冠狀動(dòng)脈疾病的生物標(biāo)志物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】在多個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定哺乳動(dòng)物具有提高的不利心血管事件風(fēng)險(xiǎn)(例如MI)和/或確定哺乳動(dòng)物的預(yù)后的方法。在某些實(shí)施方案中，該方法包括確定與來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平或?qū)е缕涞玫酱_定，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，抗MAA加合物抗體的提高的水平指示所述哺乳動(dòng)物患有一種或多種動(dòng)脈粥樣硬化病變和/或存在心肌梗死的提高的風(fēng)險(xiǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】泡狀動(dòng)脈疾病的生物標(biāo)志物
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年3月11日申請(qǐng)的USSN61/451729的優(yōu)先權(quán)和利益，其通過(guò)引用被整體并入本文，用于所有目的。
[0003]政府支持申明
[0004][不適用]
[0005]發(fā)明背景
[0006]動(dòng)脈粥樣硬化后遺癥，諸如外周動(dòng)脈閉塞性疾病、冠狀動(dòng)脈疾病以及中風(fēng)性腦發(fā)作，仍然是美國(guó)、歐洲和大部分亞洲地區(qū)的主要死亡原因之一。具體來(lái)說(shuō)，冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)是美國(guó)的死亡率的首要原因和2.7個(gè)美國(guó)人中的一個(gè)人的死亡的原因。
[0007]動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展被認(rèn)為是動(dòng)脈血管壁的慢性進(jìn)行性炎癥，其以生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞相互作用的復(fù)雜的相互作用為特征。一般來(lái)說(shuō)，LDL和其他的蛋白質(zhì)成為氧化態(tài)、結(jié)合并激活內(nèi)皮細(xì)胞，隨后移入環(huán)繞脈管系統(tǒng)的組織內(nèi)。巨噬細(xì)胞結(jié)合到激活的內(nèi)皮細(xì)胞上并滲入該區(qū)域內(nèi)。巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的清道夫受體(SR)結(jié)合并內(nèi)在化這些材料形成“泡沫細(xì)胞”。發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化且更多結(jié)合到內(nèi)皮巨噬細(xì)胞上的LDL和蛋白質(zhì)被氧化。諸如選擇蛋白、整合素、ICMA-1、VCAM-1和血小板-內(nèi)皮-細(xì)胞粘附分子_1等的內(nèi)皮粘附分子的表達(dá)，介導(dǎo)內(nèi)腔中單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的粘附且炎癥細(xì)胞因子/趨化因子(例如，IL-6、CRP、TNF、IL-1等)得到釋放。最后發(fā)生大量的細(xì)胞凋亡/壞死。斑塊變得不穩(wěn)定且最終帽被破壞。
[0008]重要的是，70%的40歲及更年長(zhǎng)的個(gè)體患有CAD，然而，其為亞臨床的，沒(méi)有體征。同樣，目前還不存在可用的能鑒定這些CAD個(gè)體的非侵害性測(cè)試。對(duì)這些患者進(jìn)行侵害性測(cè)試(例如，心臟導(dǎo)管插入)以確定非阻塞性和亞臨床的CAD的存在是禁忌的。包括計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和磁共振(MR)冠狀動(dòng)脈造影(CTA和MRA)的非侵害性成像在檢測(cè)這些CAD病灶中是不可靠的。
[0009]發(fā)明概述
[0010]在多個(gè)實(shí)施方案中，提供了鑒定哺乳動(dòng)物具有不利心血管事件(例如，心肌梗死)的提高的風(fēng)險(xiǎn)和/或確定哺乳動(dòng)物的預(yù)后的方法。在某些實(shí)施方案中，方法通常包括確定與來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物樣品中丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，抗體的提高的水平指示哺乳動(dòng)物患有一種或多種動(dòng)脈粥樣硬化病變。在某些實(shí)施方案中，方法包括確定與加合物結(jié)合的IgG抗體，和/或與加合物結(jié)合的IgM抗體，和/或與加合物結(jié)合的IgA抗體的存在和/或水平，或使其得到確定。在某些實(shí)施方案中，IgG抗體和/或IgM抗體的提高的水平(相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平)指示哺乳動(dòng)物具有一個(gè)或多個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊且存在心臟動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)。在多個(gè)實(shí)施方案中，IgG和/或IgM抗體越高，疾病嚴(yán)重度和/或不利的事件(例如，心肌梗死)的風(fēng)險(xiǎn)越大。在某些實(shí)施方案中，相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，IgA抗體提高的水平指示哺乳動(dòng)物患有穩(wěn)定型心絞痛。在某些實(shí)施方案中，與提高的IgG和/或IgM相關(guān)的正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平可比擬的IgA抗體的水平指示哺乳動(dòng)物患有不穩(wěn)定型心絞痛，且存在明顯的心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)。在多個(gè)實(shí)施方案中(例如，高IgG和/或IgM和高IgA)，哺乳動(dòng)物作為具有提高的不利心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體和/或作為患有穩(wěn)定型心絞痛的個(gè)體接受治療。在某些實(shí)施方案中(例如，高IgG和/或IgM和低IgA)，哺乳動(dòng)物作為具有不穩(wěn)定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體接受處理。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物被開(kāi)出補(bǔ)充測(cè)試的處方和/或需進(jìn)行補(bǔ)充測(cè)試。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)充測(cè)試不為與MAA加合物結(jié)合的抗體的測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)充測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:心臟組織損傷或高心臟病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)的血液檢查、心電圖、壓力測(cè)試、冠脈MRI和冠狀動(dòng)脈造影。在某些實(shí)施方案中，血液檢查包括選自以下的一種或多種測(cè)試:肌鈣蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌紅蛋白。在某些實(shí)施方案中，壓力測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:運(yùn)動(dòng)耐量測(cè)試、核壓力測(cè)試和壓力超聲波心動(dòng)圖。在某些實(shí)施方案中，作為對(duì)分析數(shù)據(jù)的響應(yīng)，哺乳動(dòng)物被開(kāi)出治療的處方和/或需治療需改變治療方案。在某些實(shí)施方案中，治療包括改變飲食和/或運(yùn)動(dòng)。在某些實(shí)施方案中，治療包括給予一種或多種藥物(例如，選自以下的一種或多種藥物:他汀類(lèi)、β_受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、血管緊張素受體受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪)。在某些實(shí)施方案中，治療為選自以下的治療:血管成形術(shù)、支架植入和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)。在某些實(shí)施方案中，在患者病歷中記錄了抗MAA加合物IgG抗體或抗MAA-1gM抗體水平和/或基于，至少部分基于水平的診斷。在某些實(shí)施方案中，在患者病歷中記錄了抗MAA加合物IgA抗體水平和/或基于，至少部分基于水平的診斷。在某些實(shí)施方案中，患者病歷由實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)師診所、醫(yī)院、健康維護(hù)組織、保險(xiǎn)公司或私人病歷網(wǎng)站維護(hù)。在某些實(shí)施方案中，在選自以下的醫(yī)師警示物品上/內(nèi)記錄了至少部分基于抗MAA加合物IgG抗體水平,和/或IgM抗體水平,和/或IgA抗體水平的診斷:卡、穿戴物或射頻識(shí)別(RFID)標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，在非暫時(shí)性的計(jì)算機(jī)可讀媒介上記錄了抗體水平和/或基于抗體水平的診斷。在某些實(shí)施方案中，方法還包括告知個(gè)體抗MAA加合物抗體和/或至少部分基于抗MAA加合物抗體分析的診斷的結(jié)果。在某些實(shí)施方案中，與MAA加合物結(jié)合的抗體作為差別診斷的一部分被檢測(cè)。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為非人的哺乳動(dòng)物，且生物樣品來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為人，且生物樣品來(lái)自人。在某些實(shí)施方案中，生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。在多個(gè)實(shí)施方案中，在分析中檢測(cè)抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將生物樣品分開(kāi)以從至少一種其他的樣品組分中分離包含抗體的部分。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為已知患有或懷疑患有動(dòng)脈粥樣硬化和/或已知具有或懷疑具有心血管疾病的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子的哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物具有選自以下的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子:心臟病家族風(fēng)險(xiǎn)、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結(jié)締組織病癥、慢性感染以及炎癥性腸病。在某些實(shí)施方案中，在分析中檢測(cè)了與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體和/或IgM抗體，和/或IgA抗體，在所述分析中，抗體和/或抗體和MAA加合物之間形成的復(fù)合物變成標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，在分析中檢測(cè)了與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體，在所述分析中，抗體通過(guò)與另一分析組分形成復(fù)合物從未結(jié)合狀態(tài)變成了結(jié)合狀態(tài)。在某些實(shí)施方案中，在分析中檢測(cè)了與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗體變成固定在固相上。在某些實(shí)施方案中，使用選自以下的分析測(cè)量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平:SDS/PAGE、等電點(diǎn)聚焦、2維凝膠電泳、血凝分析和免疫分析。在某些實(shí)施方案中，使用ELISA分析測(cè)量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平。在某些實(shí)施方案中，免疫分析包括:提供固定在固相支持體上的MAA加合物；在這樣的條件下將MAA加合物與生物樣品接觸，其中樣品中的抗MAA加合物抗體結(jié)合MAA加合物，形成加合物/抗體復(fù)合物；及將復(fù)合物與特異性結(jié)合IgG抗體或IgA抗體，或IgM抗體的檢測(cè)抗體接觸，或?qū)?fù)合物與結(jié)合任一抗體的檢測(cè)試劑接觸；及檢測(cè)和/或定量結(jié)合的檢測(cè)抗體或結(jié)合的檢測(cè)試劑。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)抗體被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上或被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上的另一抗體結(jié)合；和/或檢測(cè)試劑被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上和/或檢測(cè)試劑被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上的抗體結(jié)合；且檢測(cè)和/或定量包括檢測(cè)和/或定量可檢測(cè)標(biāo)記。
[0011]在多個(gè)實(shí)施方案中，提供了監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠狀動(dòng)脈疾病的進(jìn)展的方法。該方法通常包括:確定與來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物樣品中丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定；和將抗體的水平與在先前的時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的哺乳動(dòng)物的水平比較，其中相比先前的測(cè)定，與生物樣品中的MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平的增加指示哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變已經(jīng)惡化；且相比先前的測(cè)定，與生物樣品中的MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平的減少指示哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變得到減少。在某些實(shí)施方案中，在先前的時(shí)間點(diǎn)與確定或?qū)е碌玫酱_定的時(shí)間之間的時(shí)期，哺乳動(dòng)物接受了動(dòng)脈粥樣硬化，和/或冠狀動(dòng)脈疾病的治療，且相比先前的測(cè)定，與生物樣品中的MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平增加指示治療具有有限的或沒(méi)有功效且哺乳動(dòng)物中斑塊已經(jīng)惡化；且相比先前的測(cè)定，與生物樣品中的MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平的減少指示治療至少具有一些功效且哺乳動(dòng)物中斑塊得到減少。在某些實(shí)施方案中，方法包括確定與加合物結(jié)合的IgG抗體的存在和/或水平或使其得到確定。在某些實(shí)施方案中，方法包括確定與加合物結(jié)合的IgM抗體的存在和/或水平或使其得到確定。在某些實(shí)施方案中，方法包括確定與加合物結(jié)合的IgA抗體的存在和/或水平或使其得到確定。在某些實(shí)施方案中，相比先前的測(cè)定，與生物樣品中的MAA加合物結(jié)合的抗體和/或從IgM至IJ IgG抗體的類(lèi)別轉(zhuǎn)換的總水平的增加指示哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變(斑塊)已經(jīng)惡化；且相比先前的測(cè)定，與生物樣品中的MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平和/或從IgG到IgM抗體的類(lèi)別轉(zhuǎn)換的減少指示哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變(斑塊)得到減少。在某些實(shí)施方案中，相比先前的測(cè)定，IgA抗體的增加指示哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變變得更穩(wěn)定，和/或治療至少部分地增加哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變的穩(wěn)定性。在某些實(shí)施方案中，治療包括選自以下的哺乳動(dòng)物的一種或多種形式:改變飲食、增加運(yùn)動(dòng)、開(kāi)/給予他汀類(lèi)處方、開(kāi)/給予β_受體阻滯劑處方、開(kāi)/給予鈣通道阻滯劑處方。在某些實(shí)施方案中，如果測(cè)量提供治療具有有限的或沒(méi)有功效和/或哺乳動(dòng)物中病變已經(jīng)惡化的指示，則對(duì)哺乳動(dòng)物開(kāi)出補(bǔ)充測(cè)試的處方和/或?qū)ζ溥M(jìn)行補(bǔ)充測(cè)試。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)充測(cè)試不為與MAA加合物結(jié)合的抗體的測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)充測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:心臟組織損傷或高心臟病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)的血液檢查、心電圖、壓力測(cè)試、冠脈MRI和冠狀動(dòng)脈造影。在某些實(shí)施方案中，血液檢查包括選自以下的一種或多種測(cè)試:肌鈣蛋白1、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌紅蛋白。在某些實(shí)施方案中，壓力測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:運(yùn)動(dòng)耐量測(cè)試、核壓力測(cè)試和壓力超聲波心動(dòng)圖。在某些實(shí)施方案中，如果測(cè)量提供治療具有有限的或沒(méi)有功效和/或哺乳動(dòng)物中病變已經(jīng)惡化的指示，則給哺乳動(dòng)物開(kāi)出需使用新的治療、不同的治療或補(bǔ)充治療的處方和/或使用新的治療、不同的治療或補(bǔ)充治療對(duì)其治療。在某些實(shí)施方案中，治療包括給予藥物(例如，選自以下的一種或多種藥物:他汀類(lèi)、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、血管緊張素受體受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪)。在某些實(shí)施方案中，治療為選自以下的治療:血管成形術(shù)、支架植入和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為非人的哺乳動(dòng)物，且生物樣品來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物，或者哺乳動(dòng)物為人，且生物樣品來(lái)自人。在某些實(shí)施方案中，生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、血漿、血清、組織液、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。在某些實(shí)施方案中，在分析中檢測(cè)抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將生物樣品分開(kāi)以從至少一種其他的樣品組分中分離包含抗體的部分。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為已知患有或懷疑患有動(dòng)脈粥樣硬化的哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物具有選自以下的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子:心臟病家族風(fēng)險(xiǎn)、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結(jié)締組織病癥、慢性感染以及炎癥性腸病、
[0012]在多個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療哺乳動(dòng)物的方法，其中該方法包括接受與來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平的測(cè)量，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，抗體的提高的水平指示哺乳動(dòng)物患有一種或多種動(dòng)脈粥樣硬化病變；且當(dāng)抗體顯示提高的水平中，需提供或?qū)е屡c動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的補(bǔ)充測(cè)試被提供和/或需提供或?qū)е屡c動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的補(bǔ)充治療被提供給哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，方法包括接受與加合物結(jié)合的IgG抗體的存在和/或水平的測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，方法包括接受與加合物結(jié)合的IgM抗體的存在和/或水平的測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，方法包括接受與加合物結(jié)合的IgA抗體的存在和/或水平的測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，接受測(cè)量包括取回和/或查看患者病歷中的測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，接受測(cè)量包括取回和/或查看來(lái)自診斷實(shí)驗(yàn)室的報(bào)告中的測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，接受測(cè)量包括訂購(gòu)分析和接收分析結(jié)果。在多個(gè)實(shí)施方案中，相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，IgA抗體提高的水平(例如至少95%置信水平的統(tǒng)計(jì)上顯著的提高，優(yōu)選至少98%的置信水平，更優(yōu)選至少99%的置信水平，使用任何合適的參數(shù)或非參數(shù)檢驗(yàn))指示哺乳動(dòng)物患有穩(wěn)定型心絞痛，且被進(jìn)一步測(cè)試哺乳動(dòng)物和/或?qū)⑵渥鳛榛加谢虼嬖诜€(wěn)定型心絞痛的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體治療。在多個(gè)實(shí)施方案中，相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，IgA抗體的水平指示哺乳動(dòng)物患有不穩(wěn)定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)，且被進(jìn)一步測(cè)試哺乳動(dòng)物和/或?qū)⑵渥鳛榛加谢虼嬖诓环€(wěn)定型心絞痛和/或心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體治療。在某些實(shí)施方案中，對(duì)哺乳動(dòng)物開(kāi)出補(bǔ)充測(cè)試的處方和/或需進(jìn)行補(bǔ)充測(cè)試。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)充測(cè)試不為與MAA加合物結(jié)合的抗體的測(cè)量。在某些實(shí)施方案中，補(bǔ)充測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:心臟組織損傷或高心臟病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)的血液檢查、心電圖、壓力測(cè)試、冠脈MRI和冠狀動(dòng)脈造影。在某些實(shí)施方案中，血液檢查包括選自以下的一種或多種測(cè)試:肌鈣蛋白1、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌紅蛋白。在某些實(shí)施方案中，壓力測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:運(yùn)動(dòng)耐量測(cè)試、核壓力測(cè)試和壓力超聲波心動(dòng)圖。在某些實(shí)施方案中，給哺乳動(dòng)物開(kāi)出需治療的處方和/或?qū)ζ渲委煛Ｔ谀承?shí)施方案中，治療包括給予藥物(例如，選自以下的一種或多種藥物:他汀類(lèi)、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、鈣通道阻滯劑和雷諾嗪)。在某些實(shí)施方案中，治療為選自以下的治療:血管成形術(shù)、支架植入和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為非人的哺乳動(dòng)物，且生物樣品來(lái)自非人的哺乳動(dòng)物，或者哺乳動(dòng)物為人，且生物樣品來(lái)自人。在某些實(shí)施方案中，生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、血漿、血清、組織液、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。在某些實(shí)施方案中，在分析中檢測(cè)抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將生物樣品分開(kāi)以從至少一種其他的樣品組分中分離包含抗體的部分。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為已知患有或懷疑患有動(dòng)脈粥樣硬化(和/或已知具有或懷疑具有一種或多種動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)因子)的哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物具有選自以下的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子:心臟病家族風(fēng)險(xiǎn)、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結(jié)締組織病癥、慢性感染以及炎癥性腸病。在某些實(shí)施方案中，在分析中確定與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測(cè)量，在所述分析中，抗體和/或抗體和MAA加合物之間形成的復(fù)合物變得標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，在分析中確定與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測(cè)量，在所述分析中，抗體通過(guò)與其他的分析組分形成復(fù)合物從未結(jié)合狀態(tài)變成了結(jié)合狀態(tài)。在某些實(shí)施方案中，在分析中確定與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測(cè)量，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗體變成被固定在固相上的抗體。在某些實(shí)施方案中，使用選自以下的分析測(cè)量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平:SDS/PAGE、等電點(diǎn)聚焦、2維凝膠電泳、血凝分析和免疫分析。在某些實(shí)施方案中，使用ELISA分析測(cè)量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體。在多個(gè)實(shí)施方案中，免疫分析包括:提供被固定在固相支持體上的MAA加合物；在這樣的條件下將MAA加合物與生物樣品接觸，其中樣品中的抗MAA加合物抗體結(jié)合MAA加合物，形成加合物/抗體復(fù)合物；和將復(fù)合物與特異性結(jié)合IgG抗體或IgA抗體，或IgM抗體的檢測(cè)抗體接觸，或?qū)?fù)合物與結(jié)合任一抗體的檢測(cè)試劑接觸；和檢測(cè)和/或定量結(jié)合的檢測(cè)抗體或結(jié)合的檢測(cè)試劑。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)抗體被連接在可檢測(cè)標(biāo)記上或被連接在可檢測(cè)標(biāo)記上的其他的抗體結(jié)合；和/或檢測(cè)試劑被連接在可檢測(cè)標(biāo)記上和/或檢測(cè)試劑被連接在可檢測(cè)標(biāo)記上的抗體結(jié)合；且檢測(cè)和/或定量包括檢測(cè)和/或定量可檢測(cè)標(biāo)記。
[0013]在某些實(shí)施方案中，提供了用于評(píng)估(和/或冠狀動(dòng)脈疾病)哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化的存在和/或預(yù)后的試劑盒。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含含有MAA蛋白質(zhì)加合物的包裝；和與結(jié)合在MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgG抗體特異性結(jié)合的第一試劑和/或與結(jié)合在MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgM抗體特異性結(jié)合的第二試劑。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包含與結(jié)合在MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgA抗體特異性結(jié)合的第三試劑。在某些實(shí)施方案中，第一試劑包含與結(jié)合在MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgG抗體結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方案中，第二試劑包含與結(jié)合在MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgM抗體結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方案中，第三試劑包含與結(jié)合在MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgA抗體結(jié)合的抗體。在某些實(shí)施方案中，MAA蛋白質(zhì)加合物以被固定在固相支持體上的形式提供。在某些實(shí)施方案中，固相支持體包括選自以下的材料:塑料、玻璃、石英、凝膠和金屬。在某些實(shí)施方案中，固相支持體選自以下:顆粒、測(cè)試條、微量滴定板、ELISA板和微流通道或室。在某些實(shí)施方案中，試劑盒還包含教會(huì)使用MAA加合物的抗體的測(cè)量來(lái)評(píng)估不利心臟事件風(fēng)險(xiǎn)，和/或來(lái)確定哺乳動(dòng)物的預(yù)后，和/或來(lái)評(píng)估哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，和/或來(lái)評(píng)估治療方案的指導(dǎo)材料。在某些實(shí)施方案中，將試劑盒用于評(píng)估不利心臟事件風(fēng)險(xiǎn)，和/或確定哺乳動(dòng)物的預(yù)后，和/或用來(lái)評(píng)估哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，和/或用來(lái)評(píng)估治療方案。
[0014]在多個(gè)實(shí)施方案中，提供了治療哺乳動(dòng)物的方法，其中該方法包括:給予(或?qū)е碌玫浇o予)哺乳動(dòng)物包含特異性結(jié)合到連接在可檢測(cè)標(biāo)記上或能被可檢測(cè)標(biāo)記選擇性結(jié)合的MAA加合物上的抗體的組合物；和檢測(cè)位于哺乳動(dòng)物的脈管系統(tǒng)內(nèi)的標(biāo)記的位置，其中該位置指示潛在的不穩(wěn)定斑塊。在某些實(shí)施方案中，方法還包括治療該潛在的不穩(wěn)定斑塊。在某些實(shí)施方案中，治療包括對(duì)斑塊位于的區(qū)域進(jìn)行血管成形術(shù)和/或在斑塊位于的區(qū)域內(nèi)插入支架。
[0015]定義
[0016]術(shù)語(yǔ)“生物樣品”或“測(cè)試樣品”是指樣品為處于健康和/或病理狀態(tài)的生物組織、細(xì)胞或液體的樣品，包括待檢測(cè)的分析物，例如，對(duì)MAA蛋白質(zhì)加合物(例如，抗MAA加合物IgG、IgA、IgM等)起反應(yīng)的抗體。此類(lèi)樣品包括,但不限于--痰/ 口腔液體、羊水、血液、血液部分或細(xì)針活檢樣品(例如，手術(shù)活檢、細(xì)針活檢等)、尿、腹膜液、胸膜液等。盡管樣品通常取自受試人(例如，患者)，但可以將該分析用來(lái)檢測(cè)來(lái)自任何哺乳動(dòng)物的樣品中的抗MAA加合物抗體，諸如狗、貓、馬、山羊、綿羊、牛、豬等?？梢栽趶纳飦?lái)源獲得時(shí)直接使用樣品或在用來(lái)修改樣品的特征的預(yù)處理后使用。例如，此類(lèi)預(yù)處理可以包括從血液制備血漿、稀釋粘性流體等。預(yù)處理的方法還可以包括，但不限于:過(guò)濾、沉淀、稀釋、蒸餾、混合、離心、冷凍、凍干、濃縮、失活干擾組分、添加試劑、溶解等。如果關(guān)于樣品采用此類(lèi)預(yù)處理方法，此類(lèi)預(yù)處理方法通常使得目標(biāo)分析物(例如，抗MAA加合物抗體)保留在測(cè)試樣品中，優(yōu)選以與未處理的測(cè)試樣品(例如，即，未經(jīng)過(guò)任何此類(lèi)預(yù)處理方法的樣品)中的濃度成比例的濃度。此類(lèi)“處理過(guò)的”或“加工過(guò)的”樣品仍然被認(rèn)為是關(guān)于本文中描述的方法的生物樣品。
[0017]術(shù)語(yǔ)“血液”包括全血或諸如血清或血漿的血液部分。
[0018]通過(guò)“診斷測(cè)試”是指進(jìn)行的有助于疾病和/或病理的診斷或檢測(cè)的任何種類(lèi)的
醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。
[0019]當(dāng)關(guān)于將在如本文中描述的診斷/預(yù)后分析中檢測(cè)的分析物(例如，抗MAA蛋白質(zhì)加合物抗體)使用抗體時(shí)，指的是內(nèi)源性的(內(nèi)在產(chǎn)生的抗體)?？贵w通常包含大體上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的一種或多種多肽。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因，以及大量免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被歸類(lèi)為K或λ。重鏈被歸類(lèi)為Y、μ、α、δ或ε ,它們反過(guò)來(lái)定義免疫球蛋白級(jí)別,分別為IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。
[0020]當(dāng)關(guān)于用于檢測(cè)特定抗原(例如，MAA加合物)的靶向部分使用抗體時(shí)，指的是完全的(完整的免疫球蛋白)或許多通過(guò)用不同的肽酶消化產(chǎn)生的得到良好表征的片段的任何一個(gè)。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)內(nèi)的二硫鍵下消化抗體來(lái)制造F(ab)’2——Fab的二聚物，其自身為通過(guò)二硫鍵連接到Vh-ChI上的輕鏈?？梢栽跍睾蜅l件下減少？(&13)’2來(lái)破壞鉸鏈區(qū)內(nèi)的二硫鍵連接，從而將(Fab’)2 二聚物轉(zhuǎn)化為Fab’單體。Fab’單體本質(zhì)上為帶有部分絞鏈區(qū)的 Fab (見(jiàn)，F(xiàn)undamental Immunology, ff.E.Paul, ed., Raven Press, N.Y.(1993)，其為其他的抗體片段的更為詳盡的描述)。雖然不同的抗體片段以消化完整抗體的形式定義，但技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可以化學(xué)或通過(guò)利用重組DNA方法重新合成此類(lèi)Fab’片段。因此，術(shù)語(yǔ)抗體，如本文中所使用，還包括通過(guò)修改整個(gè)抗體或使用重組DNA方法重新合成制得的抗體片段?？贵w還包括單鏈抗體(作為單個(gè)多肽鏈存在的抗體)，例如，單鏈Fv抗體(sFv或scFv),在該抗體中可變重鏈和可變輕鏈被連接在一起(直接或通過(guò)連接肽)來(lái)形成連續(xù)的多肽。單鏈Fv抗體通常為共價(jià)連接的VH-VL異質(zhì)二聚體，其可能由包含直接連接或通過(guò)肽編碼性連接物連接在一起的VH和VL編碼序列的核酸表達(dá)而來(lái)(見(jiàn)，例如，Huston, et al.(1988) Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 85:5879-5883) ?
