專利名稱：一種羧基化法β-環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種羧基化法β -環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)及其制備方法，制備的功能化量子點(diǎn)可以用于腫瘤標(biāo)志物等的特異性熒光檢測(cè)，屬于特異性分子識(shí)別診斷試劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葉酸是細(xì)胞(尤其是增殖旺盛的細(xì)胞)所必需的維生素，它參與多種代謝途徑的一碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)。葉酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通過兩種跨膜蛋白，即低親和力的還原性葉酸載體和高親和力的葉酸受體來完成。目前已證實(shí)葉酸受體在多種腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)，如卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肺癌、腦瘤、室管膜細(xì)胞瘤等，而在多數(shù)正常組織中的表達(dá)僅限于一些難于進(jìn)入血液循環(huán)的上皮細(xì)胞頂膜。葉酸含有α和Y兩個(gè)羧基，易于修飾，同時(shí)具有低免疫原性、小體積、高化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性，高腫瘤滲透性、易與藥物結(jié)合，與有機(jī)或水性溶劑的相容性佳以及低成本等優(yōu)點(diǎn)，故葉酸介導(dǎo)的腫瘤靶向研究得到了迅速發(fā)展。用于生物分子和細(xì)胞標(biāo)記與識(shí)別的熒光探針包括有機(jī)分子熒光探針和無機(jī)分子熒光探針兩類。有機(jī)分子熒光探針的種類盡管比較多，但存在著Stoke位移小，容易光漂白以及量子產(chǎn)率低等不足。無機(jī)分子熒光探針主要是量子點(diǎn)(Quantum Dots，QDs)。QDs是指半徑小于或接近于激子波爾半徑的半導(dǎo)體納米晶粒，粒徑通常為Ι-lOnm，一般為由II-VI族或III-V族元素構(gòu)成的化合物。量子點(diǎn)作為一種新型熒光染料，具有很多獨(dú)特而優(yōu)良的光學(xué)特性，包括(1)連續(xù)而寬的激發(fā)光譜，且熒光譜峰位置可通過改變QDs的粒徑進(jìn)行調(diào)控， 這樣僅用一種波長(zhǎng)的激發(fā)光源便可激發(fā)多種不同顏色熒光的QDs，進(jìn)行多元熒光檢測(cè)。(2) 發(fā)射光譜窄，可同時(shí)顯現(xiàn)多種不同顏色而無重疊。(3)Mokes位移大，能夠避免發(fā)射譜與激發(fā)譜重疊，從而允許在低信號(hào)強(qiáng)度的情況下進(jìn)行光譜學(xué)檢測(cè)。(4)抗光漂白能力強(qiáng)，而這種抗光漂白的高度光穩(wěn)定性對(duì)于需要長(zhǎng)時(shí)間成像的研究而言極為重要。(5)光穩(wěn)定性高，便于獲得無背景干擾的熒光信號(hào)等優(yōu)良的光物理特性。(6)熒光產(chǎn)率高，強(qiáng)度強(qiáng)，單一量子點(diǎn)表現(xiàn)出的熒光亮度是有機(jī)熒光染料的10-20倍。因此，量子點(diǎn)在多個(gè)研究領(lǐng)域顯示出其獨(dú)特的應(yīng)用前景。根據(jù)合成量子點(diǎn)時(shí)所采用溶劑的不同，量子點(diǎn)合成方法可歸結(jié)為兩大類，一種方法是在高沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑中利用前軀體熱分解來合成，得到的產(chǎn)物熒光效率高、尺寸均勻、 穩(wěn)定性好。另一種是利用穩(wěn)定劑在水溶液中直接合成，產(chǎn)物的尺寸分布寬，熒光效率較低。 一般量子點(diǎn)的合成是在有機(jī)溶劑中進(jìn)行的，在非金屬核的外面形成了疏水性的外殼，使得合成的量子點(diǎn)具有疏水性而不能在生物學(xué)上應(yīng)用。為了使它們具有生物相容性，常對(duì)它們進(jìn)行功能化，或?qū)ζ溥M(jìn)行第二層包被，可以增強(qiáng)其水溶性、核的持久穩(wěn)定性以及懸浮性質(zhì)， 使量子點(diǎn)具有更好的生物活性。通過修飾量子點(diǎn)的包被可以得到高度特異性的量子點(diǎn)，用于診斷(分子成像)和治療(生物載體)等。