一種基于熒光素和巰基修飾的dna探針的電化學(xué)傳感器的制造方法
【專利摘要】一種基于熒光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器，包括電極和DNA探針，所述電極采用三電極系統(tǒng)，所述DNA探針的兩端分別修飾有熒光素和巰基；所述金電極的表面沉積有金納米顆粒；所述DNA探針上修飾的巰基與金納米顆粒之間通過(guò)金-硫鍵結(jié)合；金納米顆粒與DNA探針上修飾的熒光素通過(guò)表面吸附作用，使DNA探針形成了弓形結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述的傳感器通過(guò)電沉積效應(yīng)，在金電極表面修飾上金納米顆粒。這種納米金修飾不僅大大增加了電極表面探針ssDNA的固載量，而且由于納米金對(duì)熒光素的表面吸附作用，使探針形成了弓形結(jié)構(gòu)。這種連接具有較高的電子傳遞效率，可提高雜交前后DPV信號(hào)的改變，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。
【專利說(shuō)明】一種基于熒光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學(xué)生物傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種基于熒光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器。
【背景技術(shù)】[0002]近來(lái)，許多電化學(xué)DNA (E-DNA)傳感器和類似基于適體傳的電化學(xué)(E-AB)傳感器大量涌現(xiàn)，它們是基于探針DNA在動(dòng)力學(xué)上的構(gòu)象變化發(fā)展而來(lái)的一種新型的DNA傳感器。其中探針DNA可以是線性或者環(huán)狀DNA。探針DNA —般一端修飾巰基，一端修飾氧化還原標(biāo)記物。通過(guò)金-硫鍵的作用自組裝到金電極表面。與靶DNA雜交后，改變了探針DNA的構(gòu)型，使得氧化還原標(biāo)記物與電極表面的電子傳遞效率改變，從而改變了電信號(hào)，指示雜交。這種簡(jiǎn)單的傳感器被廣泛地應(yīng)用于DNA、酶、金屬離子和有機(jī)小分子等的研究。但是有些探針DNA的構(gòu)象改變非常復(fù)雜，而對(duì)于一些簡(jiǎn)單的傳感器，其靈敏度和選擇性還需要進(jìn)一步提聞，因此旨在進(jìn)一步提聞傳感器檢測(cè)效率的研究具有廣闊的如景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種基于熒光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器，包括電極和DNA探針，所述電極采用三電極系統(tǒng)，其中金電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉬絲為對(duì)電極；所述DNA探針的兩端分別修飾有熒光素和巰基；所述金電極的表面沉積有金納米顆粒；所述DNA探針上修飾的巰基與金納米顆粒之間通過(guò)金-硫鍵結(jié)合；金納米顆粒與DNA探針上修飾的熒光素通過(guò)表面吸附作用，使DNA探針形成了弓形結(jié)構(gòu)。
[0004]一種如上所述的基于熒光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器，金電極和DNA探針組裝的具體方法如下:
[0005]I)使用清洗劑清洗金電極表面，再用二次水清洗，氮?dú)獯蹈桑缓笤?.1mol.1-1的H2SO4溶液中掃描循環(huán)伏安直到穩(wěn)定；之后將三電極系統(tǒng)插入到6mmol -1-1的HAuCl4(含0.1mol.L-1KNO3)溶液中進(jìn)行電沉積，溶液中還含0.1mol.L-1KNO3, -400mV(vs.SCE)沉積300s，沉積完成后，用二次水清洗電極表面殘留的溶液；
[0006]所述清洗劑為30%H202/70%H2S04，體積比。
[0007]2)將裝配有熒光素和巰基的DNA探針溶液，濃度29 μ mo 1-1,滴涂在納米金顆粒修飾的金電極表面，然后將電極放在空氣流通的地方自然晾干過(guò)夜；此過(guò)程中用一個(gè)小燒杯罩在電極上，在里面放一個(gè)裝滿水的小燒杯保持燒杯罩中的濕度；完成后，用二次水清洗電極，氮?dú)獯蹈?，得到DNA探針修飾的金電極。