[0021]“MAA加合物”指的是按先前所述用MAA部分修飾的任何大分子(見(jiàn)，例如，Hill etal.(1998) Atherosclerosis, 141:107-116，美國(guó)專(zhuān)利 5939535 等)?！癕AA 蛋白質(zhì)加合物”指的是用MAA部分修飾的蛋白質(zhì)。
[0022]“抗MAA加合物抗體”或“抗MAA蛋白質(zhì)加合物抗體”指的是與MAA蛋白質(zhì)加合物特異性結(jié)合(例如，與之反應(yīng))的抗體。MAA蛋白質(zhì)加合物可以為哺乳動(dòng)物中天然存在的加合物，或經(jīng)過(guò)合成制得的加合物。
[0023]“心血管疾病”為心血管障礙，如本文中所定義，其以臨床事件為特征，包括臨床癥狀和臨床跡象。臨床癥狀為可指示臨床醫(yī)師病理存在的由患者匯報(bào)的那些經(jīng)歷。臨床跡象為通過(guò)可指示臨床醫(yī)師病理存在的身體或?qū)嶒?yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)的那些客觀發(fā)現(xiàn)。心血管疾病的臨床癥狀包括胸痛、呼吸淺短、虛弱、短時(shí)間意識(shí)喪失、意識(shí)變化、劇痛、陣發(fā)性夜間呼吸困難、短暫性腦缺血發(fā)作和其他的患者經(jīng)歷的此類(lèi)現(xiàn)象。心血管疾病的臨床跡象包括如EKG異常、改變的外周脈沖、動(dòng)脈雜音、不正常心聲、羅音和喘氣聲、頸靜脈擴(kuò)張、神經(jīng)病變的此類(lèi)發(fā)現(xiàn)以及臨床醫(yī)師識(shí)別的其他的此類(lèi)發(fā)現(xiàn)。臨床癥狀和臨床跡象可以在諸如心肌梗死(MI)或中風(fēng)(也被稱(chēng)為“腦血管意外”或“CVA”)的心血管疾病中聯(lián)合在一起，其中患者會(huì)匯報(bào)某些現(xiàn)象(癥狀)且臨床醫(yī) 師會(huì)識(shí)別其他的現(xiàn)象(跡象)，它們都能指示潛在的病理。心血管疾病包括與易碎斑塊病癥 、閉塞性病癥和狹窄的心血管障礙相關(guān)的那些疾病。例如，由易碎斑塊病癥引起的心血管疾病，由于以下定義了那一術(shù)語(yǔ)，可以將其稱(chēng)為“易碎斑塊疾病”。與易碎斑塊疾病相關(guān)的臨床事件包括那些跡象和癥狀，其中伴隨隨后的急性血栓形成或伴隨末梢栓塞的易碎斑塊的破裂為標(biāo)志。易碎斑塊疾病的實(shí)例包括某些中風(fēng)和心肌梗死。另一個(gè)實(shí)例，由閉塞性病癥引起的心血管疾病可以被稱(chēng)為“閉塞性疾病”。與閉塞性疾病相關(guān)的臨床事件包括那些跡象和癥狀，其中動(dòng)脈的漸進(jìn)性閉塞可影響到達(dá)目標(biāo)組織的流通的量。漸進(jìn)性動(dòng)脈閉塞可以引起漸進(jìn)性局部缺血，其中如果流通的量不足以維持組織，漸進(jìn)性局部缺血可能最終發(fā)展為組織壞死。閉塞性疾病的跡象和癥狀包括:跛、靜息痛、心絞痛和壞疽，以及指示血管狹窄和減少的末梢灌注的身體和實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)。另一個(gè)實(shí)例，由再狹窄引起的心血管疾病可以被稱(chēng)為支架內(nèi)狹窄疾病。支架內(nèi)狹窄疾病包括由作為如同經(jīng)皮經(jīng)腔的血管成形術(shù)的程序的一部分放置的動(dòng)脈支架的漸進(jìn)性堵塞引起的跡象和癥狀，其中支架的存在試圖幫助血管保持其新的擴(kuò)大的構(gòu)型。伴隨支架內(nèi)狹窄疾病的臨床事件為由經(jīng)過(guò)改造的動(dòng)脈的再狹窄引起的事件。
[0024]“冠狀動(dòng)脈疾病”(“CAD”)指的是與服務(wù)心臟的動(dòng)脈的堵塞相關(guān)的血管病癥。堵塞可以通過(guò)諸如斑塊破裂或栓塞的機(jī)制突然發(fā)生。堵塞可以漸進(jìn)式地發(fā)生，通過(guò)肌內(nèi)膜增生和斑塊形成使動(dòng)脈變窄。由服務(wù)心臟的動(dòng)脈的堵塞引起的那些臨床跡象和癥狀為冠狀動(dòng)脈疾病或動(dòng)脈粥樣硬化的臨床表現(xiàn)。冠狀動(dòng)脈疾病的臨床表現(xiàn)包括:心絞痛、局部缺血、心肌梗死、心肌癥、充血性心力衰竭、心律失常和動(dòng)脈瘤形成。應(yīng)當(dāng)理解冠脈循環(huán)中的易碎斑塊疾病與顯現(xiàn)為心肌梗死的動(dòng)脈血栓形成或末梢栓塞相關(guān)。應(yīng)當(dāng)理解冠脈循環(huán)中的閉塞性疾病與心絞痛癥狀伴隨發(fā)生的動(dòng)脈狹窄一通常需用藥物干預(yù)和用血管成形術(shù)治療的病癥相關(guān)。
[0025]“風(fēng)險(xiǎn)因子”為鑒定與增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的因子。心血管障礙或心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子為鑒定與增加的可發(fā)展那些病癥或惡化那些病癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的任何因子。風(fēng)險(xiǎn)因子還可能與患有心血管障礙的患者中不利的臨床事件或不利的臨床結(jié)果的增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子包括，但不限于:吸煙、不利的脂質(zhì)譜、提升的脂肪或膽固醇、糖尿病、高血壓、聞血壓狀態(tài)、提聞的聞半I光氣酸水平以及缺少運(yùn)動(dòng)。攜帶特定的多態(tài)等位基因可能為特定心血管障礙的風(fēng)險(xiǎn)因子，且可能與特定病癥的增加的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。
[0026]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“治療”試圖包括治愈以及改善疾病的至少一種癥狀或者與病癥相關(guān)的至少一種異常情況。治療心血管障礙可以被給予心血管障礙治療替換。治療心血管障礙還可以被修改與心血管障礙相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因子替換。
[0027]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”和“患者”可以可交換地使用，不論個(gè)體是否具有或當(dāng)前正經(jīng)歷任何形式的治療。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”指的是任何的脊椎動(dòng)物，包括，但不限于:哺乳動(dòng)物(例如，奶牛、豬、駱騎、美洲騎、馬、山羊、兔、綿羊、倉(cāng)鼠、豚鼠、貓、狗、大鼠和小鼠、非人的靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，猴子，如獼猴、黑猩猩等)以及人)。優(yōu)選地，個(gè)體為人。
[0028]當(dāng)提及特定標(biāo)志物(例如，MAA加合物和/或抗MAA加合物抗體)的存在或水平“指示”特定病理或預(yù)后時(shí)，沒(méi)有試圖暗示該標(biāo)志物的存在或水平為那一病理或預(yù)后的決定性因素。事實(shí)上該指示試圖在其他的背景下使用(例如，在差別診斷的背景下)，來(lái)告知被進(jìn)一步測(cè)試和/或評(píng)估，和/或生活方式/行為變化，和/或來(lái)告知需進(jìn)一步治療或改變治療方案。
[0029]短語(yǔ)“接受測(cè)量”(例如，與丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平的)表明接受此類(lèi)測(cè)量的人獲得了由另一來(lái)源提供的測(cè)量，例如，通過(guò)查閱病歷，由來(lái)自測(cè)試實(shí)驗(yàn)室的報(bào)告提供、由患者/患者史提供等。在某些實(shí)施方案中，將測(cè)量接收為由接受者(例如，內(nèi)科醫(yī)師)訂購(gòu)的測(cè)試的結(jié)果。在某些實(shí)施方案中，測(cè)量可以由接受者進(jìn)行。
[0030]短語(yǔ)“導(dǎo)致被給予”是指通常由醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)人員(例如，內(nèi)科醫(yī)師)或控制個(gè)體的醫(yī)療護(hù)理的人采取的行動(dòng)，這些行動(dòng)控制和/或允許將處于爭(zhēng)議中的藥劑給予到個(gè)體。導(dǎo)致被給予可以包括合適的治療或預(yù)防方案的診斷和/或測(cè)定，和/或?yàn)閭€(gè)體開(kāi)具體藥劑的處方。此類(lèi)開(kāi)處方可以包括，例如，起草藥方形式、注解病歷等。
[0031]當(dāng)關(guān)于參數(shù)(例如，抗體水平)使用術(shù)語(yǔ)“提高的”是指該參數(shù)落入這樣的范圍內(nèi)，使得本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為關(guān)于參考值其為提高的。在某些實(shí)施方案中，參考值可以為在先前的時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的個(gè)體的值。在某些實(shí)施方案中，參考值可以為已知的或確定的具體群體或亞群體(例如，以選自以下的一種或多種因子為特征的亞群體:性別、年齡、種族、體重、健康狀況等)的值。在某些實(shí)施方案中，如果其落入具體參考群體的值的最高的25個(gè)百分位數(shù)，或最高的10個(gè)百分位數(shù)，或最高的5個(gè)百分位數(shù)，或最高的2個(gè)百分位數(shù)，或最高的I個(gè)百分位數(shù)內(nèi)，參數(shù)被認(rèn)為是提高的。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)在> 95%置信水平，優(yōu)選在> 98%置信水平，更優(yōu)選在> 99%置信水平使用任何合適的參數(shù)檢驗(yàn)(例如，ANOVA, t檢驗(yàn)等)或非參數(shù)檢驗(yàn)，測(cè)得水平為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的提高時(shí)，參數(shù)被認(rèn)為是提高的。
[0032]附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0033]圖1闡述了形成丙二醛/乙醛加合物(MAA)的機(jī)制。
[0034]圖2闡述了形成丙二醛/乙醛加合物(MAA)的第二種機(jī)制。
[0035]圖3闡述了抗MAA抗體的一種分析形式的示意圖。
[0036]圖4闡述了相比患有已知的冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的個(gè)體，正常對(duì)照中MAA的血清濃度。
[0037]圖5闡述了由患有急性MI的患者中循環(huán)性MAA抗體的MAA白蛋白抑制的百分比。這提供了分析特異性的測(cè)量。
[0038]圖6闡述了該事件發(fā)生時(shí)和時(shí)間發(fā)生后24小時(shí)的患有急性心肌梗死的患者中MAA的抗體的血清濃度。
[0039]圖7闡述了來(lái)自冠狀動(dòng)脈旁路移植(CABG)患者的主動(dòng)脈鉆取活組織檢查中的MAA的存在。
[0040]圖8顯示了易損斑塊的示意圖。
[0041 ] 圖9闡述了 JCR大鼠中抗經(jīng)MAA修飾的大鼠白蛋白的血清抗體的濃度。數(shù)據(jù)以6個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的均值土SEM表示。*P ( 0.004，相比Sprague對(duì)照血清的顯著增加。#P ( 0.001，將主動(dòng)脈與主動(dòng)脈MAA包被抗原比較的顯著不同。
[0042]圖10闡述了來(lái)自JCR大鼠的主動(dòng)脈組織的經(jīng)MAA修飾的蛋白質(zhì)的免疫沉淀反應(yīng)。數(shù)據(jù)表示染色88帶的88-kDa的強(qiáng)度，表示為3個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的均值土SEM，*P=0.005，與Sprague對(duì)照大鼠顯著不同。
[0043]圖11顯示了相比患有已知的冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的個(gè)體，正常對(duì)照中MAA的IgG抗體的血清濃度。
[0044]圖12顯示了相比患有已知的冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的個(gè)體，正常對(duì)照中MAA的IgM抗體的血清濃度。
[0045]圖13顯示了相比患有已知的冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的個(gè)體，正常對(duì)照中MAA的IgA抗體的血清濃度。
[0046]發(fā)明的詳細(xì)描述
[0047]本文中證明了經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)(具體來(lái)說(shuō)，丙二醛/乙醛加合物(MAA加合物))與冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)相關(guān)，且更普遍地相信其與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展相關(guān)。不受具體理論的束縛，據(jù)信MAA加合物通過(guò)至少兩種機(jī)制在氧化壓力下形成。在圖1中以示意圖模式闡述的一種機(jī)制中，丙二醛(MDA)處于高濃度。一些丙二醛降解形成乙醛(AA)。兩個(gè)分子結(jié)合到可能可接近的蛋白質(zhì)基質(zhì)(例如，LDL)上的氨基上，且一個(gè)分子的乙醛“粘緊”形成的產(chǎn)物。在圖2中以示意圖模式闡述的第二種機(jī)制中，一個(gè)分子的MDA結(jié)合到蛋白質(zhì)基質(zhì)(在圖中闡述為N-乙酰賴(lài)氨酸)的氨基上，形成Na-乙酰-N1-(2-丙烯醛)賴(lài)氨酸(a)。(a)中的兩分子的產(chǎn)物通過(guò)分子(b)的經(jīng)MDA修飾的末端結(jié)合，形成Na-乙酰-N1-賴(lài)胺酰-3，5- 二甲酰-2，6-二氫吡啶-4-基-吡啶衍生物。縮合反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致MAA加合物(c)形成，在這種情形下，為Na-乙酰-N1-賴(lài)氨酰-4-甲基-2，6- 二氫吡啶_3，5- 二甲醛衍生物。
[0048]被氧化的蛋白質(zhì)涉及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展的進(jìn)展。丙二醛/乙醛(MAA)修飾的LDL為高度氧化的，且在用丙二醛修飾蛋白質(zhì)后形成了優(yōu)勢(shì)表位。[0049]MAA修飾的蛋白質(zhì)還可與內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的清道夫受體結(jié)合，并提升前炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而看起來(lái)涉及動(dòng)脈粥樣硬化，且具體來(lái)說(shuō)，斑塊形成的進(jìn)展。
[0050]重要的是，MAA修飾看起來(lái)可引起與抗體制造的免疫反應(yīng)，其中的抗體制造，如本文中所描述，還與疾病(例如，動(dòng)脈粥樣硬化，更具體來(lái)說(shuō)，心臟動(dòng)脈疾病)的進(jìn)展和惡化相關(guān)。MAA修飾和/或抗體制造通過(guò)其使疾病惡化的機(jī)制還未完全理解。然而，經(jīng)MAA修飾的蛋白質(zhì)的抗體的存在不僅詳細(xì)說(shuō)明了 CAD的存在，還詳細(xì)說(shuō)明了 CAD進(jìn)展的性質(zhì)。
[0051]具體來(lái)說(shuō)，抗MAA加合物抗體滴定提供了心臟動(dòng)脈疾病的嚴(yán)重性/風(fēng)險(xiǎn)的測(cè)量是一個(gè)令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，其中抗MAA加合物抗體的增加的水平指示斑塊負(fù)荷和/或斑塊嚴(yán)重性的增加的水平。
[0052]不受具體理論束縛，據(jù)信在動(dòng)脈粥樣硬化和心臟動(dòng)脈疾病的進(jìn)展中，建立了炎癥位點(diǎn)，其中被氧化的蛋白質(zhì)和LDL結(jié)合、內(nèi)在化和起始前炎癥反應(yīng)。一些oxLDL和經(jīng)MAA修飾的蛋白質(zhì)被從該位點(diǎn)釋放，并遷移到免疫系統(tǒng)來(lái)以負(fù)荷依賴(lài)性方法啟動(dòng)免疫反應(yīng)。起始了與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展以及其進(jìn)展相關(guān)的抗體。MAA的抗體越多，斑塊不穩(wěn)定的幾率越大。隨著oxLDL和加合的蛋白質(zhì)積聚，更多的炎癥細(xì)胞滲入且斑塊增長(zhǎng)，引起心絞痛。最終，炎癥變得具有壓倒性，造成纖維斑塊帽變薄(由于細(xì)胞因子和免疫反應(yīng))，且由于漏膜和對(duì)泄露的經(jīng)修飾的大分子的響應(yīng)，抗體濃度增加。最終斑塊破裂導(dǎo)致大量的oxLDL和與循環(huán)性抗體結(jié)合的經(jīng)MAA修飾的蛋白質(zhì)的釋放，引起減少的抗體濃度。
[0053]抗MAA加合物抗體同種型可提供另外的診斷/預(yù)后信息為另一令人吃驚的發(fā)現(xiàn)。具體來(lái)說(shuō)，抗體的同種型模式可區(qū)分動(dòng)脈粥樣硬化病變性質(zhì)并允許鑒定以下的患者:1)預(yù)期具有急性心肌梗死或心臟病發(fā)作(高IgG、低IgA)，和2)以穩(wěn)定型進(jìn)展而不會(huì)心臟病發(fā)作(低 IgG、高 IgA) ο
[0054]不受具體理論束縛，據(jù)信在被氧化的蛋白質(zhì)和LDL結(jié)合、內(nèi)在化和起始如上所述的前炎癥反應(yīng)的位點(diǎn)建立炎癥。一些oxLDL和經(jīng)MAA修飾的蛋白質(zhì)被從該位點(diǎn)釋放，并遷移到免疫系統(tǒng)來(lái)以負(fù)荷依賴(lài)性方法啟動(dòng)免疫反應(yīng)，引起IgM抗體的產(chǎn)生。隨著oxLDL和加合的蛋白質(zhì)積聚，更多的炎癥細(xì)胞滲入且斑塊增長(zhǎng)，造成心絞痛。最終，炎癥變得具有壓倒性，IgM抗體被類(lèi)別轉(zhuǎn)換為更具治病性的IgG抗體，其有助于纖維斑塊帽的變薄(由于細(xì)胞因子和免疫反應(yīng))，且由于漏膜和對(duì)泄露的經(jīng)修飾的大分子的增加的水平做出的響應(yīng)，抗體濃度增加。最終斑塊破裂造成大量的oxLDL和經(jīng)MAA修飾的蛋白質(zhì)的釋放和急性心肌梗死。
[0055]作為選擇，在患有穩(wěn)定性CAD的患者體內(nèi)，oxLDL和加合的蛋白質(zhì)在帽的外膜邊上(不在脈管系統(tǒng)的內(nèi)腔內(nèi))積聚，且炎癥反應(yīng)得到減少。釋放的細(xì)胞因子引起IgA響應(yīng)，其具有更少的致病性，且纖維斑塊帽保持完整，引起穩(wěn)定性CAD。
[0056]因此，個(gè)體中抗MAA加合物抗體的抗體同種型的分析提供了病理的嚴(yán)重性/預(yù)后的指示。
[0057]另外，因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化代表了病理的漸進(jìn)性連續(xù)統(tǒng)，據(jù)信抗MAA加合物抗體更普遍地可提供動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程和心血管疾病的嚴(yán)重性/進(jìn)展的指示。
[0058]預(yù)測(cè)CAD的存在和進(jìn)展的性質(zhì)(例如，穩(wěn)定對(duì)不穩(wěn)定)的能力允許在疾病的典型臨床表現(xiàn)(例如，心肌梗死)前鑒定患者。這一洞察允許鑒定需要用藥物諸如膽固醇降低藥物(例如他汀類(lèi))、非侵害性心臟壓力檢查(例如，核研究、壓力超聲波心動(dòng)圖、CTA、MRA)和/或侵害性心臟檢查(例如，心臟導(dǎo)管插入)治療的患者。使用該工具，在疾病過(guò)程的更早的時(shí)間點(diǎn)確定存在CAD的發(fā)展和/或進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的患者是可能的。掌握該知識(shí)，可以將患者挑選用于治療，其中的治療對(duì)阻止進(jìn)展具有恰當(dāng)?shù)那趾π?，并阻止或延遲心臟病發(fā)作和冠心病的相關(guān)的發(fā)病和死亡?？傊?，更恰當(dāng)改善的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和治療策略有望不僅能允許恰當(dāng)?shù)母绲闹委?，還可減少其他的非侵害性和侵害性測(cè)試的利用和過(guò)度利用。
[0059]診斷/預(yù)后分析
[0060]因此，在某些實(shí)施方案中，提供了使用抗MAA加合物抗體的檢測(cè)/定量的分析，用于鑒定哺乳動(dòng)物具有提高的不利心血管事件風(fēng)險(xiǎn)和/或確定哺乳動(dòng)物的預(yù)后。該方法通常包括確定與來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，抗MAA加合物的抗體提高的水平指示哺乳動(dòng)物具有一個(gè)或多個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。在某些實(shí)施方案中，測(cè)定了抗MAA加合物抗體的總水平，且較高的抗體水平指示較大的斑塊負(fù)荷和/或相關(guān)的心絞痛和/或較大的不穩(wěn)定斑塊的風(fēng)險(xiǎn)，因此以及不利心血管事件(例如，心肌梗死、心臟局部缺血等)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0061]在某些實(shí)施方案中，鑒定了不同的抗MAA加合物抗體同種型的水平。在此類(lèi)情況下，增加的總抗體滴定量指示較大的疾病嚴(yán)重性，如以上所解釋。然而，從IgM到IgG的抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換(例如，如由IgG對(duì)IgM抗體的增加所證明)指示不穩(wěn)定斑塊的增加的風(fēng)險(xiǎn)。然而，高IgG和低IgA指示個(gè)體預(yù)期患有急性心肌梗死或心臟病發(fā)作，而低IgG和高IgA指示斑塊形成可能以穩(wěn)定型取得進(jìn)展，而不會(huì)心臟病發(fā)作。
[0062]還可以將這些方法用來(lái)監(jiān)測(cè)個(gè)體中疾病進(jìn)展和/或用來(lái)評(píng)估治療方案。此類(lèi)方法可以包括:確定與來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定；和將抗MAA加合物抗體的水平與在先前的時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的所述哺乳動(dòng)物的水平比較，其中相比先前的測(cè)定，與生物樣品中的MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平的增加指示所述哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊已經(jīng)惡化；且相比先前的測(cè)定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平的減少指示哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊得到減少。如本文中所述，減少的抗體水平可以指示急性心血管事件(例如，斑塊破裂)，其可以引起經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的釋放，從而以及抗體水平的減少。當(dāng)與指示組織損害的其他的生物標(biāo)志物(例如，提聞的肌I丐蛋白1、CPK、LDL或AST)有關(guān)系時(shí)，可以通過(guò)考慮差別診斷中的其他的因子區(qū)別結(jié)果。