但是它們的潛在毒性就在于它們的包被上，如果這些包被脫離核，不管釋放出組合體的核(CdTe、CdSe)還是單一的金屬鎘(Cd)，都會(huì)產(chǎn)生毒性?；蛘撸恍┝孔狱c(diǎn)包被材料本身就有細(xì)胞毒性，如醋酸甲醇(MAA)。同時(shí)，在光照和氧化條件下量子點(diǎn)可能降解，因此穩(wěn)定性在其商業(yè)化進(jìn)程中顯得至關(guān)重要。近紅外熒光探針在生物體內(nèi)分子的診斷識(shí)別中起著關(guān)鍵的作用。因?yàn)榻t外波段 (60(T800nm)的光波避開了體內(nèi)水，有氧及無氧血紅蛋白等主要吸收組織的最佳吸收波長(zhǎng)， 因而具有良好的生物組織穿透能力，且對(duì)生物組織無損傷。因此具有近紅外發(fā)光特性的水溶性量子點(diǎn)更適合生物分析應(yīng)用。環(huán)糊精(Cyclodextrin，簡(jiǎn)稱⑶)是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，通常含有6 12個(gè)D-吡喃葡萄糖單元。 其中研究得較多并且具有重要實(shí)際意義的是含有6、7、8個(gè)葡萄糖單元的分子，分別稱為 α-、β-、Y-環(huán)糊精。根據(jù)X-線晶體衍射、紅外光譜和核磁共振波譜分析的結(jié)果，確定構(gòu)成環(huán)糊精分子的每個(gè)D(+)-吡喃葡萄糖都是椅式構(gòu)象。各葡萄糖單元均以1，4_糖苷鍵結(jié)合成環(huán)。由于連接葡萄糖單元的糖苷鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，環(huán)糊精不是圓筒狀分子結(jié)構(gòu)而是略呈錐形的圓環(huán)。其中，環(huán)糊精的伯羥基圍成了錐形的小口，而其仲羥基圍成了錐形的大口。 形成略呈錐形的中空?qǐng)A筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)。β-環(huán)糊精(β -⑶)分子結(jié)構(gòu)如下式所示
權(quán)利要求
1.一種羧基化法環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)，其特征在于由β-環(huán)糊精通過化學(xué)方法連接上羧基，再進(jìn)一步與葉酸偶聯(lián)形成葉酸-環(huán)糊精；所述量子點(diǎn)為低毒性功能化量子點(diǎn)，組成低毒性功能化量子點(diǎn)的元素為銀、鋅和銦；該量子點(diǎn)通過葉酸-β-環(huán)糊精修飾得到環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)；該環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)的組成為銀離子銦離子鋅離子 NaS2CN(C2H5)2 葉酸-β -環(huán)糊精的摩爾比為 0. 9-0. 95 0.9-0.95 0.1-0.2 3.5-4.5 4-6。
2.權(quán)利要求1所述羧基化法環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)的制備方法，其特征在于步驟如下(1)羧基-β-環(huán)糊精的制備在容器中加入4. 5-5. 5mmol的β -環(huán)糊精和55_65mL去離子水，在磁力攪拌情況下加入8-lOmmol KOH使β -環(huán)糊精全部溶解；逐漸升溫至45_55°C，加入9-llmmol羧基化試劑，連續(xù)攪拌條件下升溫至85-95°C并保持1小時(shí)，然后停止加熱；待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，用稀硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的PH為5-6，加入100-200mL無水乙醇，利用中性氧化鋁柱進(jìn)行純化層析，采用55%-65%乙醇作為洗脫劑，收集洗脫液，濃縮洗脫液后真空干燥，得到羧基-β-環(huán)糊精；(2)羧基-β-環(huán)糊精與葉酸的偶聯(lián)制備葉酸-β -環(huán)糊精a、葉酸的活化在容器中加入4.5-5.5mmol葉酸并溶解在ll_13mL無水二甲基亞砜中，在不斷攪拌條件下加入5.5-6. 5mmol 1-乙基-3- (3-二甲基丙胺)碳二亞胺鹽酸鹽和 5. 5-6. 