[0008]本發(fā)明所述的一種基于熒光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器通過(guò)電沉積效應(yīng)，在金電極表面修飾上金納米顆粒。這種納米金修飾不僅大大增加了電極表面探針ssDNA的固載量，而且由于納米金對(duì)熒光素的表面吸附作用，使探針形成了弓形結(jié)構(gòu)。這種連接具有較高的電子傳遞效率，可提高雜交前后DPV信號(hào)的改變，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為裸金電極表面的電鏡掃描照片；
[0010]圖2為裸金電極在3mmol.L-1氯金酸溶液中，_200mV(vs.SCE)沉積300s后的電鏡掃描照片；
[0011]圖3為裸金電極在6mmol.I71氯金酸溶液中，_400mV(vs.SCE)沉積300s后的電鏡掃描照片；
[0012]圖4為裸金電極在6mmol.I71氯金酸溶液中，_400mV(vs.SCE)沉積400s后的電鏡掃描照片；
[0013]圖5為電極在0.1mol.T1H2SO4溶液中的循環(huán)伏安曲線:裸金電極(a);納米金修飾電極(C)；
[0014]圖6為裸金電極在雜交液中ssDNA-B的濃度為15nmol.1時(shí)雜交前后的DPV峰電流信號(hào)變化圖； [0015]圖7為金納米顆粒修飾的金電極在雜交液中ssDNA-B的濃度為15nmol.1時(shí)雜交前后的DPV峰電流信號(hào)變化圖；
[0016]圖8為裸金電極在雜交液中ssDNA-B的濃度為5nmol -1時(shí)雜交前后的DPV峰電
流信號(hào)變化圖；
[0017]圖9為金納米顆粒修飾的金電極在雜交液中ssDNA-B的濃度為5nmol -1時(shí)雜交前后的DPV峰電流信號(hào)變化圖；
[0018]圖10為紫外吸收值與目標(biāo)DNA濃度的關(guān)系圖；
[0019]圖11為DPV信號(hào)降低率與目標(biāo)ssDNA-B濃度的線性關(guān)系；
[0020]圖12為不同目標(biāo)ssDNA的DPV信號(hào)，(a)只固定探針ssDNA-A的DPV信號(hào)；(b)與50nmol.1 的 ssDNA-C 雜交的 DPV 信號(hào)；(b)與 50nmol.1 的 ssDNA-D 雜交的 DPV 信號(hào)；(d)與50nmol.1的ssDNA-B雜交的DPV信號(hào)；(e)未修飾ssDNA_A的納米金修飾金電極的DPV信號(hào)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下文通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0022]實(shí)施例1
[0023]—種基于突光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器，包括電極和DNA探針,所述電極采用三電極系統(tǒng)，其中金電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉬絲為對(duì)電極；所述DNA探針的兩端分別修飾有熒光素和巰基；所述金電極的表面沉積有金納米顆粒；所述DNA探針上修飾的巰基與金納米顆粒之間通過(guò)金-硫鍵結(jié)合；金納米顆粒與DNA探針上修飾的熒光素通過(guò)表面吸附作用，使DNA探針形成了弓形結(jié)構(gòu)。
[0024]一種如上所述的基于熒光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器，金電極和DNA探針組裝的具體方法如下:
[0025]I)使用清洗劑清洗金電極表面，再用二次水清洗，氮?dú)獯蹈?，然后?.1mol.1的H2SO4溶液中掃描循環(huán)伏安直到穩(wěn)定；之后將三電極系統(tǒng)插入到6mmol -1的HAuCl4(含0.1mol.L-1KNO3)溶液中進(jìn)行電沉積，溶液中還含0.1mol.L-1KNO3, -400mV(vs.SCE)沉積300s，沉積完成后，用二次水清洗電極表面殘留的溶液；[0026]所述清洗劑為piranha溶液，其中30%H202/70%H2S04，體積比。
[0027]2)將裝配有熒光素和巰基的DNA探針溶液，濃度29 μ mo 1.L-1,滴涂在納米金顆粒修飾的金電極表面，然后將電極放在空氣流通的地方自然晾干過(guò)夜；此過(guò)程中用一個(gè)小燒杯罩在電極上，在里面放一個(gè)裝滿水的小燒杯保持燒杯罩中的濕度；完成后，用二次水清洗電極，氮?dú)獯蹈?，得到DNA探針修飾的金電極。
[0028]實(shí)施例2