[0063]再次地，在某些實(shí)施方案中，鑒定了不同抗MAA加合物抗體同種型的水平。在此類(lèi)情況下，從IgM到IgG的抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換(例如，如由IgG對(duì)IgM抗體的增加所證明)指示增加的風(fēng)險(xiǎn)，而IgG對(duì)IgM的減少可以指示個(gè)體在改善。類(lèi)似地，IgG的增加和/或IgA的減少可以指示個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)在增加，而IgG的減少和/或IgA的增加可以指示個(gè)體以更穩(wěn)定的方式在取得進(jìn)展。
[0064]在抗MAA加合物抗體的第一和第二測(cè)量之間治療個(gè)體時(shí)，如上所述的抗體水平的變化提供了治療功效的測(cè)量。如果治療顯示具有很少功效的效果，則可以實(shí)施不同的治療方案(例如，更為積極的治療方案)。
[0065]在某些實(shí)施方案中，可以將本文中描述的診斷/預(yù)后方法整合到治療方法中。例如，在某些實(shí)施方案中，該方法可以包括接受與來(lái)自哺乳動(dòng)物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平的測(cè)量，其中相比常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，抗體的提高的水平指示哺乳動(dòng)物具有一個(gè)或多個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；且當(dāng)抗體顯示提高的水平時(shí)，需提供或?qū)е屡c動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的補(bǔ)充測(cè)試被提供和/或需提供或?qū)е屡c動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的補(bǔ)充治療被提供給哺乳動(dòng)物。
[0066]再次地，在某些實(shí)施方案中，鑒定了不同抗MAA加合物抗體同種型的水平。在此類(lèi)情況下，從IgM到IgG的抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換(例如，如由IgG對(duì)IgM抗體的增加所證明)指示增加的風(fēng)險(xiǎn)，且可能需要補(bǔ)充測(cè)試和/或更積極的治療方案，而IgG對(duì)IgM的減少可以指示個(gè)體在改善，且可保證更少積極性的治療方案或應(yīng)當(dāng)維持已存在的治療方案。類(lèi)似地，IgG的增加和/或IgA的減少可是指示個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)在增加，需保證更多的測(cè)試和/或更具積極性的治療，而IgG的減少和/或IgA的增加可以指示個(gè)體在以更穩(wěn)定的方式取得進(jìn)展，且可能可以簡(jiǎn)單地維持已存在的治療方案或可以減少治療。
[0067]如上面所指出，本文中描述的不同分析的陽(yáng)性結(jié)果可以提供潛在的病理(例如，動(dòng)脈粥樣硬化/心血管疾病)的存在、嚴(yán)重性或增加的嚴(yán)重性的指示。在某些實(shí)施方案中，陽(yáng)性結(jié)果的存在可以指示/保證進(jìn)一步的測(cè)試。補(bǔ)充測(cè)試可以包括，但不限于選自以下的一種或多種測(cè)試:HDL/LDL比、總膽固醇、甘油三酯水平、脂蛋白相關(guān)的磷脂酶A2 (LpPLA2)、同型半胱氨酸、C-反應(yīng)性蛋白質(zhì)(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白(HDL)、TNF a、HSP60、肌鈣蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)和肌紅蛋白、壓力測(cè)試(例如，運(yùn)動(dòng)耐量測(cè)試、核壓力測(cè)試、壓力超聲波心動(dòng)圖等)、影像學(xué)研究(例如，心臟NMR、血管造影等)等。
[0068]如上面所指出，本文中描述的不同分析的陽(yáng)性結(jié)果可以提供潛在的病理(例如，動(dòng)脈粥樣硬化/心血管疾病)的存在、嚴(yán)重性或增加的嚴(yán)重性的指示。在某些實(shí)施方案中，陽(yáng)性結(jié)果的存在可以進(jìn)一步指示/保證治療方案的改變、實(shí)施或增加。在某些實(shí)施方案中，治療方案可以包括:行為矯正(例如，改變飲食和運(yùn)動(dòng))、給予一種或多種藥物(例如，選自以下的一種或多種藥劑:他汀類(lèi)、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、鈣通道阻滯劑、雷諾嗪等)，和/或一種或多種程序(例如，血管成形術(shù)、支架植入、冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)、血管移植等)。
[0069]所上面所指出，在多個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量對(duì)MAA蛋白質(zhì)加合物起反應(yīng)的抗體(例如，抗MAA加合物IgG、IgM、IgA等)，來(lái)提供個(gè)體中斑塊形成的存在和/或嚴(yán)重性和/或此類(lèi)斑塊的預(yù)后的指示。在某些實(shí)施方案中，參照正常健康的個(gè)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的可比較的抗體水平評(píng)估了抗體水平。在某些實(shí)施方案中，參照在先前的時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的個(gè)體中抗體水平評(píng)估了抗體水平。
[0070]在任何給定的群體中，具有對(duì)MAA加合物的反應(yīng)性的抗體的水平可能存在差異。在某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)參考較廣的群體中觀察的范圍，將測(cè)得的任何給定個(gè)體的具有對(duì)MAA加合物偶聯(lián)物的反應(yīng)性的抗體的水平歸類(lèi)為高或低。例如，可以將參照較廣種群測(cè)得的此類(lèi)抗體的低于特定百分位值的水平歸類(lèi)為低水平。在某些實(shí)施方案中，低水平可能對(duì)應(yīng)于低于第25百分位數(shù)，或低于第20、第10或第5百分位數(shù)的值。在某些實(shí)施方案中，高水平可能對(duì)應(yīng)于，例如超過(guò)第5、第10、第20或第25百分位數(shù)的值。
[0071]顯然，本發(fā)明提供的診斷和預(yù)后方法需要一定程度的定量來(lái)確定診斷性抗MAA加合物抗體的量或病理的預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，可以通過(guò)包含恰當(dāng)?shù)膮⒖紭悠吩诒疚拿枋龅姆治鲋写_定此類(lèi)定量，其中所述參考樣品為合成樣品(例如，通過(guò)提供溶于緩沖液中的已知量的抗MAA加合物抗體)，和/或來(lái)源于健康的或正常的個(gè)體。[0072]在一個(gè)實(shí)施方案中，參考樣品包括來(lái)源于個(gè)體沒(méi)有經(jīng)歷或顯現(xiàn)任何臨床癥狀和/或風(fēng)險(xiǎn)因子時(shí)的相同個(gè)體的生物樣品(例如血漿、血清、全血、痰、唾液等)。在另一實(shí)施方案中，參考樣品包括來(lái)源于正常健康的個(gè)體的生物樣品。
[0073]因此，對(duì)參考樣品和測(cè)試(例如，患者)樣品處理、分析或化驗(yàn)，并比較獲得的參考樣品和測(cè)試樣品的數(shù)據(jù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在同一時(shí)間對(duì)參考樣品和測(cè)試樣品加工、分析或化驗(yàn)。在另一實(shí)施方案中，在不同時(shí)間參考樣品和測(cè)試樣品加工、分析或化驗(yàn)。
[0074]作為選擇，或此外，將測(cè)試樣品的數(shù)據(jù)與參考樣品的來(lái)源于先前產(chǎn)生的已確定的數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)比較。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，參考樣品包括先前使用標(biāo)準(zhǔn)分析方案確定的值或范圍(例如，確定的群體或特定亞群體(例如，根據(jù)種族、性別、年齡等挑選的)的)。隨后將來(lái)源于加工、分析或化驗(yàn)測(cè)試樣品的數(shù)據(jù)與獲得的樣品群體的數(shù)據(jù)比較。
[0075]來(lái)源于足夠多的參考樣品以便能代表群體(或亞群體)的數(shù)據(jù)允許產(chǎn)生可測(cè)定特定參數(shù)的平均水平的數(shù)據(jù)集。因此，可以測(cè)定個(gè)體的任何群體和來(lái)源于所述個(gè)體的任何樣品的斑塊存在、穩(wěn)定斑塊的形成、不穩(wěn)定斑塊的形成等的抗MAA抗體診斷或預(yù)后的量，用于隨后的與測(cè)定的被分析樣品的表達(dá)產(chǎn)物的水平的比較。
[0076]應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本文中描述的分析的陽(yáng)性或陰性結(jié)果不是病理狀態(tài)(例如，不穩(wěn)定斑塊)的特定存在或不存在的決定因素，而通常被用于其他診斷標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)境中來(lái)幫助缺血性心血管疾病的發(fā)展或進(jìn)展的增加的風(fēng)險(xiǎn)的診斷或預(yù)后。此類(lèi)其他的診斷標(biāo)準(zhǔn)包括，例如，但不限于:個(gè)體病史、疾病家族風(fēng)險(xiǎn)、生活方式、體重/肥胖/BM1、其他分析的結(jié)果，如血壓，HDL/LDL比、總膽固醇、甘油三酯水平、脂蛋白相關(guān)的磷脂酶A2(LpPLA2)、同型半胱氨酸、C反應(yīng)性蛋白質(zhì)(CRP)、HSP70、高密度脂蛋白(HDL)、TNFa、HSP60、壓力測(cè)試、影像學(xué)研究等。臨床醫(yī)師還可以考慮其他的因素以達(dá)到診斷或預(yù)后。在某些實(shí)施方案中，本文中描述的分析的陽(yáng)性結(jié)果可以指導(dǎo)處方醫(yī)師制定其他的測(cè)試或程序。
[0077]如果個(gè)體被認(rèn)為具有發(fā)展缺血性心血管疾病(例如，心肌梗死)的增加的風(fēng)險(xiǎn)，則可以推薦采取預(yù)防性治療和/或生活方式改變。如果個(gè)體被診斷為患有漸進(jìn)性缺血性心血管疾病，他或她的臨床醫(yī)師可以建議采取適合該個(gè)體的治療和/或生活方式改變。
[0078]生物樣品中的抗MAA加合物抗體的檢測(cè)/定暈。
[0079]如上所述，個(gè)體(例如，人或非人的哺乳動(dòng)物)中抗MAA抗體的水平可提供量/嚴(yán)重性和/或個(gè)體中斑塊形成和/或此類(lèi)斑塊的預(yù)后的指示。不同類(lèi)型的抗體的水平可提供不利心血管事件(例如，心肌梗死、心肌局部缺血等)的風(fēng)險(xiǎn)的指示。因此，例如，高抗MAA加合物IgG和低抗MAA加合物IgA指示個(gè)體預(yù)期具有急性心肌梗死或心臟病發(fā)作，而高抗MAA加合物IgA、低IgG指示個(gè)體其體內(nèi)的斑塊形成更可能以穩(wěn)定型進(jìn)展而不會(huì)有心臟病發(fā)作。
[0080]可以以多種形式中的任何一種進(jìn)行檢測(cè)來(lái)自個(gè)體的樣品中抗MAA加合物抗體的分析方法。在某些實(shí)施方案中，可以使用免疫分析評(píng)估個(gè)體的抗體水平，例如，對(duì)MAA加合物具有反應(yīng)性的IgM、IgG或IgA抗體。免疫分析形式優(yōu)選為,例如,選自以下的:免疫印跡、免疫印跡、斑點(diǎn)雜交、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析。利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、生物傳感技術(shù)、衰減光導(dǎo)纖維技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片工藝等的改進(jìn)的免疫分析也是有用的。優(yōu)選地，分析為半定量分析或定量分析。
[0081]合適的免疫分析的實(shí)例被描述如下，且考慮到本文中提供的教義，其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)。關(guān)于免疫分析的一般性綜述，見(jiàn)Cell Biology Volume37:Antibodiesin Cell Biology, Asai, ed.Academic Press, Inc.New York(1993) ；Basic and ClinicalImmunology7th Edition, Stites&Terr, eds.(1991)中的方法，其通過(guò)完整引用被并入。
[0082]在多個(gè)實(shí)施方案中，分析可以包括分析對(duì)MAA蛋白質(zhì)偶聯(lián)物具有反應(yīng)性的所有抗體，或僅僅分析特定同種型的抗體，如IgM、IgG或IgA，或分析兩種或更多種抗體同種型的組合物。在某些實(shí)施方案中，至少測(cè)定了 IgG和/或IgM的水平。
[0083]免疫分析可以為競(jìng)爭(zhēng)性的或非競(jìng)爭(zhēng)性的。在典型的競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析中，樣品中的抗體與有標(biāo)記的抗體競(jìng)爭(zhēng)來(lái)與MAA蛋白質(zhì)加合物結(jié)合。隨后測(cè)量結(jié)合在MAA蛋白質(zhì)偶聯(lián)物上的有標(biāo)記的抗體的量。樣品中的內(nèi)源性抗MAA加合物抗體的濃度和檢測(cè)到的有標(biāo)記的抗體的量之間存在相反關(guān)系。
[0084]在非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析中，將樣品中的抗體結(jié)合在PAF偶聯(lián)物上，隨后將有標(biāo)記的檢測(cè)試劑，通常為抗免疫球蛋白抗體，結(jié)合在抗體上。隨后測(cè)量結(jié)合在抗體上的有標(biāo)記的檢測(cè)試劑的量。與競(jìng)爭(zhēng)型方法不同，非競(jìng)爭(zhēng)性方法的結(jié)果直接與抗體的濃度成比例。
[0085]在非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析或免疫印跡中，將有標(biāo)記的檢測(cè)試劑，通常為抗免疫球蛋白抗體，用來(lái)檢測(cè)結(jié)合在MAA蛋白質(zhì)加合物上的抗體(例如，抗MAA加合物抗體)。選擇了物種的特異性結(jié)合到免疫球蛋白上的合適的抗免疫球蛋白抗體，其中樣品從該物種中獲得。在某些實(shí)施方案中，其可以結(jié)合到那一物種的所有的免疫球蛋白同種型上，或僅僅結(jié)合到同種型的一個(gè)亞集上。例如，其可以?xún)H結(jié)合到IgA、IgD、IgE、IgG或IgM上，或這些同種型的兩種或更多種的組合上。在某些實(shí)施方案中，抗免疫球蛋白抗體可以?xún)H特異性結(jié)合到任何給定的同種型的某些亞型上。人IgA的亞型包括IgAl和IgA2。在某些實(shí)施方案中，抗免疫球蛋白抗體可以結(jié)合到這些亞型的一種或兩種上。人IgG的亞型包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在某些實(shí)施方案中，抗免疫球蛋白可以結(jié)合到這些人IgG亞型的一種或多種上。應(yīng)當(dāng)理解不同的脊椎動(dòng)物物種存在不同的同種型和亞型。
[0086]在放射免疫分析中，用諸如131I或125I的放射性同位素標(biāo)記了抗體或檢測(cè)試劑。在酶免疫分析中，用酶標(biāo)記了抗體或檢測(cè)試劑。在某些實(shí)施方案中，使用顯色底物能檢測(cè)出合適的酶。顯色底物為這樣的物質(zhì)，由于與酶的反應(yīng)，其可產(chǎn)生有色產(chǎn)物，從而能用分光光度計(jì)檢測(cè)。廣泛采用了來(lái)自大腸桿菌(E.coli)的諸如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β_半乳糖苷酶和焦磷酸酶的酶。還可以使用基于諸如熒光素酶的酶的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)。其他的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記，如Alexa系列的熒光團(tuán)、量子點(diǎn)、電子自旋標(biāo)記物、磁性標(biāo)記等。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)常使用抗體或檢測(cè)試劑與生物素的結(jié)合，因?yàn)檫@可以通過(guò)其與酶或熒光團(tuán)連接的親和素或鏈霉親和素的反應(yīng)被容易地檢測(cè)到，其中其可與親和素或鏈霉親和素以很大的特異性和親和力結(jié)合。作為選擇，在某些實(shí)施方案中，將抗體/檢測(cè)試劑與結(jié)合檢測(cè)試劑連接的生物素的鏈霉親和素或親和素結(jié)合在一起。
[0087]在一個(gè)示例性的和典型的非競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫分析中，放置將要分析的樣品(例如，血清)，用吸附在(或化學(xué)連接到)固體(或大體上為固體)基質(zhì)上的MAA蛋白質(zhì)加合物(例如，MAA/白蛋白加合物)與其接觸并對(duì)其孵育。因此可能存在于樣品中的任何抗MAA加合物抗體被貼附在固體基質(zhì)上的MAA加合物特異性結(jié)合，制造出MAA加合物/抗MAA加合物抗體復(fù)合物。隨后將樣品從固體基質(zhì)上分離，以便清除為結(jié)合的物質(zhì)，例如，通過(guò)洗脫。將能結(jié)合以MAA加合物/抗MAA加合物抗體復(fù)合物形式存在于基質(zhì)上的抗MAA加合物抗體的指示劑抗體加入到固定基質(zhì)上，從而制造出MAA加合物/抗MAA加合物抗體/指示劑抗體復(fù)合物。指示劑抗體可以，例如，為在非人的動(dòng)物物種內(nèi)培養(yǎng)出的抗人IgG免疫球蛋白(或抗人IgM免疫球蛋白，或抗人IgA免疫球蛋白等)。最后，檢測(cè)和/或定量了固體基質(zhì)上MAA加合物/抗MAA加合物抗體/指示劑抗體復(fù)合物的存在，其中固體基質(zhì)上所述復(fù)合物的存在指示樣品中的抗MAA蛋白質(zhì)加合物抗體的存在，且所述復(fù)合物的量指示樣品中的抗MAA蛋白質(zhì)加合物抗體的量。
[0088]在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選獲得與MAA加合物結(jié)合的抗體的定量評(píng)估。在典型的非競(jìng)爭(zhēng)性分析中，假定測(cè)得的變量，不論其為光密度或?yàn)橐恍┢渌淖x出，與抗體濃度間存在線性關(guān)系。例如，如果分析中樣品A使樣品B的光密度加倍(已經(jīng)從兩者中減去了背景)，則假定相比B，A中的抗體濃度加倍。然而，優(yōu)選構(gòu)建陽(yáng)性樣品(例如，血清樣品)的連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在某些實(shí)施方案中，在與測(cè)試樣品相同的時(shí)間分析此類(lèi)稀釋。通過(guò)這樣做，可以將在測(cè)定樣品中的抗體的量中產(chǎn)生的來(lái)自線性關(guān)系的任何變化都考慮在內(nèi)。
[0089]在某些實(shí)施方案中，固體基質(zhì)為微量滴定盤(pán)，例如，通常用于進(jìn)行ELISA免疫測(cè)定的類(lèi)型。在某些實(shí)施方案中，微量滴定盤(pán)優(yōu)選為聚苯乙烯盤(pán)。有用的固相支持體還包括，但不限于:天然聚合性糖類(lèi)和它們的經(jīng)合成性修改、交叉連接或替換的衍生物，如瓊脂、瓊脂糖、交聯(lián)海藻酸、替換的和交聯(lián)的瓜爾豆膠、纖維素酯，尤其是硝酸和羧酸的纖維素酯、混合性纖維素酯和纖維素醚；含氮的天然聚合物，如蛋白質(zhì)和衍生物，包括交聯(lián)的或修飾的明膠；天然碳水化合物聚合物，如乳膠和橡膠；合成聚合物，如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯和其部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、以上縮聚物的共聚物和三元共聚物，如多元酯、聚酰胺和其他的聚合物，如聚氨酯或聚環(huán)氧化合物；無(wú)機(jī)材料，如堿土金屬和鎂的硫酸鹽或碳酸鹽，包括硫酸鋇、硫酸鈣、碳酸鈣、堿土金屬、鋁和鎂的硅酸鹽；以及鋁或硅氧化物或水合物，如粘土、氧化鋁、滑石、高嶺土、沸石、硅膠或玻璃(可以將這些材料與上述聚合材料一起用作過(guò)濾器)；以及以上類(lèi)型的混合物或共聚物，如通過(guò)在先已存在的天然聚合物上引發(fā)合成聚合物的聚合獲得的接枝共聚物?？梢砸院线m的形狀使用所有的這些材料，如薄膜、薄片、管狀、微?；虮P(pán)狀，或者可以將它們鍍?cè)?、結(jié)合到或?qū)訅旱胶线m的惰性載體上，如紙、玻璃、塑料膜、纖維等。
[0090]良好適合直流分析裝置的示例性的固相材料包括，但不限于濾紙，如多孔玻璃纖維材料或其他的纖維基質(zhì)材料。此類(lèi)材料的厚度不是決定性的且是選擇的關(guān)鍵，這很大程度上取決于接受分析的樣品或分析物的性質(zhì)，如生物樣品的流動(dòng)性。
[0091]在某些實(shí)施方案中，固相可以構(gòu)成微粒(或納米粒子)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從任何合適類(lèi)型的微粒材料中挑選在本文中描述的方法中有用的合適的微粒，且這些微粒包括，但不限于:由聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯、乳膠、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯或類(lèi)似的材料組成的微粒。此外,微粒可以為有磁性的或順磁性的微粒，以便促進(jìn)磁場(chǎng)內(nèi)的微粒操作。