5mmol N-羥基琥珀酰亞胺活化反應(yīng)4小時(shí)；將活化后的葉酸滴加到含有180-220mg的雙氨基聚乙二醇的無水二甲基亞砜溶液中， 避光條件下反應(yīng)10小時(shí)，然后通過硅膠柱層析的方法純化，獲得葉酸-聚乙二醇偶聯(lián)物；b、葉酸-聚乙二醇偶聯(lián)物與羧基-β -環(huán)糊精的偶聯(lián)在45-55mL無水二甲基亞砜溶液中加入1. 8-2. 2 mmol步驟(1)制備的羧基-β -環(huán)糊精，溶解后加入1.8-2. 2mmol 1-乙基_3_(3-二甲基丙胺)碳二亞胺鹽酸鹽和1. 8_2. 2mmol N-羥基琥珀酰亞胺活化反應(yīng)6小時(shí)，然后將活化液滴加到上述含有葉酸-聚乙二醇偶聯(lián)物的緩沖液中，避光條件下反應(yīng)M小時(shí)；反應(yīng)的粗產(chǎn)物通過硅膠柱層析的方法純化，獲得葉酸-β-環(huán)糊精；(3)量子點(diǎn)的制備a、前驅(qū)體的制備將0. 9-0. 95mmol AgNO3>0. 9-0. 95mmol In (NO3) 3、0. 1-0. 2mmol Si(NO3)2溶于3-5mL的去離子水中，再將3. 5-4. 5mmol NaS2CN(C2H5)2溶于2. 5-7. 5去離子水溶液中，兩者混合后磁力攪拌20-40min除去其中的水分，并依次用10_14mL的去離子水和8-12mL甲醇洗滌，得到量子點(diǎn)前驅(qū)體二乙基二硫代氨基甲酸鹽；b、油溶性量子點(diǎn)的制備在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下將步驟a所得量子點(diǎn)前驅(qū)體二乙基二硫代氨基甲酸鹽緩慢加熱至170-180°C，并保持該溫度40-60min，然后向其中加入2_4mL油胺， 繼續(xù)加熱24min后停止加熱，并逐漸冷卻至室溫；c、量子點(diǎn)的純化處理將步驟b所得油溶性量子點(diǎn)在500-2500r/min離心2-5min，取上清液，向其中加入8-12mL甲醇，攪拌l-5min后用真空抽濾方式得到純化的量子點(diǎn)；(4)量子點(diǎn)的功能化修飾取步驟(3)所得的純化量子點(diǎn)溶于1.5-8. 5mL三氯甲烷溶液中，步驟(2)所得葉酸- β -環(huán)糊精溶于1. 5-6. 5mL去離子水中，混合后攪拌3_10min，500_2500r/min離心，取水層即得產(chǎn)物羧基化法β-環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述羧基化法環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)的制備方法， 其特征在于所述羧基化試劑為2-氯乙酸鈉，3-氯丙酸鈉，3-溴丙酸鈉，4-氯丁酸鈉，4-溴丁酸鈉。
4.權(quán)利要求1所述羧基化法環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)的應(yīng)用，其特征在于所述量子點(diǎn)作為探針用于腫瘤標(biāo)志物的特異性熒光檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種羧基化法β-環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)及其制備方法，屬于特異性分子識(shí)別診斷試劑領(lǐng)域。本發(fā)明通過化學(xué)修飾方法在β-環(huán)糊精上連接功能基團(tuán)羧基，得到羧基-β-環(huán)糊精；在1-乙基-3-(3-二甲基丙胺)碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的作用下，葉酸經(jīng)活化后先與雙氨基聚乙二醇偶聯(lián)，再與羧基-β-環(huán)糊精偶聯(lián)，得到葉酸-β-環(huán)糊精；利用銀，鋅等低毒性元素作為原料，制備油溶性的近紅外量子點(diǎn)，并用葉酸-β-環(huán)糊精對(duì)其進(jìn)行水溶性的修飾，得到羧基化法β-環(huán)糊精修飾的低毒性功能化量子點(diǎn)。本發(fā)明制備的量子點(diǎn)具有良好的水溶性，低毒性，發(fā)射光譜在近紅外區(qū)，并且由于偶聯(lián)了葉酸，可以用于腫瘤的特異性熒光檢測(cè)。
文檔編號(hào)C08B37/16GK102206487SQ20111010007
公開日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2011年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者邵建輝 申請(qǐng)人:無錫榮興科技有限公司