[0029]金電極上納米金顆粒的生成過(guò)程通過(guò)SEM表征。通過(guò)控制沉積電壓、溶液濃度和沉積時(shí)間可以控制電沉積納米金的尺寸和數(shù)量。圖1-4為裸金電極和金納米顆粒修飾的金電極表面的掃描電鏡。如圖1所示，裸金電極表面基本光滑，沒有納米顆粒在其表面；當(dāng)電壓較低，氯金酸濃度較稀時(shí)，電沉積速度慢，沉積180s后金電極表面僅有一些小顆粒，如圖2所示；在6mmol.L—1氯金酸溶液中，-400mV(vs.SCE)沉積300s后,可看到金電極表面覆蓋了大量的金納米顆粒，在這些金納米顆粒之間有許多空隙，大大增加了金電極比表面積，如圖3所示。隨著沉積時(shí)間的延長(zhǎng)，其效果僅是使沉積顆粒的尺寸增大，如圖4所示。
[0030]將使用本方法制備的納米金修飾電極和裸金電極在0.1mol *L_1的H2SO4中制作循環(huán)伏安曲線，如圖5所示，圖中，裸金電極(a)的峰電流為0.24 μ A，納米金修飾電極(c)的峰電流為1.4μ A。納米金修飾電極的表面積為金電極的5.8倍，可見電沉積納米金顆粒后可顯著提高金電極的表面積。
[0031]實(shí)施例3
[0032]選擇如下序列為探針，5’-T6-TAG GAA ACA CCA AAG ATG ATA TTT-T6_3’，將探針序列的兩端分別修飾上熒光素和巰基，序列如下所示:
[0033]ssDNA-A:
[0034]5’ -F-T6-TAG GAA ACA CCA AAG ATG ATA TTT-T6-SH_3’，其中 F 代表熒光素。
[0035]ssDNA-B:
[0036]5，-AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA-3’ (目標(biāo) DNA)
[0037]ssDNA-C:
[0038]5，-TAC GAG TTG AGA GCA AGC AGA GTT-3，(非互補(bǔ) DNA)
[0039]ssDNA-D:
[0040]5’ -AAA TAT CAT CTT TTG TGT TTC CTA-3’(單堿基錯(cuò)配 DNA)
[0041]以上人工序列由北京賽百盛有限公司提供。
[0042]利用實(shí)施例1的方法將ssDNA-A序列分別修飾到裸金電極和納米金修飾電極上，再分別將修飾好的電極分別單獨(dú)插入到含有目標(biāo)DNA的PBS緩沖溶液中，室溫下雜交lh，然后將雜交后的電極拿出，用二次水清洗，氮?dú)獯蹈伞７謩e組成三電極系統(tǒng)進(jìn)行DPV電化學(xué)檢測(cè)。緩沖體系為磷酸緩沖體系(PBS) (IOOmmol -L-1磷酸緩沖溶液，1.5mol -L-1NaCl, ImmoI.L_1Mg2+, pH=7.2)。
[0043]表1DPV峰電流信號(hào)
[0044]
【權(quán)利要求】
1.一種基于突光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器,其特征在于包括電極和DNA探針，所述電極采用三電極系統(tǒng)，其中金電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，鉬絲為對(duì)電極；所述DNA探針的兩端分別修飾有熒光素和巰基；所述金電極的表面沉積有金納米顆粒；所述DNA探針上修飾的巰基與金納米顆粒之間通過(guò)金-硫鍵結(jié)合；金納米顆粒與DNA探針上修飾的熒光素通過(guò)表面吸附作用，使DNA探針形成了弓形結(jié)構(gòu)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的基于熒光素和巰基修飾的DNA探針的電化學(xué)傳感器，其特征在于金電極和DNA探針組裝的具體方法如下: O使用清洗劑清洗金電極表面，再用二次水清洗，氮?dú)獯蹈?，然后?.1mol.L—1的H2SO4溶液中掃描循環(huán)伏安直到穩(wěn)定；之后將三電極系統(tǒng)插入到6mmol.L—1的HAuCl4(含.0.1mol.L-1KNO3)溶液中進(jìn)行電沉積，溶液中還含0.1mol.L-1KNO3, -400mV(vs.SCE)沉積.300s，沉積完成后，用二次水清洗電極表面殘留的溶液； 所述清洗劑為30%H202/70%H2S04 .2)將裝配有熒光素和巰基的DNA探針溶液，濃度29 μ mo I.L_\滴涂在納米金顆粒修飾的金電極表面，然后將電極放在空氣流通的地方自然晾干過(guò)夜；此過(guò)程中用一個(gè)小燒杯罩在電極上，在里面放一個(gè)裝滿水的小燒杯保持燒杯罩中的濕度；完成后，用二次水清洗電極，氮?dú)獯蹈桑玫紻NA探針修飾的金電極。
【文檔編號(hào)】G01N27/30GK103698374SQ201310716662
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】邢士超, 張少燕, 陳穎, 蔣鋼, 苗志敏, 劉云國(guó), 楊釗, 蘇浩然 申請(qǐng)人:邢士超