[0092]可以將微粒懸浮在可溶試劑和生物樣品的混合物中，或者可以通過(guò)支架材料對(duì)其保存和固定。在后者中，支撐材料上或內(nèi)的微粒通?；騼?yōu)選不能大幅移動(dòng)位置到支撐材料內(nèi)的其他地方。作為選擇，可以通過(guò)沉淀或離心從可溶試劑和生物樣品的混合物中的懸浮物中分離微粒。當(dāng)微粒為有磁性的或順磁性的時(shí),可以通過(guò)磁場(chǎng)從可溶試劑和生物樣品的緩和物中的懸浮物中分離微粒。[0093]可以調(diào)整本發(fā)明的方法用于可利用包括自動(dòng)化的和半自動(dòng)化的系統(tǒng)的微粒技術(shù)的體統(tǒng)，其中固相包括微粒。此類(lèi)系統(tǒng)包括第425651號(hào)待定美國(guó)申請(qǐng)和第5089424號(hào)美國(guó)專(zhuān)利以及第5006309號(hào)美國(guó)專(zhuān)利中描述的系統(tǒng)，其中第425651號(hào)待定美國(guó)申請(qǐng)和第5089424號(hào)美國(guó)專(zhuān)利分別對(duì)應(yīng)于已公開(kāi)的第EP0425633號(hào)和第EP0424634號(hào)EPO申請(qǐng)。
[0094]因此，例如，應(yīng)當(dāng)理解還可以在流體相中進(jìn)行上述的示例性分析?？梢砸员贿B接到與懸浮物中的樣品接觸的微?；蚣{米粒子上的形式提供MAA蛋白質(zhì)加合物。存在于樣品中的抗MAA加合物抗體可與微粒上的MAA蛋白質(zhì)加合物結(jié)合，在微粒表面上形成MAA加合物/抗MAA加合物抗體復(fù)合物。隨后將該復(fù)合物與能結(jié)合存在于MAA加合物/抗MAA加合物抗體復(fù)合物中的抗MAA加合物抗體的指示劑抗體接觸，從而產(chǎn)生連接在微粒上的MAA加合物/抗MAA加合物抗體/指示劑抗體復(fù)合物。隨后可以使用，例如細(xì)胞分選儀或磁性分離系統(tǒng)，分離微粒和檢測(cè)/定量標(biāo)記。
[0095]在某些實(shí)施方案中，固體基質(zhì)可以包含一個(gè)或多個(gè)電極?？梢詫AA蛋白質(zhì)加合物(捕獲劑)直接或間接地粘附到電極上。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，可以將MAA蛋白質(zhì)加合物粘附到有磁性的或順磁性的微粒上，隨后使用磁鐵將微粒放置在電極表面附近。其中一種或多種電極充當(dāng)固相的系統(tǒng)在檢測(cè)基于電化學(xué)相互作用的情況下是有用的。描述了該類(lèi)型的示例性系統(tǒng)，例如，在第6887714號(hào)美國(guó)專(zhuān)利中。以下關(guān)于電化學(xué)檢測(cè)進(jìn)一步描述了基本方法。
[0096]如上面所指出，在多個(gè)實(shí)施方案中，可以通過(guò)多種方法中的任何一種將MAA-蛋白質(zhì)加合物連接到固相支持體上(例如ELSA孔、微粒、測(cè)試條等)。連接可以為簡(jiǎn)單的吸附、離子鍵或共價(jià)交聯(lián)(直接地或通過(guò)連接物)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，通過(guò)在緩沖液中使用固體基質(zhì)孵育MAA加合物將MAA加合物吸附到固體基質(zhì)上。合適的緩沖液包括,但不限于碳酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖鹽水。通常，在MAA加合物吸附或共價(jià)連接到固體基質(zhì)上后，用阻滯劑孵育固體基質(zhì)來(lái)減少來(lái)自樣品的物質(zhì)到固體基質(zhì)的非特異性結(jié)合。合適的阻滯劑包括，但不限于牛血清白蛋白。
[0097]在某些實(shí)施方案中，改變了固體基質(zhì)的固有電荷來(lái)促進(jìn)MAA加合物的連接，和/或來(lái)增加抗體結(jié)合，和/或來(lái)增加可濕性等。在某些實(shí)施方案中，為了改變或增加固體基質(zhì)的固有電荷，可以將帶電的物質(zhì)直接涂層在基質(zhì)上。例如，可以采用用于使用帶負(fù)電荷的聚合物固定可固定反應(yīng)復(fù)合物的離子捕獲程序(描述于第0326100號(hào)EP專(zhuān)利公開(kāi)和第0406473號(hào)EP公開(kāi)中)來(lái)影響快速溶解相免疫化學(xué)反應(yīng)。在這些程序中，通過(guò)帶負(fù)電的聚陰離子/免疫復(fù)合物和先前處理過(guò)的、帶正電的基質(zhì)之間的離子相互作用從余下的反應(yīng)混合物中分離了可固定免疫復(fù)合物，并通過(guò)使用多種信號(hào)生成系統(tǒng)的任何一種，包括，例如，如第0273115號(hào)EPO公開(kāi)中所描述的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)該復(fù)合物。
[0098]如果固體基質(zhì)為硅或玻璃，經(jīng)常在連接捕獲劑(例如，MAA蛋白質(zhì)加合物)前活化表面?？梢詫⒅T如三乙氧基氨基丙基娃燒(可從Sigma Chemical C0., St.Louis, M0.獲得)、三乙氧基乙烯基娃燒(Aldrich Chemical C0., Milwaukee, ffis.)和(3_疏基-丙基)-三甲氧基娃燒(Sigma Chemical C0.，St.Louis, M0.)的活化的娃燒化合物分別用來(lái)引入諸如氨基、乙烯基和巰基的反應(yīng)基?？梢詫⒋祟?lèi)活化的表面用來(lái)直接連接捕獲物(在氨基或巰基的情形下)，或者可以將活化的表面進(jìn)一步與諸如戊二醛、二(琥珀酰亞基)辛二酸鹽、SPPD9琥珀酰亞基3-[2-吡啶基二硫]丙酸鹽)、SMCC (琥珀酰亞基-4-[N-馬來(lái)酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸鹽)、SIAB (琥珀酰亞基[4-碘代乙酰氨基]氨基苯甲酸酯)和SMPB (琥珀酰亞基-4-[1-馬來(lái)酰亞胺基苯基]丁酸鹽)的連接物反應(yīng)，來(lái)從表面分離捕獲劑?？梢詫⒁蚁┗趸瘉?lái)提供共價(jià)結(jié)合的方式。還可以將乙烯基用作諸如聚丙烯酸的不同的聚合物的聚合的錨定物，其可以為特定捕獲劑提供多個(gè)附著點(diǎn)?？梢詫被c不同分子量的被氧化的葡聚糖反應(yīng)來(lái)提供不同大小和能力的親水連接?？裳趸钠暇厶堑膶?shí)例包括:葡聚糖T-40(分子量40000道爾頓)、葡聚糖Τ-110 (分子量110000道爾頓)、葡聚糖Τ-500(分子量500000道爾頓)、葡聚糖Τ-2Μ(分子量2000000道爾頓)(所有這些都可從Pharmacia, Piscataway, N.J.獲得)或聚鹿糖(分子量 70000 道爾頓；可從 Sigma ChemicalC0.，St.Louis, M0.獲得)。因此，可以使用第5459080號(hào)、第5459078號(hào)美國(guó)專(zhuān)利等中描述的技術(shù)和化學(xué)品，將聚合電解質(zhì)相互作用用來(lái)將MAA蛋白質(zhì)加合物固定在固體基質(zhì)上。
[0099]影響固相的選擇的其他的考慮因素包括將有標(biāo)記的實(shí)體的非特異性結(jié)合降到最少的能力以及與采用的標(biāo)記系統(tǒng)的兼容性。例如，使用的帶有熒光標(biāo)記的固相應(yīng)當(dāng)具有足夠低的背景熒光來(lái)允許信號(hào)檢測(cè)。
[0100]在連接上特定的捕獲劑后，可以使用諸如血清、蛋白質(zhì)或其他的阻滯劑的材料進(jìn)一步處理固相支持體的表面來(lái)將非特異性結(jié)合降到最少。
[0101]MAA蛋白質(zhì)加合物
[0102]在多個(gè)實(shí)施方案中，MAA蛋白質(zhì)加合物被用來(lái)捕獲/結(jié)合存在于生物樣品中的抗MAA加合物抗體。產(chǎn)生MAA蛋白質(zhì)加合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且被描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利 5939535 和 Tuma et al.(1996) !fepatology, 23 (4): 872-880?；旧希胰┖捅?MDA)在蛋白質(zhì)(帶有氨基的基質(zhì))存在下一起反應(yīng)，來(lái)形成包含MDA和乙醛的雜種加合物的獨(dú)特的產(chǎn)物，其被指定為丙二醛、乙醛-加合物(MAA)。
[0103]如美國(guó)專(zhuān)利5939535中所描述，通過(guò)處理目標(biāo)蛋白質(zhì)(例如，白蛋白)可以容易地產(chǎn)生加合物，例如，以lmg/ml的濃度，在37°C下用ImM乙醛加ImM MDA處理3天。在對(duì)0.1M磷酸鹽緩沖液過(guò)夜透析(pH7.4和4°C )后，可以如期望的那樣進(jìn)一步處理溶液(例如，吸附或共價(jià)結(jié)合到ELISA孔、微粒等上)。
[0104]然而，取決于微粒的類(lèi)型的類(lèi)型，可能需要提高或降低AA和MDA的濃度來(lái)取得可使得MAA具有反應(yīng)性的相同量的熒光。
[0105]產(chǎn)生MAA蛋白質(zhì)加合物的方法是示例性的和非限制性的。使用本文中提供的教義，可以使用其他的方法容易地產(chǎn)生MAA加合物。
[0106]teiP,系統(tǒng)
[0107]適合用于本文中描述的分析中的檢測(cè)劑的可檢測(cè)標(biāo)記(例如，與抗MAA加合物抗體結(jié)合并形成抗MAA加合物/抗MAA加合物抗體復(fù)合物的抗體)包括可通過(guò)光譜學(xué)、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電的、光的或化學(xué)的方式檢測(cè)的任何組合物。有用的標(biāo)記包括，但不限于:磁珠(例如，DYNABEADS? )、熒光染料(例如，熒光素、德克薩斯紅、若丹明、綠色突光蛋白等，見(jiàn)，例如，Molecular Probes (分子探針),Eugene, Oregon, USA)、諸如口丫啶(例如，吖啶-9-甲酰胺)、菲啶、二氧雜環(huán)丁烷、魯米諾等的化學(xué)發(fā)光化合物、放射性標(biāo)記(例如，3H、1251、35S、14C或32P)、諸如酶(例如，辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β_半乳糖苷酶和ELISA中常使用的其他酶)的催化劑，以及測(cè)度標(biāo)記，如膠體金(例如，40-80nm直徑大小范圍、高效散布綠光的金顆粒)或有色玻璃或有色塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。教會(huì)使用此類(lèi)標(biāo)記的專(zhuān)利包括第3817837號(hào)、第3850752號(hào)、第3939350號(hào)、第3996345號(hào)、第4277437號(hào)、第4275149號(hào)和第4366241號(hào)美國(guó)專(zhuān)利。
[0108]可以在與生物樣品接觸之前、期間或之后，將標(biāo)記連接到檢測(cè)劑上。所謂的“直接標(biāo)記”為在用于分析前被直接連接或并入到檢測(cè)劑上的可檢測(cè)標(biāo)記(例如，抗IgG抗體、抗IgM抗體、抗IgA抗體等)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種方式中的任何一種將直接標(biāo)記連接到或并入到檢測(cè)劑上。
[0109]相反，所謂的“間接標(biāo)記”通常在分析期間的某一時(shí)刻結(jié)合到檢測(cè)劑上。通常，間接標(biāo)記在使用前結(jié)合到被連接到或并入到檢測(cè)劑上的部分上。因此，例如，在用于分析前可以將被用作檢測(cè)劑的抗體(“檢測(cè)抗體”)生物素化。在分析期間，親和素-偶聯(lián)的熒光團(tuán)可以結(jié)合具有生物素的檢測(cè)劑，來(lái)提供可被容易檢測(cè)到的標(biāo)記。
[0110]在間接標(biāo)記的另一實(shí)例中，還可以將能特異性結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)的多肽，如多肽A或多肽G用作檢測(cè)抗體的標(biāo)記。這些多肽為鏈球菌的細(xì)胞壁的正常成分。它們展現(xiàn)強(qiáng)的與來(lái)自多種物種的免疫球蛋白恒定區(qū)的非免疫原性反應(yīng)(見(jiàn)，一般是KronVal，etal.(1973)J.1mmunol., 111:1401-1406 和 Akerstrom(1985)J.1mmunol., 135:2589-2542)。因此,可以將此類(lèi)多肽標(biāo)記并加入到分析混合物中，其中它們結(jié)合到檢測(cè)抗體上，以及物種特異性抗體上，標(biāo)記二者并提供復(fù)合信號(hào)，這歸因于存在于樣品中的分析物和自抗體。
[0111]本文中描述的方法中有用的一些標(biāo)記需要使用指示劑來(lái)提供可檢測(cè)的信號(hào)。在ELISA中，例如，酶標(biāo)記(例如，半乳糖苷酶)可能需要加入基質(zhì)(例如，X-gal)來(lái)提供可檢測(cè)的信號(hào)。
[0112]示例性形式
[0113]化學(xué)發(fā)光性微粒免疫分析(CMIA)
[0114]在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明在化學(xué)發(fā)光性微粒分析(CMIA)中采用了化學(xué)發(fā)光性標(biāo)記。一般來(lái)說(shuō)，化學(xué)發(fā)光性微粒分析技術(shù)基于這一原理——當(dāng)通過(guò)引發(fā)試劑處理時(shí)，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記以特征波長(zhǎng)發(fā)光(即，化學(xué)發(fā)光)。
[0115]CMIA所必須的反應(yīng)物可以包括涂有被測(cè)量的分析物的特異性捕獲劑、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)劑和引發(fā)劑(例如，化學(xué)的或電化學(xué)的)的微粒。進(jìn)行CMIA的反應(yīng)順序可以包括:在反應(yīng)容器內(nèi)用樣品混合涂有分析物特異性捕獲劑的微粒來(lái)形成免疫復(fù)合物；清洗捕獲的免疫復(fù)合物來(lái)去除未結(jié)合的物質(zhì)；用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)劑混合捕獲的免疫復(fù)合物；清洗捕獲的免疫復(fù)合物——化學(xué)發(fā)光檢測(cè)劑；和用引發(fā)劑混合捕獲的免疫復(fù)合物——化學(xué)發(fā)光檢測(cè)劑來(lái)起始光發(fā)射。
[0116]CMIA中有用的化學(xué)發(fā)光體包括吖啶(例如吖啶-9-甲酰胺)、魯米諾、二氧雜環(huán)丁烷、釕絡(luò)合物和類(lèi)似的化學(xué)發(fā)光衍生物。CMIA中有用的微粒包括反磁性的、磁性的和順磁性的微粒?？缮藤?gòu)的可以用來(lái)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光性微粒分析的自動(dòng)化儀器的實(shí)例包括Architect1-Systems 和 Abbott Prism(都可從 Abbott Laboratories, Abbott Park, 111.獲得)。
[0117]電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)
[0118]在其他的實(shí)施方案中，使用電化學(xué)檢測(cè)進(jìn)行了免疫分析。Heineman和合作人已經(jīng)描述過(guò)了電化學(xué)檢測(cè)的基本程序。這需要:第一抗體(Ab，大鼠-抗小鼠IgG)的固定，隨后暴露到含有抗原(Ag，大鼠IgG)的一系列的溶液下，將第二抗體偶聯(lián)到酶標(biāo)記(AP-Ab，大鼠抗小鼠IgG和堿性磷酸酶)和對(duì)氨基苯磷酸鹽(PAPP)上。AP轉(zhuǎn)化PAPP為對(duì)氨基苯酚(PAPR，“R”試圖從氧化型，PAPO，醌亞胺中區(qū)別簡(jiǎn)化型)，ρΗ9.0下(此時(shí)AP展現(xiàn)最優(yōu)活力)，其在不干擾氧和水的還原的電位處為電化學(xué)可逆的。PAPR不會(huì)造成電極污染，這與苯酚不同，其中苯酚的前體一磷酸單苯酯常常被用作酶底物。盡管PAPR可經(jīng)歷空氣和光氧化，可容易地將這些氧化阻止在小規(guī)模和短時(shí)間框架內(nèi)。先前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)過(guò)在微電化學(xué)免疫分析中使用20 μ L至360 μ L體積的PAPP獲得的PAPR的皮摩爾檢測(cè)極限和IgG的毫微微克檢測(cè)極限。在使用電化學(xué)檢測(cè)的毛細(xì)管免疫分析中，現(xiàn)今為止報(bào)導(dǎo)的最低檢測(cè)極限為3000分子的小鼠IgG，其中使用了 70 μ L的體積和30分鐘或25分鐘的分析時(shí)間。
[0119]在一種示例性方法中，測(cè)試盒(類(lèi)似于Abbott Point of Care (1-STAT?)電化學(xué)免疫分析系統(tǒng))在裝配于硅片內(nèi)的電化學(xué)傳感器上提供了 MAA蛋白質(zhì)加合物。被放置在芯片上的另一位置的為抗體/堿性磷酸酶偶聯(lián)物(例如，偶聯(lián)到堿性磷酸酶上的抗IgG)。將生物樣品(例如，全血、血漿等)與傳感器接觸，允許酶偶聯(lián)物溶入到樣品中。樣品內(nèi)的抗MAA加合物抗體變得標(biāo)記有偶聯(lián)物，且通過(guò)將抗MAA加合物抗體結(jié)合到被固定的MAA加合物上，該復(fù)合物被捕獲到電化學(xué)傳感器的表面上。將樣品，以及過(guò)量的酶偶聯(lián)物從傳感器上洗脫掉。洗脫液內(nèi)為堿性磷酸酶的基質(zhì)。結(jié)合到抗體/抗原/抗體三明治上的酶切割基質(zhì)，釋放出可通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)產(chǎn)物。電化學(xué)(例如，安培的、伏安的等)傳感器可測(cè)量該酶產(chǎn)物，其與樣品中的抗MAA加合物抗體的濃度成比例。
[0120]該電化學(xué)檢測(cè)方案試圖為示例性的且不為限制性的。應(yīng)當(dāng)注意其他的電化學(xué)檢測(cè)方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，且不同的電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)被描述于，例如，第7045364號(hào)、第7045310號(hào)、第6887714號(hào)、第6682648號(hào)、第6670115號(hào)美國(guó)專(zhuān)利等。
[0121]橫向流分析
[0122]在某些實(shí)施方案中，將分析形式化為橫向流分析，也成為橫向流免疫層析分析。常常以測(cè)試條/量油尺形式產(chǎn)生這些分析。在橫向流分析中，測(cè)試樣品通過(guò)毛細(xì)管作用沿固體基質(zhì)流動(dòng)。在將樣品應(yīng)用到測(cè)試后，其遭遇與樣品混合并經(jīng)過(guò)基質(zhì)遭遇線或區(qū)域的有色試劑，其中的基質(zhì)遭遇線或區(qū)域已經(jīng)用(例如，用諸如MAA加合物的抗原)和/或檢測(cè)試劑(例如，有標(biāo)記的抗體)預(yù)處理過(guò)。取決于存在于樣品中的分析物，有色試劑可以在測(cè)試線或區(qū)域處成為結(jié)合狀態(tài)，且可以通過(guò)與參考值，或如本文中所述的電化學(xué)讀取的讀數(shù)，或使用，例如，讀取器光學(xué)讀取的讀數(shù)比較得到定量。橫向流測(cè)試可以運(yùn)作為競(jìng)爭(zhēng)性或三明治式分析。
[0123]微流體分析
[0124]在某些實(shí)施方案中，使用微流體裝置進(jìn)行了分析。微流體分析為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。在一種不例性方法中，可以使用與表面突光顯微鏡交界的冷卻的電荷稱(chēng)合器件(CCD)照相機(jī)檢測(cè)全-PDMS[聚(二甲基硅氧烷)]微流體裝置中的異質(zhì)性三明治式酶聯(lián)免疫分析(ELISA)的熒光反應(yīng)。已經(jīng)成功地將PDMS芯片微傳感器用來(lái)定量模式分析物(綿羊IgM)，其敏感性低至17nM。已經(jīng)將該混合集成技術(shù)擴(kuò)展至來(lái)自PDMS芯片中的生物化學(xué)免疫分析的光發(fā)射的芯片上成像和定量(見(jiàn)，例如，Eteshola and Balberg(2004)BiomedicalMicrodevices, 6(I):7-9 等)。
[0125]多路傳輸形式
[0126]在特定的實(shí)施方案中，例如，為對(duì)同時(shí)分析一個(gè)生物樣品的多種分析物(例如抗MAA IgG、IgM和IgA)有用，分析系統(tǒng)可以包含多種不同的檢測(cè)劑(例如，抗IgG、抗IgM、抗IgA等)，且在某些實(shí)施方案中，可以將這些不同的檢測(cè)劑至于不同的反應(yīng)位點(diǎn)(例如，ELISA盤(pán)中的不同的孔)。因此，可以將分析多路復(fù)用。在單個(gè)分析運(yùn)行期間，固相可以在表面上具有多個(gè)不同的區(qū)域，其中每個(gè)區(qū)域都具有粘附的具有特定特異性的抗體。
[0127]這還可以在溶液相中完成，其中用不同的標(biāo)記標(biāo)記了每種抗體血清型特異性的檢測(cè)試劑。反應(yīng)后可以使用，例如，細(xì)胞分選儀分離和/或定量這些試劑。
[0128]多路傳輸形式可以，但不必，采用多種標(biāo)記，其中每種標(biāo)記被用于特定分析物和/或那一分析物特異性的自抗體的檢測(cè)。例如，可以檢測(cè)多種分析物而不需使用多個(gè)標(biāo)記，其中在支持物上的不同位置(例如，在ELISA盤(pán)的不同孔中)使用了不同的檢測(cè)劑。因?yàn)槊總€(gè)位置處的檢測(cè)劑的特異性是已知的，特定位置處的信號(hào)的檢測(cè)可能與結(jié)合在那一位置處的特定抗MAA加合物抗體的存在相關(guān)。該形式的實(shí)例包括在沿著通道的不同的位置含有不同的標(biāo)記劑的微流體裝置。在某些實(shí)施方案中，不同的標(biāo)記試劑可能與不同的電極系統(tǒng)相關(guān)，其中可以將多個(gè)電極系統(tǒng)(例如，IgG檢測(cè)系統(tǒng)和IgA檢測(cè)系統(tǒng)和IgM檢測(cè)系統(tǒng))組裝在單個(gè)微芯片/微流體裝置中。
[0129]除了上述的不同的免疫分析(例如，直接ELISA、間接ELIAS等)，還可將其他的分析形式用來(lái)檢測(cè)抗MAA加合物抗體。此類(lèi)分析包括，但不限于:RIP分析、BIAcore分析、瞬逝場(chǎng)分析等。
[0130]RIP分析可測(cè)量結(jié)合到流體相中的同源抗原上的抗體。因此，可以用放射性標(biāo)記的MAA蛋白質(zhì)加合物和諸如蛋白質(zhì)A-瓊脂糖或蛋白質(zhì)G-瓊脂糖的沉淀劑檢測(cè)和定量抗MAA加合物抗體，其中的沉淀劑與抗體的Fe部分結(jié)合并通過(guò)離心被用來(lái)收集抗原-抗體復(fù)合物(Bendtzen et al.(2000)Mol.Biotechnol.14:251-261)。Prabhakar andMuhlfelder (1997)Clin.Nephrol.47:331-335 描述了典型 RIP 測(cè)試平臺(tái)的一個(gè)示例性實(shí)例，且該實(shí)例被用來(lái)檢測(cè)重組體EPO的人抗體。
