為定性檢測(cè)。
[0024] 3、快速簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間5-10分鐘出結(jié)果，不需專(zhuān)業(yè)人員操作。
[0025] 4、不但適用于單一檢測(cè)，還適用于批量檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，ELISA雖能定量靈敏度也 高，但不適合單個(gè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
[0026] 5、試劑室溫保存，有效期長(zhǎng)，便于運(yùn)輸，ELISA低溫保存且有效期短。
[0027] 6、數(shù)據(jù)易保存和傳送，時(shí)間分辨熒光儀測(cè)量后，數(shù)據(jù)可直接打印、存貯和傳送。
[0028] 7、數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性好，測(cè)量的是銪激發(fā)后發(fā)出的熒光信號(hào)，試條上的銪不隨時(shí)間而 流失，所以測(cè)試過(guò)的試條隨時(shí)可復(fù)測(cè)，而熒光值幾乎不變，由于此特點(diǎn)可直接保存測(cè)試過(guò)的 試條，而膠體金等其他試劑不具備此特點(diǎn)。
[0029] 本發(fā)明為食品中的β_受體激動(dòng)劑和獸藥等殘留提供了快速、靈敏、定量的檢測(cè) 方法，克服膠體金靈敏度低和無(wú)法定量的缺點(diǎn)，也克服ELISA低溫保存并需專(zhuān)業(yè)人員在實(shí) 驗(yàn)室完成的缺點(diǎn)。本發(fā)明試劑兼顧了他們的優(yōu)點(diǎn)：快速、操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和定量，既適用單個(gè) 檢測(cè)又適合批量檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快速篩選的特點(diǎn)，所以此試劑將更受用戶青睞。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030] 附圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031] 圖中1.硝酸纖維素膜、2.吸水紙、3.玻纖濾樣墊、4. PVC底板、5.容器、6.試劑外 殼、7.組裝試條后的測(cè)試卡。
[0032] 附圖2是本發(fā)明檢測(cè)操作方法示意圖，圖2中的7為試卡檢測(cè)示意圖，圖2中的8 為試條檢測(cè)示意圖。
[0033] 附圖3是本發(fā)明不同濃度的CLEN在365nm波長(zhǎng)熒光下情況。
[0034] 附圖4是本發(fā)明實(shí)施CLEN4參數(shù)Logistic回歸擬合曲線。
[0035] 回歸方程：回歸方程：Y=(A_D) / [1+(X / C)~B]+D
[0036] Α=1· 35092, Β=1· 53788, C=0. 20064, D=0. 21183, R2=0. 9904 ;ED50=0. 25

【具體實(shí)施方式】
[0037] 實(shí)施例1制備層析檢測(cè)試劑條/卡（例鹽酸克侖特羅）
[0038] 1)包有Eu3+螯合物的熒光乳膠標(biāo)記鹽酸克侖特羅抗體：取lOOullO% 200nm表面 帶有羧基的銪乳膠微球（Thermo Fisher公司），加900ul0. 1M MES ρΗ6· 1洗滌，13000rpm 離心30分鐘，棄上清。加 lmlO. 1MMES pH6. 1超聲重懸，加 NHS (N-羥基丁二酰亞胺，Thermo Fisher) 1. 2mg，EDC.HC1(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽，Thermo Fisher)2mg，室溫下活化反應(yīng)1小時(shí)，13000rpm離心30分鐘，棄上清。用lmlO. 1M MES buffer pH6. 1超聲重懸，加入鹽酸克侖特羅抗體0. 2mg混勻，室溫（25-30°C )反應(yīng)2小時(shí)。 標(biāo)記后的乳膠以13000rpm離心30分鐘，棄上清。加入lmlO. 1M pH6. 1含1%BSA的MES超 聲重懸，在室溫下封閉2小時(shí)，13000rpm離心，30分鐘，棄上清，用lmllOmM pH7. 2PBS含1 % BSA稀釋液超聲重懸乳膠微粒，即濃度為1 %標(biāo)記熒光乳膠。
[0039] 2)標(biāo)記微孔容器或標(biāo)記墊的制備：
[0040] 將1)制備的標(biāo)記銪熒光乳膠用含0. 5% BSA、4%蔗糖和0. 5%吐溫-20表面活性 劑的PH7. 4的10mM磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)涑?. 1%濃度，在每個(gè)微孔容器底部加10-15ul， 置真空干燥箱抽干?；蚓鶆虻匕辉诰埘ツど希缓玫臉?biāo)記結(jié)合墊在37°C，相對(duì)濕度小于 20%干燥室干燥10小時(shí)。