[0131]BIAcore免疫分析使用表面等離子體共振來(lái)光學(xué)測(cè)量與固定在專(zhuān)門(mén)的葡聚糖包被的玻璃表面上的目標(biāo)抗原(例如，MAA蛋白質(zhì)加合物)結(jié)合的抗體。隨著大多數(shù)抗體積聚在傳感器芯片的表面上，BIAcore分析的信號(hào)直接增加。表征/定量抗體的BIAcore免疫分析為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知(見(jiàn)，例如，Meager et al.(2003)Clin.Exp.1mmunol.132:128-136 ;VanCott et al.(1992)J.1mmunol.Meth.，146:163-176 ;Takacset al.(1999)J.1nterferon Cytokine Res.19:781-789 ；Swanson(2003)Pp.127-133.1nA.R.Mire-Sluis (ed.)Immunogenicity of therapeutic biological products, vol.112.Karger, Basel, Switzerland ；Swanson (2004)Nephron.Clin Pract.96:c88_c95 等)。
[0132]在某些實(shí)施方案中，消逝型生物傳感器也是預(yù)期的。這些生物傳感器不需要檢測(cè)目標(biāo)分析物前的生物樣品預(yù)處理。消逝型生物傳感器通常依靠預(yù)定波長(zhǎng)的光，其與諸如，例如，在探針表面附近連接到MAA加合物上的熒光標(biāo)記的熒光分子相互作用，來(lái)通過(guò)結(jié)合分析物(例如抗MAA加合物抗體)在不同的波長(zhǎng)處發(fā)出熒光。
[0133]對(duì)技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是本文中描述的分析形式可接受多種高通量形式中的任何一種。
[0134]牛物樣品
[0135]在多個(gè)實(shí)施方案中，將抗MAA加合物抗體測(cè)量對(duì)來(lái)源于目標(biāo)個(gè)體的生物樣品進(jìn)行。此類(lèi)個(gè)體包括，例如，展現(xiàn)一種或多種臨床癥狀的患者、經(jīng)歷常規(guī)檢查的無(wú)癥狀患者、展現(xiàn)一種或多種心臟風(fēng)險(xiǎn)因子(例如，肥胖、糖尿病、吸煙者、心臟病家族史等)的患者。
[0136]使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得樣品，且在某些實(shí)施方案中，為用于特定分析方案最終需將其標(biāo)準(zhǔn)化。通常，如果它們都存在于個(gè)體內(nèi)，生物樣品為抗MAA加合物抗體預(yù)期可在其中找到的樣品。此類(lèi)樣品包括，但不限于:唾液/痰、血液或血液部分(例如，血漿、血清)、某些組織活檢等。
[0137]在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)選自以下的方法從個(gè)體獲得生物樣品:手術(shù)方法或其他的切除方法、諸如高滲鹽水或丙二醇的體液吸引術(shù)、支氣管腺體灌洗、支氣管鏡檢、使用玻璃管、唾液米集管(Sarstedt AG,瑞士塞沃倫)、Ora-sure (Epitope Technologies PtyLtd,澳大利亞維多利亞州墨爾本市)、omni_sal (Saliva Diagnostic Systems,美國(guó)紐約布魯克林)的唾液收集以及使用本領(lǐng)域已知的任何方法的血液采集，如，例如使用注射器。
[0138]在多個(gè)實(shí)施方案中，可以處理樣品來(lái)幫助存儲(chǔ)和/或分析中的處理，和/或分析的標(biāo)準(zhǔn)化。
[0139]體內(nèi)斑塊成像
[0140]組合物成像及它們的使用
[0141]在某些實(shí)施方案中，提供了斑塊，尤其是可導(dǎo)致心肌梗死的不穩(wěn)定斑塊成像的方法。在多個(gè)實(shí)施方案中，方法需要:給予目標(biāo)個(gè)體可特異性或優(yōu)選結(jié)合MAA蛋白質(zhì)加合物的組合物，其中所述組合物包括可檢測(cè)標(biāo)記。因此，靶向組合物通常包含靶向部分(例如，連接到可檢測(cè)標(biāo)記上的抗MAA加合物抗體)。當(dāng)被給予到個(gè)體時(shí),祀向部分特異性或優(yōu)選結(jié)合到MAA蛋白質(zhì)加合物存在的位點(diǎn)。這導(dǎo)致標(biāo)記定位/優(yōu)選分布到此類(lèi)位點(diǎn)。如果將組合物給予到個(gè)體的脈管系統(tǒng)，標(biāo)記將停留或優(yōu)選分布到斑塊形成的位點(diǎn)，使得更多的標(biāo)記被定位在在得到進(jìn)一步發(fā)展和/或不穩(wěn)定的斑塊處。對(duì)個(gè)體成像并檢測(cè)標(biāo)記位置。這允許評(píng)估斑塊并提供隨后的行動(dòng)指導(dǎo)(例如，藥物治療、血管成形術(shù)、心臟搭橋手術(shù)等)。
[0142]可以將標(biāo)記組合物用于直接靶向方法或用于預(yù)靶向策略。在直接靶向中，將可檢測(cè)標(biāo)記連接到了可特異性或優(yōu)選結(jié)合到MAA加合物上的靶向部分(例如抗MAA抗體、抗體片段等)上。因此，抗體到斑塊形成區(qū)域內(nèi)的抗MAA加合物上的結(jié)合可將標(biāo)記定位在那一區(qū)域，隨后可以對(duì)該區(qū)域成像，提供該位置的定位，和/或斑塊的嚴(yán)重度。
[0143]在某些實(shí)施方案中，可以將標(biāo)記組合物用于“預(yù)靶向”策略。在該方法中，最初沒(méi)有將標(biāo)記連接到MAA加合物靶向部分上。而是將MAA加合物靶向部分(例如，抗MAA加合物抗體)連接到了隨后可以被具有可檢測(cè)標(biāo)記的藥劑結(jié)合的第二部分上。合適的第二部分包括，例如，表位標(biāo)簽、抗體恒定區(qū)或框架區(qū)、生物素親和素等。
[0144]在某些實(shí)施方案中，在此類(lèi)標(biāo)記組合物中利用的標(biāo)記為“不透射線過(guò)的”標(biāo)記，例如，可以使用X射線容易地成像的標(biāo)記。不透射線的材料為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。最常見(jiàn)的不透射線材料包括碘化物、溴化物或鋇鹽。其他的不透射線材料也是已知的且包括，但不限于:有機(jī)鉍衍生物(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5939045)、不透射線的聚氨酯(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5346981)、有機(jī)鉍合成材料(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5256334)、不透射線的鋇聚合物復(fù)合物(見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利4866132)等。
[0145]除了放射標(biāo)記，其他的可檢測(cè)標(biāo)記也適合使用此類(lèi)標(biāo)記組合物。這樣的標(biāo)記包括，例如，放射性標(biāo)記和/或MR1、NMR, PET檢測(cè)的標(biāo)記等。
[0146]不同的優(yōu)選放射性標(biāo)記包括，但不限于:99TC、2°3Pb、67Ga、68Ga、72As、mIn、113mIn、97Ru、62Cu、641Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121 Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb具體的有用的PET標(biāo)記包括，但不限于:nC、18F、150、13N等。用于MRI的常見(jiàn)標(biāo)記包括，但不限于:釓螯合物和具有不同的表面修飾的氧化鐵納米粒子或微粒。諸如釓噴酸葡胺的釓螯合物為最廣泛使用的順磁性對(duì)比材料。氧化鐵顆粒為一類(lèi)超順磁MRI對(duì)比劑的部分。將通常由磁礦鐵(氧化鐵)核組成的這些化合物用葡聚糖或硅氧烷包被、用聚合物密封或進(jìn)一步修飾。
[0147]可以將靶向部分(例如，抗MAA加合物抗體等)直接連接到可檢測(cè)標(biāo)記上或可以將其通過(guò)一種或多種連接物的方式連接。例如，可以通過(guò)一種多功能(例如，雙功能、三功能或四功能)連接劑或成對(duì)的互補(bǔ)連接劑偶聯(lián)靶向部分和可檢測(cè)標(biāo)記部分。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)兩種、三種或更多種連接劑偶聯(lián)靶向部分和標(biāo)記。
[0148]如本文中所使用的“連接物”或“連接劑”為被用來(lái)連接兩個(gè)或更多個(gè)分子的分子。在某些實(shí)施方案中，連接物通常能對(duì)兩個(gè)分子形成共價(jià)鍵(例如，靶向部分和效應(yīng)物)。合適的連接物為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知且包括，但不限于:直鏈或支鏈碳連接物、雜環(huán)碳連接物或肽連接物。
[0149]可以將雙官能團(tuán)連接物用來(lái)形成期望的偶聯(lián)物，其中的雙官能團(tuán)連接物的一個(gè)官能團(tuán)可與一個(gè)分子上的基團(tuán)反應(yīng)(例如，抗MAA抗體)，且另一基團(tuán)在另一分子上反應(yīng)(例如，可檢測(cè)標(biāo)記)。作為選擇，可以進(jìn)行衍生來(lái)提供官能團(tuán)。因此，例如，在肽上生成游離的巰基基團(tuán)的程序也是已知的(見(jiàn)，例如，第4659839號(hào)美國(guó)專(zhuān)利)。
[0150]在某些實(shí)施方案中，連接劑為或包含官能團(tuán)。官能團(tuán)包括包含反應(yīng)基以及多功能交聯(lián)物的單官能團(tuán)連接物，其中的功能交聯(lián)物包含兩個(gè)或更多個(gè)能與兩個(gè)或更多個(gè)不同的功能目標(biāo)(例如，標(biāo)記、蛋白質(zhì)、大分子、半導(dǎo)體納米晶體或基質(zhì))形成結(jié)合的反應(yīng)基。在一些實(shí)施方案中，多功能交聯(lián)物為包含兩個(gè)或更多個(gè)不同的反應(yīng)基的異源雙功能交聯(lián)物。
[0151]合適的反應(yīng)基包括，但不限于:硫醇(-SH)、羧化物(COOH)、羧基(-C00H)、羰基、胺(NH2)、羥基(-0H)、醛(-CH0)、乙醇(ROH)、酮(R2CO)、活性氫、酯、巰基(SH)、磷酸鹽(-PO3)或光敏部分。胺反應(yīng)基包括，但不限于:例如，異硫氰酸酯、異氰酸酯、?；B氮、NHS酯、磺酰氯、醛和乙二醛、環(huán)氧化合物和環(huán)氧乙烷、碳酸鹽、芳化劑、亞胺酸酯、碳化二亞胺以及酐。硫醇反應(yīng)基包括，但不限于:例如，鹵代乙酰和鹵代烷衍生物、馬來(lái)酰亞胺、氮雜環(huán)丙烷、丙烯酰衍生物、芳化劑以及硫醇-二硫化物轉(zhuǎn)換試劑。羧化物反應(yīng)基包括，但不限于:例如，重氮烷和重氮基乙?；衔铮玺驶溥蚝吞蓟啺?。羥基反應(yīng)基包括，但不限于:例如，環(huán)氧化合物和環(huán)氧乙烷、羰基二咪唑、氧化性高碘酸鹽、N，N’ - 二琥珀酰亞基碳酸鹽或N-羥基琥珀酸銨氯甲酸酯、酶氧化物、鹵代烷基以及異氰酸酯。醛和酮反應(yīng)基包括，但不限于:例如，席夫堿形成或氨基化減少的肼衍生物?；钚詺浞磻?yīng)基包括，但不限于:例如，曼尼?？s合和碘化反應(yīng)的重氮衍生物。光敏基團(tuán)包括，但不限于:例如，疊氮化物和鹵代的芳基疊氮化物、苯甲酮、重氮化合物和雙吖丙啶衍生物。
[0152]在形成嵌合部分中有用的其他合適的反應(yīng)基和反應(yīng)類(lèi)型包括生物共軛化學(xué)領(lǐng)域熟知的反應(yīng)基和反應(yīng)類(lèi)型。當(dāng)前有利的對(duì)反應(yīng)螯合物有效的反應(yīng)類(lèi)型為在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行的反應(yīng)。這些反應(yīng)包括，但不限于:親核取代(例如，帶有鹵化?；?、活化酯的胺類(lèi)和醇類(lèi)的反應(yīng))、親電取代(例如，烯胺反應(yīng))以及加入碳-碳和碳-雜原子重鍵(例如，邁克爾反應(yīng)、狄爾斯-阿爾德反應(yīng))。這些和其他的有用的反應(yīng)被討論于，例如，March (1985)Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John ffiley&Sons, New York、Hermanson(1996)Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego 和 Feeney et al.(1982)Modification of Proteins: Advances in Chemistry Series,Vol.198, AmericanChemical Society, Washington, D.C0
[0153]將不同的分子連接到肽或蛋白質(zhì)上的許多程序和連接分子為已知的(見(jiàn)，例如，第188256號(hào)歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)；第4671958號(hào)、第4659839號(hào)、第4414148號(hào)、第4699784號(hào)、第 4680338 號(hào)、第 4569789 號(hào)和第 4589071 號(hào)美國(guó)專(zhuān)利；以及 Borlinghaus et al.(1987)Cancer Res.47:4071-4075)。
[0154]可以將本文中描述的許多成像試劑提供為螯合物，尤其是當(dāng)利用了預(yù)靶向策略時(shí)。螯合分子通常被結(jié)合到與連接在本發(fā)明的前列腺癌特異性抗體上的表位標(biāo)簽特異性結(jié)合的分子(例如，生物素、親和素、鏈霉親和素等)上。
[0155]螯合基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。在某些實(shí)施方案中，螯合基團(tuán)來(lái)源于乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、環(huán)己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-0，O’-二(2-氨乙基)-N，N, N’，N’-四乙酸(EGTA) ,N, N-二(羥芐基)_ 乙二胺-N，N’-二乙酸(HBED)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)U, 4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N, N’ -，N"，N〃’ -四乙酸(DOTA)、羥乙基二胺三乙酸(HEDTA)U, 4，8，11-四-氮雜環(huán)十四烷-N，N，，N〃，N〃’ -四乙酸(TETA)、取代的DTPA、取代的EDTA等。
[0156]某些優(yōu)選的螯合劑的實(shí)例包括未被取代的或取代的2-亞胺基硫雜烷和2-亞氨基硫雜環(huán)己烷，具體來(lái)說(shuō)，為2-亞氨基-4-巰基甲基硫雜烷。
[0157]由于一種螯合劑——I, 4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’ -，N〃，N〃’ -四乙酸(DOTA)可螯合多種諸如放射性核素和放射性標(biāo)記的在診斷上和治療上具有重要性的金屬的能力，其尤其讓人感興趣。
[0158]已經(jīng)描述過(guò)諸如抗體的DOTA和蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。例如，第5428156號(hào)美國(guó)專(zhuān)利教導(dǎo)了可將DOTA偶聯(lián)到抗體和抗體片段上的方法。為了產(chǎn)生這些偶聯(lián)物，將DOTA的一個(gè)羧酸基團(tuán)轉(zhuǎn)化為了活化酯，其可以與抗體或抗體片段上的胺基或巰基反應(yīng)。Lewis etal.(1994)Bioconjugate Chem.5:565-576描述了類(lèi)似的方法，其中將DOTA的一個(gè)羧基轉(zhuǎn)化為了活化酯，并用抗體混合活化的D0TA，通過(guò)抗體的賴(lài)氨酸殘基的ε -氨基將抗體連接到DOTA上，從而將DOTA的一個(gè)羧基轉(zhuǎn)化為氨基化合物部分。
[0159]作為選擇，可以直接地或通過(guò)連接物將螯合劑結(jié)合到表位標(biāo)簽上或結(jié)合到結(jié)合表位標(biāo)簽的部分上。已經(jīng)描述過(guò)DOTA和生物素的偶聯(lián)物(見(jiàn)，例如，Su(1995) J.Nucl.Med.，36 (5Suppl): 154P，其公開(kāi)了通過(guò)可利用的諸如DOTA-LC-生物素或DOTA-芐基-4-(6-氨基-己酰胺)_生物素)的氨基側(cè)鏈生物素衍生物將DOTA連接到生物素上。PCT公開(kāi)W095/15335公開(kāi)了產(chǎn)生可以被偶聯(lián)到生物素上的硝基-芐基-DOTA化合物的方法。該方法包括:通過(guò)短暫透射羥基的環(huán)化反應(yīng)；氨基的甲苯磺?；?；短暫保護(hù)羥基的去保護(hù)；去保護(hù)羥基的甲苯磺?；灰约胺肿觾?nèi)甲苯磺酸鹽環(huán)化。Wu et al.(1992) Nucl.Med.Biol.，19⑵:239-244公開(kāi)了用111In和9°Y合成放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)的大環(huán)螯合劑。Wu etal.制造了帶有標(biāo)記的DOTA-生物素偶聯(lián)物來(lái)研究帶有親和素的偶聯(lián)物一研究的一種模式蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物分布。該偶聯(lián)物使用含有游離氨基的生物素酰肼制得，用來(lái)與原位產(chǎn)生的活化DOTA衍生物反應(yīng)。
[0160]應(yīng)當(dāng)注意大環(huán)螯合劑1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’_，N〃，N〃’-四乙酸(DOTA)可以以非凡的穩(wěn)定性結(jié)合9°Y和mIn?？梢赃M(jìn)行選定緩沖液中用來(lái)評(píng)估預(yù)期的放射性藥物標(biāo)記下的放射性標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間的動(dòng)力學(xué)研究，來(lái)確定最優(yōu)放射性標(biāo)記條件，以提供符合放射藥物的FDA需求的高產(chǎn)物產(chǎn)量。應(yīng)當(dāng)注意，Kukis et al.(1998) J.Nucl.Med.，39(12):2105-2110詳細(xì)描述過(guò)制造釔-90-D0TA螯合物的方案。
[0161]制造適合結(jié)合到不同的靶向部分(例如，抗MAA加合物抗體)上的螯合物的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知(見(jiàn)，例如，第6190923號(hào)、第6187285號(hào)、第6183721號(hào)、第6177562號(hào)、第 6159445 號(hào)、第 6153775 號(hào)、第 6149890 號(hào)、第 6143276 號(hào)、第 6143274 號(hào)、第 6139819號(hào)、第 6132764 號(hào)、第 6123923 號(hào)、第 6123921 號(hào)、第 6120768 號(hào)、第 6120751 號(hào)、第 6117412號(hào)、第 6106866 號(hào)、第 6096290 號(hào)、第 6093382 號(hào)、第 6090800 號(hào)、第 6090408 號(hào)、第 6088613號(hào)、第 6077499 號(hào)、第 6075010 號(hào)、第 6071494 號(hào)、第 6071490 號(hào)、第 6060040 號(hào)、第 6056939號(hào)、第 6051207 號(hào)、第 6048979 號(hào)、第 6045821 號(hào)、第 6045775 號(hào)、第 6030840 號(hào)、第 6028066號(hào)、第 6022966 號(hào)、第 6022523 號(hào)、第 6022522 號(hào)、第 6017522 號(hào)、第 6015897 號(hào)、第 6010682號(hào)、第6010681號(hào)、第6004533號(hào)、第6001329號(hào)美國(guó)專(zhuān)利等)。
[0162]檢測(cè)此類(lèi)標(biāo)簽的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。因此，例如，可以使用感光片、閃爍探測(cè)器等檢測(cè)放射性標(biāo)記。使用PET成像系統(tǒng)檢測(cè)/成像PET標(biāo)記。類(lèi)似地，使用MRI系統(tǒng)檢測(cè)/成像MRI標(biāo)記。
[0163]杭體產(chǎn)牛
[0164]在某些實(shí)施方案中，MAA加合物的體內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)記試劑包括抗MAA抗體。這樣的組合物中有用的抗體包括多克隆和單克隆抗體、抗體片段、單鏈抗體等。通過(guò)將(例如，皮下或肌肉內(nèi)注射)免疫原(例如，MAA加合物)注射到合適的非人的哺乳動(dòng)物(例如，小鼠或兔)體內(nèi)引發(fā)多克隆抗體。一般來(lái)說(shuō)，免疫原應(yīng)當(dāng)誘導(dǎo)對(duì)目標(biāo)抗原具有相對(duì)高的親和力的高滴度的抗體的產(chǎn)生。`
[0165]如有需要，可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的偶聯(lián)技術(shù)將抗原偶聯(lián)到載體蛋白上。通常使用的載體包括鑰孔戚血藍(lán)素(KLH)、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破傷風(fēng)類(lèi)毒素。隨后將偶聯(lián)物用來(lái)免疫動(dòng)物。
[0166]隨后從從動(dòng)物采集的血液樣品獲得抗體。用來(lái)制造多克隆抗體的技術(shù)在文獻(xiàn)中得到廣泛的描述(見(jiàn)，例如，Methods of Enzymology, “Production of Antisera WithSmall Doses of Immunogen:Multiple Intradermal Injections, ^Langone, et al.eds.(Acad.Press, 1981))?？梢詫?dòng)物制造的多克隆抗體進(jìn)一步純化,例如,通過(guò)結(jié)合到并從目標(biāo)抗原結(jié)合到的基質(zhì)上洗脫。本領(lǐng)域技術(shù)人員可了解免疫學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常見(jiàn)的用于純化和/或濃縮多克隆以及單克隆抗體的不同技術(shù)，見(jiàn)，例如，Coligan, et al.(1991)Unit9, CurrentProtocols in Immunology, Wiley Interscience。
[0167]對(duì)于很多應(yīng)用，單克隆抗體(mAb)是優(yōu)選的。用于制造雜交瘤分泌性mAb的一般方法是熟知的(Kohler 和 Milstein (1975)Nature, 256:495)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，如 Kohler 和Milstein所描述，該技術(shù)需要:從患有黑色素瘤、畸胎癌或者子宮癌、神經(jīng)膠質(zhì)癌或肺癌的5個(gè)不同的癌癥患者的局部引流淋巴結(jié)分離淋巴細(xì)胞(其中樣品從手術(shù)樣本獲得)、合并細(xì)胞和用SHFP-1融合細(xì)胞。篩選了雜交瘤用于制造與癌細(xì)胞系結(jié)合的抗體?？梢允褂贸Ｒ?guī)篩選技術(shù)(如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定或“ELISA”)完成在mAb間確認(rèn)特異性，以確定目標(biāo)mAb的
基元反應(yīng)模式。
[0168]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括抗原結(jié)合性抗體片段，例如，單鏈抗體(scFv或其他)，其可以使用噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行制造/挑選。在感染細(xì)菌的病毒(細(xì)菌噬菌體或噬菌體)表面表達(dá)抗體片段的能力使得分離單個(gè)結(jié)合性抗體片段成為可能，例如，從大于1010個(gè)非結(jié)合性克隆文庫(kù)中。為了在噬菌體表面上表達(dá)抗體片段(噬菌體展示)，將抗體片段基因插入到編碼噬菌體表面蛋白(例如，PlII)的基因內(nèi)，并將抗體片段-PlII融合蛋白質(zhì)展不在卩遼菌體表面上(McCafferty et al.(1990) Nature, 348:552-554 ；Hoogenboom etal.(1991)Nucleic Acids Res.19:4133-4137)。
[0169]因?yàn)槭删w表面上的抗體片段是有功能的，可以通過(guò)抗原親和層析將噬菌體約束性抗原結(jié)合性抗體片段從未約束的噬菌體中分離出來(lái)(McCafferty et al.(1990)Nature, 348:552-554)。取決于抗體片段的親和力，單輪親和挑選獲得了 20倍-1000000倍的富集因子。然而，通過(guò)用洗脫的噬菌體感染細(xì)菌，更多的噬菌體可以得到生長(zhǎng)并經(jīng)歷另一輪的挑選。以這種方式，一輪中的1000倍的富集可以變?yōu)樘暨x的兩輪中的1000000倍(McCafferty et al.(1990)Nature, 348:552-554)。因此，即使當(dāng)富集較低時(shí)(Marks etal.(1991) J.Mol.Biol.222:581-597)，多輪的親和挑選可以引起稀有噬菌體的分離。因?yàn)榭乖鲜删w抗體文庫(kù)的挑選引起富集，在少至3至4輪的挑選后大多數(shù)的克隆即結(jié)合上抗原。因此，僅需分析相對(duì)小數(shù)量的克隆(幾百個(gè))的抗原結(jié)合。[0170]可以通過(guò)在噬菌體上展示非常大的和多變的V-基因全庫(kù)制造人抗體，而不需要前免疫(Marks et al.(1991) J.Mol.Biol.222:581-597)。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中，通過(guò)PCR從未免疫的供體中分離出了存在人外周血淋巴細(xì)胞中的天然VH和VL全庫(kù)。可以使用PCR任意地將V-基因全庫(kù)疊接在一起，來(lái)建立scFv基因全庫(kù)，其可以被克隆到噬菌體載體內(nèi)來(lái)建立3千萬(wàn)個(gè)噬菌體抗體的文庫(kù)(Id.)。從單個(gè)“初級(jí)”噬菌體抗體文庫(kù)中，對(duì)多于17個(gè)不同的抗原分離了結(jié)合性抗體片段，其中的抗原包括半抗原、多糖和蛋白質(zhì)(Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597 ；Marks et al.(1993).Bio/Technology.10:779-783 !Griffithset al.(1993)EMBO J.12:725-734 ；Clackson et al.(1991)Nature.352:624-628)。
[0171]此外，應(yīng)當(dāng)注意特異性結(jié)合MAA加合物的抗體的產(chǎn)生被描述于第5939535號(hào)美國(guó)專(zhuān)利。如其中所描述，通過(guò)在lmg/ml的濃度和37°C下,用ImM乙醒加ImM MDA處理兔血衆(zhòng)蛋白(由硫酸銨沉淀制備，如 Klassen (1994) Alcohol Clin Exp Res.18:164-171 所描述)3天制得了 MAA-加合物免疫原。對(duì)0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.4和4°C )過(guò)夜透析后，用等體積的弗氏完全佐劑混合溶液并乳化。在沿著它們背上的4個(gè)位點(diǎn)處對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行皮下注射(400yg的修飾蛋白)。兩周或四周后，除了使用弗氏完全佐劑外，通過(guò)相同的程序增強(qiáng)兔子。最終注射后兩周，得到了血清并測(cè)試了抗體活性。
[0172]接著親和純化了產(chǎn)生的抗血清。通過(guò)將其加入到溶于0.1磷酸鹽緩沖液的乙醛(ImM)和MDA(ImM) (pH7.4)中，并在37°C恒定震蕩下培養(yǎng)3天，對(duì)賴(lài)氨酸衍生的瓊脂糖4B珠(Sigma Chemical C0.，St.Louis, M0.)進(jìn)行了修飾。用4體積的緩沖液清洗珠子并將其導(dǎo)入 0.7cmX 15cm 的低壓 Econo-Column (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.)中。將來(lái)自免疫的動(dòng)物的IOml的兔血清載到柱子上。用5體積的緩沖液及隨后的IM NaCl清洗柱子，然后用0.5M乙酸(pH2.5)洗脫到Tris緩沖液(pH8.2)中，來(lái)中和酸性。通過(guò)蛋白質(zhì)G-瓊脂糖B (Pharmacia, Piscataway, N.J.)柱層析進(jìn)一步純化洗脫的材料,產(chǎn)生大于95%的純化的IgG部分。
[0173]如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地理解的那樣，還可以通過(guò)多種商業(yè)服務(wù)(例如，Berkeley Antibody Laboratories, Bethyl Laboratories, Anawa, Eurogenetec 等)的任何一種制備抗體。
[0174]以炎性過(guò)程為特征的其他病癥的診斷/預(yù)后
[0175]還發(fā)現(xiàn)丙二醛-乙醛加合物(MAA)可用作許多疾病的炎癥的生物標(biāo)志物。這源于在形成該加合物中涉及到的組分的基本性質(zhì)。不受具體理論的束縛，據(jù)信組織損傷后，細(xì)胞膜被不同的吞噬細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和中心粒細(xì)胞)識(shí)別。在該過(guò)程中，吞噬細(xì)胞釋放可改變細(xì)胞膜脂質(zhì)的超氧化物來(lái)制造丙二醛(MDA)。當(dāng)制造了足夠水平的MDA時(shí)，隨后MAA加合物將會(huì)產(chǎn)生。就其本身而言，組織內(nèi)MAA的存在為發(fā)生在炎癥反應(yīng)期間的組織/細(xì)胞損傷的量的反應(yīng)，且其檢測(cè)為該炎癥的良好標(biāo)志物。
[0176]已經(jīng)表明MAA加合物具有許多前炎癥性和免疫刺激性特性，這些特性可以導(dǎo)致抗體發(fā)展為MAA加合物和其結(jié)合在上面的大分子(見(jiàn)我們的第二份專(zhuān)利、其他的論文)。因此,抗MAA抗體的存在可反映炎癥反應(yīng)期間組織內(nèi)形成的MAA的量。此外，MAA的單克隆和多克隆抗體的產(chǎn)生使得評(píng)估不同疾病中的炎癥反應(yīng)成為可能。
[0177]因此，在某些實(shí)施方案中，預(yù)期可以將MAA加合物和/或MAA加合物的抗體用作以炎癥反應(yīng)為特征的多種病理中的炎癥的標(biāo)志物。
[0178]以炎癥反應(yīng)為特征的病癥的實(shí)例包括，但不限于:風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化(如上面所指出)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺氣腫、哮喘、感染(例如，細(xì)菌性感染、病毒性感染、寄生性感染)、膿毒癥/膿毒癥綜合癥、炎癥性腸病、狼瘡、多發(fā)性硬化、結(jié)締組織病、肝炎、濕疹等。
[0179]因此，在某些實(shí)施方案中，提供了評(píng)估個(gè)體的炎癥性病變的風(fēng)險(xiǎn)、狀態(tài)、階段、進(jìn)展或嚴(yán)重性的方法。該方法通常包括:測(cè)定來(lái)自個(gè)體的生物樣品中的MAA加合物和/或抗MAA加合物的水平，其中MAA加合物和/或抗MAA抗體的提高的水平(相比正常健康的個(gè)體，和/或相比與以前相同的個(gè)體)指示炎癥性病變的增加的風(fēng)險(xiǎn)、狀態(tài)、階段、進(jìn)展和/或嚴(yán)重性。在某些實(shí)施方案中，樣品包括選自以下的樣品:尿液樣品、血清樣品、血漿樣品、血液、血液部分、口腔液體/痰、支氣管灌洗、滑液樣品、糞便樣品、組織活檢和腦脊液樣品。
[0180]應(yīng)當(dāng)理解可以在差別診斷的情形下容易地測(cè)定為炎癥性狀態(tài)所特有的特定病變，例如，通過(guò)考慮其他的風(fēng)險(xiǎn)因子、病史、生活方式和其他的測(cè)試結(jié)果。
[0181]可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行MAA加合物和/或抗MAA加合物抗體的分析。
[0182]試劑盒
[0183]診斷/預(yù)后分析試劑盒
[0184]在某些實(shí)施方案中，用于檢測(cè)和/或定量生物樣品中的抗MAA加合物抗體的試劑盒是預(yù)期的。在一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包含含有MAA蛋白質(zhì)加合物的容器，其中可以將MAA蛋白質(zhì)加合物提供為凍干粉、溶于溶液中或連接到固相支持體上(例如，微量滴定板、微珠等)。該試劑盒可以任選地還包含一種或多種試劑，用于檢測(cè)MAA-加合物/抗MAA加合物復(fù)合物。此類(lèi)試劑可以包含抗MAA抗體(例如，抗MAA抗體IgG，和/或IgM，和/或IgM)。該試劑盒可以還包含報(bào)道分子，如，例如，酶(諸如辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶)、基質(zhì)、輔因子、抑制劑、染料、放射性核素、發(fā)光基團(tuán)、熒光基團(tuán)、生物素或者諸如膠體金或硒的膠粒。優(yōu)選將此類(lèi)報(bào)道分子直接連接到檢測(cè)試劑抗體上。
[0185]在某些實(shí)施方案中，試劑盒另外包含參考樣品。此類(lèi)參考樣品可以，例如，包括一種或多種抗MAA加合物抗體的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0186]在另一實(shí)施方案中，試劑盒任選包含樣品制備方式，如，樣品收集裝置、樣品貯存容器、緩沖液、酶底物等。
[0187]此外，試劑盒任選包含可提供指導(dǎo)(例如，方案)的標(biāo)記材料和/或指導(dǎo)材料，用于實(shí)踐本文中描述的診斷/預(yù)后方法。優(yōu)選的指導(dǎo)材料描述了抗MAA加合物抗體(例如，IgG,和/或IgM，和/或IGA)的檢測(cè)，來(lái)診斷斑塊的存在和/或來(lái)評(píng)估斑塊形成的預(yù)后(例如，形成穩(wěn)定或不穩(wěn)定斑塊)。
[0188]成像試劑盒
[0189]在某些實(shí)施方案中，提供了用于檢測(cè)和/或定量體內(nèi)MAA加合物的試劑盒(例如，用于體內(nèi)成像斑塊)。在某些實(shí)施方案中，這些試劑盒包含含有抗MAA加合物抗體的容器。在某些實(shí)施方案中，該試劑盒可以還包含可檢測(cè)標(biāo)記(例如，不透射線的標(biāo)記、MRI標(biāo)記、PET標(biāo)記、NMR標(biāo)記、ESR標(biāo)記等)。該試劑盒可以任選地還包含一種或多種試劑和/或裝置，用于體內(nèi)給予和/或檢測(cè)抗MAA抗體。
[0190]此外，該試劑盒任選包含可提供使用MAA加合物成像試劑來(lái)和/或定位，和/或成像斑塊的說(shuō)明(例如，方案)的標(biāo)記材料和/或指導(dǎo)材料。
[0191]雖然不同試劑盒中的指導(dǎo)材料通常包括書(shū)寫(xiě)的或打印的材料，它們并不限于此。任何能儲(chǔ)存此類(lèi)說(shuō)明并將它們傳達(dá)給終端用戶(hù)的媒介都是本發(fā)明預(yù)期的。此類(lèi)媒介包括，但不限于:電子儲(chǔ)存媒介(例如，磁盤(pán)、磁帶、暗盒、芯片)、光學(xué)媒介(例如，CD ROM)等。此類(lèi)媒介可以包括可提供此類(lèi)指導(dǎo)材料的互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站的網(wǎng)址。
實(shí)施例
[0192]提供以下實(shí)施例來(lái)例證、但不限制要求保護(hù)的發(fā)明。
[0193]實(shí)施例1
[0194]用醛類(lèi)修飾的Ox-LDL和蛋白質(zhì)通過(guò)兩者共有的丙二醛/乙醛(MAA)加合物誘導(dǎo)前炎癥、免疫和動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)
[0195]早已知道Ox-LDL和隨后由位于主動(dòng)脈的血管壁上的巨噬細(xì)胞攝取可增加動(dòng)脈粥樣硬化病變和斑塊形成的風(fēng)險(xiǎn)。丙二醛/乙醛修飾的蛋白質(zhì)(MAA)存在且似乎與人動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展和進(jìn)展相關(guān)。該研究的目的是確定MAA修飾的蛋白質(zhì)和Ox-LDL間是否存在關(guān)聯(lián)，這可以解釋它們?cè)诎l(fā)展動(dòng)脈粥樣硬化中的潛在作用。
_6] 方法
[0197] 將小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞系CRL-2167用來(lái)確定MAA修飾的蛋白質(zhì)或Οχ-LDL是否可能誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)和/或分泌。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將這些細(xì)胞暴露到不同濃度的LDL、Ox-LDL,人血清白蛋白(HSA)或HSA-MAA下，并分析其細(xì)胞因子表達(dá)(mRNA)和分泌(蛋白質(zhì))。為了評(píng)定這些反應(yīng)是否是因?yàn)樾揎椀呐潴w的相似性，用LDL、Ox-LDL、LDL-MAA、HAS或HSA-MAA免疫Balb/c大鼠，并測(cè)試了血清以驗(yàn)證MAA和LDL的抗體的存在。使用先前報(bào)導(dǎo)為對(duì)該表位具有特異性的抗體分析了這些配體，以驗(yàn)證MAA。從JCR大鼠提取了主動(dòng)脈組織并通過(guò)免疫印跡探測(cè)MAA修飾的蛋白質(zhì)。
[0198]結(jié)果和結(jié)論
[0199]mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)分泌研究證明了用HSA-MAA、Οχ-LDL和LDL-MAA孵育后MCP-1、IL-6, TNF-α和平滑肌肌動(dòng)蛋白的增加。來(lái)自用不同的配體免疫過(guò)的小鼠的血清表明MAA的抗體僅在用Οχ-LDL、LDL-MAA和HSA-MAA免疫過(guò)的小鼠體內(nèi)產(chǎn)生。抗MAA抗體表明僅這3個(gè)免疫性配體含有該加合物。用LDL-MAA免疫還導(dǎo)致潛在致病的抗LDL抗體的產(chǎn)生。最后，如通過(guò)免疫印跡ting、使用抗MAA抗體所評(píng)估，來(lái)自JCR大鼠的主動(dòng)脈含有MAA修飾的蛋白質(zhì)?？傊?，MAA修飾的蛋白質(zhì)和Οχ-LDL引起抗體反應(yīng)和前炎癥效應(yīng)，它們可以通過(guò)兩者共有的MAA部分加重動(dòng)脈粥樣硬化疾病。
[0200]實(shí)施例2
[0201]用于評(píng)估患有動(dòng)脈粥樣硬化疾病和劑型心肌梗死的患者中易損斑塊的新的生物標(biāo)志物
[0202]被氧化的蛋白質(zhì)涉及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展和進(jìn)展。制造了丙二醛(MDA)-乙醛(AA)加合物(MAA)，且其為用氧化性產(chǎn)物MDA孵育蛋白質(zhì)后形成的優(yōu)勢(shì)表位。該研究的目的是作為心臟動(dòng)脈疾病的標(biāo)志物評(píng)估抗MAA加合物抗體。
[0203]分析了來(lái)自正常對(duì)照、患有急性心肌梗死(MI)、早期冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)和晚期狀態(tài)冠狀動(dòng)脈疾病的患者的血清樣品的MAA蛋白質(zhì)加合物的抗體(生物標(biāo)志物)。
[0204]為了測(cè)定血清樣品中的MAA蛋白質(zhì)加合物，用人白蛋白或人白蛋白MAA包覆ELISA盤(pán)。將來(lái)自個(gè)體的血清稀釋并加入到合適的孔中。使用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG第二抗體檢測(cè)抗體結(jié)合(如圖3中所闡述)。測(cè)定了光密度并從人IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線外推出了抗MAA加合物抗體的濃度。將抗MAA加合物抗體濃度測(cè)定為抗體MAA-白蛋白減去單一的白蛋白的抗體濃度的濃度。
[0205]如圖4中所闡述，相比正常對(duì)照、患有早期階段CAD的個(gè)體和患有晚期階段CAD的個(gè)體，患有急性MI的個(gè)體具有顯著偏高的抗MAA加合物抗體水平。
[0206]存在關(guān)于以上分析的特異性的問(wèn)題，因此進(jìn)行了研究來(lái)表明檢測(cè)到得抗體即為加合物MAA的抗體。使用牛血清白蛋白(BSA)和用MAA修飾的BSA(BSA-MAA)抑制了血清抗體濃度。將抗體維持在恒定的稀釋水平并將不同濃度的BSA或BSA-MAA用作抑制劑。將抗體和抑制劑一起孵育，隨后將他們加入到分析孔中并按如上所述使其發(fā)展。產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，呈現(xiàn)為百分比抑制，展示在圖5中。如其中所示，MAA特異性抗體包含約70%的信號(hào)。
[0207]在這些關(guān)于MAA的抗體的研究過(guò)程中獲得了有趣的觀察結(jié)果。在心肌梗死(MI)時(shí)和穩(wěn)定后24小時(shí)收集血清。如圖6中所顯示，MI后24小時(shí)抗體濃度顯著減少。不受具體理論所束縛，據(jù)信這是由于組織被破壞時(shí)產(chǎn)生且在MI期間被釋放的修飾蛋白質(zhì)對(duì)抗體的結(jié)合和扣留。
[0208]還檢測(cè)了來(lái)自冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)患者的主動(dòng)脈鉆取活組織檢查中MAA的存在。用MAA的抗體著色來(lái)自冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)患者的鉆取活組織檢查。結(jié)果顯示在圖7中。用小鼠(中圖)或兔血清(右圖)阻塞組織，隨后與用紅外線顆粒(680nm)直接標(biāo)記的小鼠或兔抗MAA孵育。通過(guò)共聚焦顯微鏡(63倍)評(píng)估片子。組織的自發(fā)熒光由左圖中的組織表示。如圖7中所闡述，MAA存在于這些患者的主動(dòng)脈中。[0209]圖8提供了易損斑塊的圖解，顯示了脂質(zhì)核心、炎癥位點(diǎn)、薄纖維帽和MAA修飾的蛋白質(zhì)(MAA加合物)的位置。
[0210]在另一研究中，測(cè)定了 JCR大鼠體內(nèi)MAA修飾的大鼠白蛋白的血清抗體濃度。用高膽固醇飲食喂養(yǎng)JCR大鼠6-8個(gè)月。分析了血清，以驗(yàn)證大鼠的用MAA修飾的血清白蛋白(RSA-MAA)、正常大鼠血清白蛋白(RSA)或主動(dòng)脈和用MAA修飾的主動(dòng)脈的抗體的存在。數(shù)據(jù)顯示在圖9中。對(duì)未修飾蛋白質(zhì)減去MAA修飾的蛋白質(zhì)的活性間的差異表示為ng/ml的從標(biāo)準(zhǔn)曲線推測(cè)來(lái)的大鼠IgG。
[0211]還進(jìn)行了來(lái)自JCR大鼠的主動(dòng)脈組織的MAA修飾的蛋白質(zhì)(MAA蛋白質(zhì)加合物)的免疫沉淀反應(yīng)。喂養(yǎng)JCR大鼠高膽固醇飲食6-8個(gè)月。收集了來(lái)自JCR大鼠或斯普拉-道來(lái)氏大鼠的主動(dòng)脈組織，并使用單克隆抗MAA抗體免疫沉淀。通過(guò)SDS-PAGE溶解蛋白質(zhì)并用兔抗MAA抗體通過(guò)免疫印跡探測(cè)。結(jié)果顯示在圖10中。數(shù)據(jù)表示88帶的著色性88-kDa的強(qiáng)度，表示為3個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的均值土SEM。JCR大鼠顯示顯著偏高的MAA加合物水平。
[0212]該模型似乎在模仿人體系統(tǒng)，關(guān)于:1)發(fā)展動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；2)發(fā)展對(duì)MAA修飾的蛋白質(zhì)抗體滴度；和3)可以在發(fā)展出動(dòng)脈粥樣硬化的JCR大鼠的主動(dòng)脈中檢測(cè)到MAA修飾的蛋白質(zhì)的形成。
[0213]不受具體理論所束縛，據(jù)信在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展中和在特定的冠狀動(dòng)脈疾病中，建立了炎癥位點(diǎn)，其中被氧化的蛋白質(zhì)和LDL結(jié)合、內(nèi)在化并起始前炎癥反應(yīng)。一些oxLDL和MAA修飾的蛋白質(zhì)被從該位點(diǎn)釋放，并遷移到免疫系統(tǒng)來(lái)以負(fù)荷依賴(lài)性方法啟動(dòng)免疫反應(yīng)。起始了與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展以及其進(jìn)展相關(guān)的抗體。MAA的抗體越多，斑塊不穩(wěn)定的幾率越大。隨著oxLDL和加合的蛋白質(zhì)積聚，更多的炎癥細(xì)胞積聚、滲入，且斑塊生長(zhǎng)，造成心絞痛。最后，炎癥變得具有壓倒性，由于細(xì)胞因子和免疫反應(yīng)，造成纖維斑塊帽變薄，且由于漏膜和對(duì)泄露的修飾的大分子的響應(yīng)，抗體濃度增加。最終，斑塊破裂造成釋放大量的oxLDL和與循環(huán)性抗體結(jié)合的MAA修飾的蛋白質(zhì)，引起減少的抗體濃度。
[0214]實(shí)施例3
[0215]患有動(dòng)脈粥樣硬化疾病和急性心肌梗死的患者體內(nèi)增加的MAA-蛋白質(zhì)加合物和抗MAA抗體:用于評(píng)估易損斑塊的新的生物標(biāo)志物