[0041] 3)硝酸纖維素膜檢測(cè)區(qū)和對(duì)照區(qū)的制備
[0042] 在硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)上包被濃度0. 4mg / ml含2%蔗糖的0. 01M pH7. 2磷 酸鹽緩沖液中的Clen-BSA(克侖特羅-牛血清白蛋白）偶聯(lián)物，同時(shí)在對(duì)照區(qū)包被濃度為 0. 8mg / ml含2%蔗糖的0. 01M pH7. 2磷酸鹽緩沖液中的羊抗鼠 IgG，包被量為lul / cm， 在37°C，相對(duì)濕度小于20%的干燥室干燥20小時(shí)。
[0043] 4)樣品墊的制備
[0044] 按下表配方（按百分比計(jì)算）配制緩沖液，均勻鋪在樣品處理墊上并維持在37°C， 相對(duì)濕度小于20%干燥。
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中β-受體激動(dòng)劑試劑，其特 征是，采用檢測(cè)樣品首先浸出附著在微孔容器內(nèi)含有Eu 3+螯合物的熒光乳膠顆粒標(biāo)記的抗 β -受體激動(dòng)劑的小分子抗體，在容器內(nèi)充分混合反應(yīng)，然后將此反應(yīng)液滴加到免疫層析試 劑上，含有銪熒光乳膠顆粒標(biāo)記的反應(yīng)液與包被在硝酸纖維素膜上的β-受體激動(dòng)劑的小 分子-BSA結(jié)合物進(jìn)行免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。
2. 銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中β_受體激動(dòng)劑試劑，其特征 是，經(jīng)標(biāo)記的銪熒光乳膠干燥后附著在微孔容器內(nèi)壁得到標(biāo)記的微孔容器。
3. 權(quán)利要求2所述的標(biāo)記的微孔容器，也可以將標(biāo)記的銪熒光乳膠包被于聚脂載體材 料或玻纖材料上后再抽干或烘干，后者稱(chēng)標(biāo)記墊。
4. 權(quán)利要求2所述的容器，容器內(nèi)壁附著標(biāo)記抗β-受體激動(dòng)劑特異性抗體的Eu3+螯 合物熒光乳膠顆粒，其特征是，容器內(nèi)壁附著物不受標(biāo)記的種類(lèi)限制，其他它抗小分子物質(zhì) 的抗體，例抗生素類(lèi)、獸藥類(lèi)、農(nóng)藥類(lèi)、毒品類(lèi)、真菌毒素類(lèi)等抗體，能在使用這些不同抗體 標(biāo)記熒光乳膠顆粒制造的容器中應(yīng)用。
5. 銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中β_受體激動(dòng)劑試劑，其特征 是，檢測(cè)樣品先加入由權(quán)利要求2所述容器，浸出標(biāo)記的熒光膠乳顆粒與之充分混合反應(yīng) 得反應(yīng)液。
6. 權(quán)利要求5所述的檢測(cè)樣品，可以是各種溶液、飲用水、飲料、牛奶、食品等；還包括 人和動(dòng)物的血清、血漿以及各種體液如尿液、唾液、汗液、眼淚等分泌物；也可以是人和動(dòng)物 的組織提取液。
7. 銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中β_受體激動(dòng)劑試劑，其特征 是，把由權(quán)利要求5所述反應(yīng)液加到試劑條上進(jìn)行免疫層析。
8. 銪螯合物乳膠時(shí)間分辨熒光免疫層析定量檢測(cè)食品中β_受體激動(dòng)劑試劑，其特征 是，試劑由五部分組成：硝酸纖維素膜NC、吸水紙、樣品墊、PVC底板和容器。
9. 一種由權(quán)利要求8所述的試劑中硝酸纖維素膜，其特征是，NC膜上有檢測(cè)區(qū)Τ和質(zhì) 控區(qū)C，檢測(cè)區(qū)包被β -受體激動(dòng)劑-BSA結(jié)合物，質(zhì)控區(qū)包被相應(yīng)抗體的二抗IgG，檢測(cè)區(qū)Τ 上包被BSA的結(jié)合物不受結(jié)合物種類(lèi)限制，其他小分子的載體蛋白結(jié)合物，例生素類(lèi)、獸藥 類(lèi)、農(nóng)藥類(lèi)、毒品類(lèi)、真菌毒素類(lèi)等BSA的結(jié)合物，能在使應(yīng)用這些不同的結(jié)合物包被檢測(cè) 區(qū)中應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104090248SQ201310722190
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】王學(xué)生, 杜森垚, 黃華, 胡小龍 申請(qǐng)人:上海容暉生物科技有限公司