[0216]被氧化的蛋白質(zhì)涉及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展和進(jìn)展。丙二醛/乙醛(MAA)修飾的LDL被高度氧化且優(yōu)勢(shì)表位在用丙二醛修飾蛋白質(zhì)后形成。MAA修飾的蛋白質(zhì)還與內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的清道夫受體結(jié)合，并促進(jìn)前炎癥細(xì)胞因子的釋放。已經(jīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的JCR大鼠模型中檢測(cè)到了 MAA修飾的蛋白質(zhì)。
[0217]目標(biāo):
[0218]該研究的目的是評(píng)估來(lái)自患有動(dòng)脈粥樣硬化的患者的組織以驗(yàn)證MAA加合的蛋白質(zhì)的存在,并測(cè)定這些患者體內(nèi)循環(huán)性抗MAA抗體的水平。
[0219]方法:
[0220]收集了來(lái)自正常對(duì)照(N=82)、穩(wěn)定型心絞痛(N=42)、急性心肌梗死(AMI) (N=39)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG) (N=72)的血清樣品，并測(cè)試了循環(huán)性MAA修飾的蛋白質(zhì)和抗MAA抗體的存在。使用單克隆小鼠抗MAA抗體，使來(lái)自CABG患者的主動(dòng)脈鉆取活組織檢查經(jīng)歷了免疫組織化學(xué)著色，并通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)。
[0221]結(jié)果:[0222]相比正常健康的對(duì)照，來(lái)自患有穩(wěn)定型心絞痛、急性MI和CABG的患者的血清中的MAA修飾的蛋白質(zhì)的循環(huán)性抗體被顯著性增加(P〈0.001)。相比來(lái)自穩(wěn)定型心絞痛(P<0.04)或CABG(P〈0.004)患者的血清樣品，來(lái)自患有急性MI的患者的血清樣品具有顯著增加的循環(huán)性抗MAA抗體水平。主動(dòng)脈鉆取活組織檢查的共聚焦顯微鏡檢查顯示增加的MAA加合物水平。
[0223]益論:
[0224]AMI患者體內(nèi)抗MAA抗體顯著偏低的水平被認(rèn)為是急性期期間抗體產(chǎn)生的初始增力口，伴隨著隨后隨著在患者的支架或搭橋手術(shù)前的醫(yī)療穩(wěn)定后修飾的蛋白質(zhì)或LDL被清除又減少的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)顯示了循環(huán)性抗MAA抗體水平的顯著增加和患有動(dòng)脈粥樣硬化的患者的組織中MAA加合物的存在?？筂AA抗體和MAA修飾的蛋白質(zhì)可以用作動(dòng)脈粥樣硬化疾病另外的生物標(biāo)志物和易損斑塊的估量。
[0225]實(shí)施例4
[0226]CAD中的MAA的抗體同種型
[0227]測(cè)定了來(lái)自正常對(duì)照、急性MI患者、穩(wěn)定早期CAD患者和穩(wěn)定晚期CAD患者的血清中的MAA加合物的不同抗體同種型(IgG、IgM和IgA)的血清濃度。如圖11中所顯示，相比正常對(duì)照或患有穩(wěn)定早期CAD或穩(wěn)定晚期階段CAD的患者，患有急性MI的患者具有顯著偏高的MAA加合物的IgG水平。
[0228]如圖12中所顯示，相比正常對(duì)照和患有穩(wěn)定早期CAD或穩(wěn)定晚期CAD的患者，患有急性MI的患者具有顯著偏高的MAA加合物的抗體的IgM水平。這些發(fā)現(xiàn)緊密地模仿了觀察到的MAA加合物的IgG抗體的發(fā)現(xiàn)。
[0229]圖13顯示相比正常對(duì)照或患有穩(wěn)定早期CAD和穩(wěn)定晚期CAD的患者，來(lái)自患有穩(wěn)定晚期CAD的患者的血清具有顯著偏高的MAA加合物的IgA抗體水平?；加蟹€(wěn)定早期CAD和急性MI的患者也具有顯著高于正常對(duì)照的MAA加合物的IgA抗體水平。
[0230]不受具體理論所束縛，據(jù)信在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展期間，且尤其是在冠狀動(dòng)脈疾病期間，建立了炎癥位點(diǎn)，其中被氧化的蛋白質(zhì)和LDL結(jié)合、內(nèi)在化和啟動(dòng)前炎癥反應(yīng)。一些oxLDL和MAA修飾的蛋白質(zhì)被從該位點(diǎn)釋放，并遷移到免疫系統(tǒng)來(lái)以負(fù)荷依賴(lài)性方法啟動(dòng)免疫反應(yīng)，引起IgM抗體的產(chǎn)生。隨著oxLDL和加合的蛋白質(zhì)積聚，更多的炎癥細(xì)胞滲入，且斑塊生長(zhǎng)，造成心絞痛。最后，炎癥變得具有壓倒性，IgM抗體被類(lèi)別轉(zhuǎn)換為更具致病性的IgG抗體，其幫助纖維斑塊帽變薄(由于細(xì)胞因子和免疫反應(yīng))，且由于漏膜和對(duì)增加的泄露的修飾的大分子水平的響應(yīng)，抗體濃度增加。最終斑塊破裂造成大量的oxLDL和MAA修飾的蛋白質(zhì)的釋放和急性心肌梗死。作為選擇，在患有穩(wěn)定CAD的患者體內(nèi)，oxLDL和加合的蛋白質(zhì)在帽的外膜邊(不在脈管系統(tǒng)的內(nèi)腔內(nèi))上積累，且炎癥反應(yīng)得到減少。釋放的細(xì)胞因子造成IgA反應(yīng)，其為更少致病性的，且纖維斑塊帽被保持完整，導(dǎo)致穩(wěn)定性CAD。
[0231]實(shí)施例5
[0232]區(qū)別正常冠狀動(dòng)脈、穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣化病灶和不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣化病灶:患有動(dòng)脈粥樣硬化疾病和急性心肌梗死的患者中MAA-蛋白質(zhì)加合物和抗MAA抗體同種型
[0233]被氧化的蛋白質(zhì)涉及動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展和進(jìn)展。制造了丙二醛(MDA)-乙醛(AA)加合物(MAA)，且其為用氧化性產(chǎn)物MDA孵育蛋白質(zhì)后形成的優(yōu)勢(shì)表位。此外，已經(jīng)在JCR動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈組織和動(dòng)脈粥樣硬化的人體模型中檢測(cè)到了這些MAA修飾的蛋白質(zhì)。MAA修飾的蛋白質(zhì)涉及動(dòng)脈粥樣硬化疾病的進(jìn)展。
[0234]且起:
[0235]本研究的目的是評(píng)估MAA加合的蛋白質(zhì)和循環(huán)性IgM、IgG和IgA抗MAA抗體同種型與具有正常冠狀動(dòng)脈的患者和患有穩(wěn)定和不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化病變的患者的關(guān)聯(lián)。
[0236]方法:
[0237]在6個(gè)月期間，收集了來(lái)自正常對(duì)照(n=82)、穩(wěn)定型心絞痛(n=42)、急性心肌梗死(AMI) (n=41)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG) (n=72)患者的血清樣品，并測(cè)試了抗MAA抗體同種型的存在。所有的樣品都在肝素化、干預(yù)和/或旁路血液泵起始前收集。使用單克隆小鼠抗MAA抗體使來(lái)自CABG患者的大動(dòng)脈鉆取活組織檢查經(jīng)歷免疫組織化學(xué)(IHC)著色，并通過(guò)共聚焦顯微鏡檢測(cè)。
[0238]益果:
[0239]相比患有冠狀動(dòng)脈疾病(p〈0.001)的患者，正常對(duì)照患者具有顯著偏低的循環(huán)性抗 MAA IgG(97ng/ml, SE=6.9)和 IgA(82ng/ml)。相比穩(wěn)定型心絞痛(186ng/ml, SE=20.7)(ρ〈0.04)或CABG患者(163ng/ml, SE=14.6) (ρ〈0.004)，AMI患者具有顯著增加的循環(huán)性抗 MAA IgG 抗體(242ng/ml, SE=30.5)水平。相比穩(wěn)定型心絞痛(367ng/ml, SE=64.4)(ρ〈0.001)或AMI患者(361ng/ml, SE=65.0) (ρ〈0.001)，來(lái)自患有CABG的患者的血清樣品具有顯著增加的循環(huán)性抗MAA IgA抗體(2495ng/ml，SE=334)水平?？筂AA IgM抗體以與IgG結(jié)果類(lèi)似的形式在組間顯著不同。主動(dòng)脈鉆取活組織檢查的共聚焦顯微鏡檢查證實(shí)主動(dòng)脈中層間隙中MAA加合物增加的水平。
[0240]益論:
[0241]這些數(shù)據(jù)表明MAA修飾的蛋白質(zhì)存在于動(dòng)脈粥樣硬化組織，且患有冠狀動(dòng)脈疾病的患者中循環(huán)性抗MAA抗體(IgM、IgG和IgA)水平存在顯著增加。相比正常冠狀動(dòng)脈和穩(wěn)定型CAD患者，展現(xiàn)AMI的患者中抗MAA IgM和IgG表型顯著增加，然而，相比所有其他的組，進(jìn)行過(guò)CABG的患者體內(nèi)抗MAA IgA表型顯著增加。免疫球蛋白表型(IgM、IgG和/或IgA)被假定為僅次于患病組織中MAA修飾的蛋白質(zhì)的抗原致敏作用的差異(Thl對(duì)Th2)。
[0242]應(yīng)思:
[0243]抗MAA IgM、IgG和IgA抗體同種型以及MAA修飾的蛋白質(zhì)可以用作亞臨床的動(dòng)脈粥樣硬化疾病(IgM、IgG和IgA)的生物標(biāo)志物，以及用作區(qū)分具有穩(wěn)定型(IgA)和不穩(wěn)定型(IgG)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的CAD患者。
[0244]應(yīng)當(dāng)理解本文中描述的實(shí)例和實(shí)施方案僅用于示例性目的，且基于其的不同的修飾或改變被教導(dǎo)給本領(lǐng)域技術(shù)人員且被包括在本申請(qǐng)的精神和范圍以及附加的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文中引用的所有的出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文，用于所有目的。
【權(quán)利要求】
1.鑒定哺乳動(dòng)物具有提高的不利心血管事件風(fēng)險(xiǎn)和/或確定所述哺乳動(dòng)物的預(yù)后的方法，所述方法包括: 確定與來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，所述抗體的提高的水平指示所述哺乳動(dòng)物患有一種或多種動(dòng)脈粥樣硬化病變。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結(jié)合的IgG抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結(jié)合的IgM抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結(jié)合的IgA抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，所述IgG抗體和/或所述IgM抗體的提高的水平指示所述哺乳動(dòng)物具有一個(gè)或多個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和存在患心臟動(dòng)脈疾病風(fēng)險(xiǎn)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，所述IgA抗體提高的水平指示所述哺乳動(dòng)物患有穩(wěn)定型心絞痛。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，所述IgA抗體的水平指示所述哺乳動(dòng)物患有不穩(wěn)定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)。
8.如權(quán)利要求5-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物被作為具有提高的不利心血管事件風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體和/或被作為患`有穩(wěn)定型心絞痛的個(gè)體接受治療。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物被作為患有不穩(wěn)定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體接受治療。
10.如權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物被開(kāi)出了補(bǔ)充測(cè)試的處方和/或進(jìn)行了所述補(bǔ)充測(cè)試。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述補(bǔ)充測(cè)試不為測(cè)量與MAA加合物結(jié)合的抗體。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述補(bǔ)充測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:心臟組織損傷或高心臟病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)的血液檢查、心電圖、壓力測(cè)試、冠脈MRI和冠狀動(dòng)脈造影。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述血液檢查包括選自以下的一種或多種測(cè)試:肌鈣蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌紅蛋白。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述壓力測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:運(yùn)動(dòng)耐量測(cè)試、核壓力測(cè)試、心臟MRI壓力和壓力超聲波心動(dòng)圖。
15.如權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物被開(kāi)出治療的處方和/或被治療。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述治療包括給予藥物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述藥物包含選自以下的一種或多種藥物:他汀類(lèi)、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪。
18.如權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療為選自以下的治療:血管成形術(shù)、經(jīng)皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗MAA加合物IgG抗體或抗MAA-1gM抗體水平和/或基于，至少部分基于所述水平的診斷被記錄在患者病歷中。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗MAA加合物IgA抗體和/或基于，至少部分基于所述水平的診斷被記錄在患者病歷中。
21.如權(quán)利要求19-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者病歷由實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)師診所、醫(yī)院、健康維護(hù)組織、保險(xiǎn)公司或私人病歷網(wǎng)站維護(hù)。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少部分基于抗MAA加合物IgG抗體水平，和/或IgM抗體水平，和/或IgA抗體水平的診斷，被記錄在選自以下的醫(yī)師警示物品上/內(nèi):卡、穿戴物或射頻識(shí)別(RFID)標(biāo)記。
23.如權(quán)利要求19-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述抗體水平和/或基于所述抗體水平的診斷被記錄在非暫時(shí)性的計(jì)算機(jī)可讀媒介上。
24.如權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的方法，還包括告知所述個(gè)體抗MAA加合物抗體和/或至少部分基于抗MAA加合物抗體分析的診斷的結(jié)果。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述與MAA加合物結(jié)合的抗體作為差別診斷的一部分被檢測(cè)。
26.如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為非人的哺乳動(dòng)物，且所述生物樣品來(lái)自所述非人的哺乳動(dòng)物。`
27.如權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人，且所述生物樣品來(lái)自所述人。
28.如權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。
29.如權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中檢測(cè)抗MAA加合物抗體，在所述分析中，所述生物樣品被分開(kāi)以從至少一種其他的樣品組分中分離包含所述抗體的部分。
30.如權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為已知患有或懷疑患有動(dòng)脈粥樣硬化的哺乳動(dòng)物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有選自以下的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子:心臟病家族風(fēng)險(xiǎn)、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖、糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結(jié)締組織病癥、慢性感染和炎癥性腸病。
32.如權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中檢測(cè)了與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體和/或IgM抗體,和/或IgA抗體,在所述分析中，所述抗體和/或在所述抗體和MAA加合物之間形成的復(fù)合物變得標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記。
33.如權(quán)利要求1-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中檢測(cè)了與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體,和/或IgM抗體,和/或IgA抗體,在所述分析中，所述抗體通過(guò)與其他的分析組分形成復(fù)合物由未結(jié)合狀態(tài)變成了結(jié)合狀態(tài)。
34.如權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中檢測(cè)了與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗體變成固定在固相上。
35.如權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用選自以下的分析測(cè)量所述IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平:SDS/PAGE、等電點(diǎn)聚焦、2維凝膠電泳、血凝分析和免疫分析。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中使用ELISA分析測(cè)量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平。
37.如權(quán)利要求35-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述免疫分析包括: 提供被固定在固相支持體上的MAA加合物； 在這樣的條件下將所述MAA加合物與所述生物樣品接觸，其中所述樣品中的抗MAA加合物抗體與MAA加合物結(jié)合，形成加合物/抗體復(fù)合物；和 將所述復(fù)合物與特異性結(jié)合IgG抗體或IgA抗體或IgM抗體的檢測(cè)抗體接觸，或者將所述復(fù)合物與結(jié)合任一抗體的檢測(cè)試劑接觸；和 檢測(cè)和/或定量所述結(jié)合的檢測(cè)抗體或所述結(jié)合的檢測(cè)試劑。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中: 所述檢測(cè)抗體被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上或被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上的另一抗體結(jié)合；和/或所述檢測(cè)試劑被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上和/或所述檢測(cè)試劑被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上的抗體結(jié)合；且 所述檢測(cè)和/或定量包括檢測(cè)和/或定量所述可檢測(cè)標(biāo)記。
39.監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的方法，所述方法包括:` 確定與來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平或使其得到確定；和 將所述抗體的水平與在先前的時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的所述哺乳動(dòng)物的水平比較，其中: 相比先前的測(cè)定，與所述生物樣品中的所述MA A加合物結(jié)合的抗體的總水平的增加，指示所述哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變已經(jīng)惡化；且 相比先前的測(cè)定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平的減少，指示所述哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變得到減輕或進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)得到減少。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中在所述先前的時(shí)間點(diǎn)與所述確定或使其得到確定的時(shí)間之間的時(shí)期，所述哺乳動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化得到治療，且: 相比先前的測(cè)定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平的增加，指示所述治療具有有限的功效或沒(méi)有功效且所述哺乳動(dòng)物中病變已經(jīng)惡化；和 相比先前的測(cè)定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平的減少，指示所述治療至少具有一些功效且所述哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變得到減少，或進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)得到減少。
41.如權(quán)利要求39-40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結(jié)合的IgG抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
42.如權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結(jié)合的IgM抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
43.如權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括確定與所述加合物結(jié)合的IgA抗體的存在和/或水平或使其得到確定。
44.如權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中:相比先前的測(cè)定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平和/或從IgM到IgG和/或IgA抗體的類(lèi)別轉(zhuǎn)換的增加，指示所述哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變已經(jīng)惡化；且 相比先前的測(cè)定，與所述生物樣品中的所述MAA加合物結(jié)合的抗體的總水平和/或從IgM到IgG和/或IgA抗體的類(lèi)別轉(zhuǎn)換的減少，指示所述哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變得到減少。
45.如權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中相比先前的測(cè)定，IgA抗體的增加指示所述哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變變得更穩(wěn)定，和/或所述治療至少部分地增加所述哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化病變的穩(wěn)定性。
46.如權(quán)利要求40-45中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物的所述治療包括選自以下的一種或多種形式:改變飲食、增加運(yùn)動(dòng)、減肥、開(kāi)他汀類(lèi)處方/給予他汀類(lèi)、開(kāi)受體阻滯劑處方/給予β -受體阻滯劑、開(kāi)鈣通道阻滯劑處方/給予鈣通道阻滯劑、開(kāi)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑處方/給予血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑、心臟導(dǎo)管插入、壓力測(cè)試和血管支架。
47.如權(quán)利要求39-46中任一項(xiàng)所述的方法，其中如果測(cè)量提供所述治療具有有限功效或沒(méi)有功效和/或所述哺乳動(dòng)物中病變已經(jīng)惡化的指示，則給所述哺乳動(dòng)物開(kāi)出補(bǔ)充測(cè)試的處方和/或進(jìn)行補(bǔ)充測(cè)試。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述補(bǔ)充測(cè)試不為與MAA加合物結(jié)合的抗體的測(cè)量。
49.如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述補(bǔ)充測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:心臟組織損傷或高心臟病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)的血液檢查、心電圖、壓力測(cè)試、冠脈MRI和冠狀動(dòng)脈造`影。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述血液檢查包括選自以下的一種或多種測(cè)試:肌鈣蛋白Ι、Τ-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌紅蛋白。
51.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述壓力測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:運(yùn)動(dòng)耐量測(cè)試、核壓力測(cè)試和壓力超聲波心動(dòng)圖。
52.如權(quán)利要求39-51中任一項(xiàng)所述的方法，其中如果測(cè)量提供治療具有有限的功效或沒(méi)有功效和/或所述哺乳動(dòng)物中病變已經(jīng)惡化的指示，則給所述哺乳動(dòng)物開(kāi)出需新的治療、不同的治療或補(bǔ)充治療的處方，和/或使用新的治療、不同的治療或補(bǔ)充治療對(duì)其治療。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述治療包括給予藥物。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述藥物包括選自以下的一種或多種藥物:他汀類(lèi)、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、血管緊張素受體受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪。
55.如權(quán)利要求52-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療為選自以下的治療:血管成形術(shù)、經(jīng)皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)。
56.如權(quán)利要求39-55中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為非人的哺乳動(dòng)物，且所述生物樣品來(lái)自所述非人的哺乳動(dòng)物。
57.如權(quán)利要求39-55中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人，且所述生物樣品來(lái)自所述人。
58.如權(quán)利要求56-57中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、血漿、血清、組織液、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。
59.如權(quán)利要求62-58中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中檢測(cè)抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將所述生物樣品分開(kāi)以從至少一種其他的樣品組分中分離包含所述抗體的部分。
60.如權(quán)利要求39-59中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為已知患有或懷疑患有動(dòng)脈粥樣硬化的哺乳動(dòng)物。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有選自以下的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子:心臟病家族風(fēng)險(xiǎn)、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖、糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結(jié)締組織病癥、慢性感染和炎癥性腸病。
62.治療哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括: 接受與來(lái)自所述哺乳動(dòng)物的生物樣品中的丙二醛-乙醛加合物(MAA加合物)結(jié)合的抗體的存在和/或水平的測(cè)量，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，所述抗體的提高的水平指示所述哺乳動(dòng)物患有一種或多種動(dòng)脈粥樣硬化病變；和 當(dāng)所述抗體顯示提高的水平時(shí)，提供與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的對(duì)所述哺乳動(dòng)物的補(bǔ)充測(cè)試或使其得到提供，和/或提供與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的對(duì)所述哺乳動(dòng)物的補(bǔ)充治療或使其得到提供。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中所述方法包括接受與所述加合物結(jié)合的IgG抗體的存在和/或水平的測(cè)量。`
64.如權(quán)利要求62-63中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括接受與所述加合物結(jié)合的IgM抗體的存在和/或水平的測(cè)量。
65.如權(quán)利要求62-64中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括接受與所述加合物結(jié)合的IgA抗體的存在和/或水平的測(cè)量。
66.如權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，所述IgA抗體提高的水平指示所述哺乳動(dòng)物患有穩(wěn)定型心絞痛，且所述哺乳動(dòng)物被進(jìn)一步測(cè)試和/或被作為患有穩(wěn)定型心絞痛或存在穩(wěn)定型心絞痛的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體接受治療。
67.如權(quán)利要求62-65中任一項(xiàng)所述的方法，其中相比正常健康的哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的水平，所述IgA抗體的水平指示所述哺乳動(dòng)物患有不穩(wěn)定型心絞痛且存在明顯的心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)，且所述哺乳動(dòng)物被進(jìn)一步測(cè)試和/或被作為患有不穩(wěn)定型心絞痛和/或心肌梗死或存在不穩(wěn)定型心絞痛和/或心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體接受治療。
68.如權(quán)利要求62-67中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物被開(kāi)出補(bǔ)充測(cè)試的處方和/或進(jìn)行了所述補(bǔ)充測(cè)試。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述補(bǔ)充測(cè)試不為與MAA加合物結(jié)合的抗體的測(cè)量。
70.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述補(bǔ)充測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:心臟組織損傷或高心臟病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)的血液檢查、心電圖、壓力測(cè)試、冠脈MRI和冠狀動(dòng)脈造影。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述血液檢查包括選自以下的一種或多種測(cè)試:肌鈣蛋白1、T-00745、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL、AST、ALT和肌紅蛋白。
72.如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述壓力測(cè)試包括選自以下的一種或多種測(cè)試:運(yùn)動(dòng)耐量測(cè)試、核壓力測(cè)試和壓力超聲波心動(dòng)圖。
73.如權(quán)利要求62-72中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物被開(kāi)出治療的處方和/或被治療。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述治療包括給予藥物。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中所述藥物包括選自以下的一種或多種藥物:他汀類(lèi)、β -受體阻滯劑、硝酸甘油或其他的硝酸鹽、肝素、ACE抑制劑、血管緊張素受體受體阻滯劑(ARB)、阿司匹林和其他的抗血小板、鈣通道阻滯劑以及雷諾嗪。
76.如權(quán)利要求73-75中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療為選自以下的治療:血管成形術(shù)、經(jīng)皮介入(PCI)，包括支架植入、和冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)。
77.如權(quán)利要求62-76中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為非人的哺乳動(dòng)物，且所述生物樣品來(lái)自所述非人的哺乳動(dòng)物。
78.如權(quán)利要求62-76中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人，且所述生物樣品來(lái)自所述人。
79.如權(quán)利要求62-78中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述生物樣品包括選自以下的樣品:全血、血液部分、血漿、血清、組織液、痰/ 口腔液體、尿、組織活檢、胸膜液、心包液、腦脊液和腹膜液。`
80.如權(quán)利要求62-79中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中檢測(cè)抗MAA加合物抗體，在所述分析中，將所述生物樣品分開(kāi)以從至少一種其他的樣品組分中分離包含所述抗體的部分。
81.如權(quán)利要求62-80中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為已知患有或懷疑患有動(dòng)脈粥樣硬化的哺乳動(dòng)物。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物具有選自以下的一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因子:心臟病家族風(fēng)險(xiǎn)、高血壓、高LDL膽固醇和低HDL膽固醇、高甘油三酯、肥胖和糖尿病、煙草使用、代謝綜合征、結(jié)締組織病癥、慢性感染以及炎癥性腸病。
83.如權(quán)利要求62-82中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中確定與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測(cè)量，在所述分析中，抗體和/或所述抗體和MAA加合物之間形成的復(fù)合物變得標(biāo)記有可檢測(cè)標(biāo)記。
84.如權(quán)利要求62-83中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中確定與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測(cè)量，在所述分析中，所述抗體通過(guò)與其他的分析組分形成復(fù)合物由未結(jié)合狀態(tài)變成了結(jié)合狀態(tài)。
85.如權(quán)利要求62-84中任一項(xiàng)所述的方法，其中在分析中確定與MAA加合物結(jié)合的IgG抗體，和/或IgM抗體，和/或IgA抗體的測(cè)量，在所述分析中，最初以可溶相存在的抗體變成了被固定在固相上的抗體。
86.如權(quán)利要求62-85中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用選自以下的分析測(cè)量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平:SDS/PAGE、等電點(diǎn)聚焦、2維凝膠電泳、血凝分析和免疫分析。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其中使用ELISA分析測(cè)量IgG抗體、IgM抗體，和/或IgA抗體中的一種或多種的水平。
88.如權(quán)利要求86-87中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述免疫分析包括: 提供被固定在固相支持體上的MAA加合物； 在這樣的條件下將所述MAA加合物與所述生物樣品接觸，其中所述樣品中的抗MAA加合物抗體與MAA加合物結(jié)合，形成加合物/抗體復(fù)合物；和 將所述復(fù)合物與特異性結(jié)合IgG抗體或IgA抗體，或IgM抗體的檢測(cè)抗體接觸，或者將所述復(fù)合物與結(jié)合任一抗體的檢測(cè)試劑接觸；和 檢測(cè)和/或定量所述結(jié)合的抗體或所述結(jié)合的檢測(cè)試劑。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中 所述檢測(cè)抗體被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上或被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上的另一抗體結(jié)合；和/或所述檢測(cè)試劑被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上和/或所述檢測(cè)試劑被連接到可檢測(cè)標(biāo)記上的抗體結(jié)合；和 所述檢測(cè)和/或定量包括檢測(cè)和/或定量所述可檢測(cè)標(biāo)記。
90.用于評(píng)估哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化的存在和/或預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含含有以下的包裝: MAA蛋白質(zhì)加合物；和 與結(jié)合在所述MAA蛋白質(zhì)加合物`上的IgG抗體特異性結(jié)合的第一試劑，和/或與結(jié)合在所述MAA蛋白質(zhì)加合物的IgM抗體特異性結(jié)合的第二試劑。
91.如權(quán)利要求90所述的試劑盒，還包含與結(jié)合在所述MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgA抗體特異性結(jié)合的第三試劑。
92.如權(quán)利要求90-91中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一試劑包含與結(jié)合在所述MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgG抗體結(jié)合的抗體。
93.如權(quán)利要求90-92中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第二試劑包含與結(jié)合在所述MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgM抗體結(jié)合的抗體。
94.如權(quán)利要求91-93中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第三試劑包含與結(jié)合在所述MAA蛋白質(zhì)加合物上的IgA抗體結(jié)合的抗體。
95.如權(quán)利要求90-94中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述MAA蛋白質(zhì)加合物以被固定在固相支持體上的形式提供。
96.如權(quán)利要求95所述的試劑盒，其中所述固相支持體包括選自以下的材料:塑料、玻璃、石英、凝膠和金屬。
97.如權(quán)利要求95所述的試劑盒，其中所述固相支持體選自:顆粒、測(cè)試條、微量滴定板、ELISA盤(pán)和微流通道或室。
98.如權(quán)利要求90-97中任一項(xiàng)所述的試劑盒，還包含指導(dǎo)材料，所述指導(dǎo)材料教導(dǎo)使用MAA加合物抗體的測(cè)量以評(píng)估不利心臟事件風(fēng)險(xiǎn)，和/或確定哺乳動(dòng)物的預(yù)后，和/或評(píng)估哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，和/或評(píng)估治療方案。
99.如權(quán)利要求90-98中任一項(xiàng)所述的試劑盒，用于評(píng)估不利心臟事件風(fēng)險(xiǎn)、和/或確定哺乳動(dòng)物的預(yù)后，和/或用來(lái)評(píng)估哺乳動(dòng)物中動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，和/或用來(lái)評(píng)估治療方案。
100.治療哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括: 給予所述哺乳動(dòng)物包含抗體的組合物，所述抗體特異性結(jié)合連接到可檢測(cè)標(biāo)記上的MAA加合物或能被可檢測(cè)標(biāo)記選擇性結(jié)合； 檢測(cè)位于所述哺乳動(dòng)物的脈管系統(tǒng)內(nèi)的所述標(biāo)記的位置，其中所述位置指示潛在的不穩(wěn)定斑塊。
101.如權(quán)利要求100所述的方法，其中所述方法還包括治療所述潛在的不穩(wěn)定斑塊。
102.如權(quán)利要求101所述的方法，其中所述治療包括對(duì)所述斑塊位于的區(qū)域進(jìn)行血管成形術(shù)。
103.如權(quán)利要求101-102中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療包括在所述斑塊位于的區(qū)域內(nèi)插入支架。`
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103518135SQ201280022809
【公開(kāi)日】2014年1月15日 申請(qǐng)日期:2012年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月11日
【發(fā)明者】杰弗里·M·蒂勒, 丹尼爾·R·安德森, 邁克爾·J·杜里埃 申請(qǐng)人:內(nèi)布拉斯加大學(xué)董事委員會(huì)