利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病的方法與流程

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病的方法，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)糖尿病腎病。

背景技術(shù)：

糖尿病并發(fā)癥高達(dá)100多種，是目前已知并發(fā)癥最多的一種疾病。糖尿病死亡者有一半以上是心腦血管所致，10％是腎病變所致。因糖尿病截肢的患者是非糖尿病的10～20倍。臨床數(shù)據(jù)顯示，糖尿病發(fā)病后10年左右，將有30％～40％的患者至少會(huì)發(fā)生一種并發(fā)癥，且并發(fā)癥一旦產(chǎn)生，藥物治療很難逆轉(zhuǎn)，因此在預(yù)防與治療糖尿病的同時(shí)，應(yīng)盡早預(yù)防與控制糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。

糖尿病慢性并發(fā)癥主要為大血管病變(心臟病、腎病、腦血管意外及下肢血管病變)、微血管病變(糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病和神經(jīng)病變等)。以累及心、腦、腎等生命器官和危害嚴(yán)重為特點(diǎn)，是糖尿病防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

失控的血糖升高導(dǎo)致的組織損傷是多種糖尿病并發(fā)癥的主要原因，具體的致病機(jī)理主要包括①持續(xù)的高血糖使多種血漿及組織蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖化，形成非酶糖基化終產(chǎn)物而喪失正常生理功能；②高血糖導(dǎo)致醛糖還原酶活性增加，山梨醇代謝旁路增強(qiáng)，其產(chǎn)物多元醇在胞內(nèi)堆積，最終導(dǎo)致水腫和細(xì)胞功能障礙；③高血糖導(dǎo)致血液動(dòng)力學(xué)改變，進(jìn)而組織缺氧，動(dòng)脈血管阻力下降，血管通透性增加組織損傷，發(fā)生病變；④多種激素、細(xì)胞因子激活與異常表達(dá)；⑤氧化應(yīng)激；⑥基因表達(dá)的改變等。

糖尿病腎病是糖尿病慢性微血管病變的一種重要表現(xiàn)，是糖尿病致殘、致死的重要原因。目前，糖尿病腎病的早期診斷主要是微量白蛋白尿的發(fā)生和腎小球?yàn)V過率(gfr)的增加，其他診斷指標(biāo)包括層粘蛋白p1，ⅳ型膠原，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，纖維連接素，轉(zhuǎn)鐵蛋白以及igg4/igg1、唾液酸等。然而微量白蛋白尿并不是糖尿病腎病的特異性標(biāo)志物，糖尿病心血管疾病以及非糖尿病性腎病也會(huì)出現(xiàn)，因此蛋白質(zhì)組學(xué)的方法被用于糖尿病腎病預(yù)測(cè)標(biāo)志物的篩選。尿不同蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果之間重復(fù)性較差，尿調(diào)節(jié)素(uromodulin)，白蛋白(albumin)，β2微球蛋白(β2-microglobulin)以及膠原蛋白片段是在多篇研究中均篩選出的糖尿病腎病的尿液標(biāo)志物。

目前，還沒有通過脂質(zhì)組學(xué)預(yù)測(cè)糖尿病腎病的準(zhǔn)確、快捷的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病的方法，能夠快捷、準(zhǔn)確、高效地預(yù)測(cè)糖尿病腎病。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種針對(duì)中國(guó)人群的利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病的方法。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一組針對(duì)中國(guó)人群的與糖尿病腎病密切相關(guān)的化合物。

為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了以下技術(shù)方案：

一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病的方法，其中，主要包括以下步驟：

步驟1、篩選出正常人組群和糖尿病腎病組群之間vip值大于1的排名前6位的差異性化合物，分別為表1所示：

表1

步驟2、利用邏輯回歸模型1進(jìn)行計(jì)算，得到tc值，所述邏輯回歸模型1的計(jì)算公式為：

tc＝5.324+5.803r67+0.132r749+0.220r751+(-1.502)r754+(-2.680)r1250+(-5.112)r1604；

步驟3、根據(jù)所得tc值進(jìn)行判斷，tc＝0為否；tc＝1為是。

優(yōu)選的是，步驟1中利用opls-da模型對(duì)差異性化合物進(jìn)行篩選，篩選條件vip>1。

優(yōu)選的是，步驟1中篩選的具體方法為：

步驟1.1將樣品進(jìn)行超高效液相色譜和質(zhì)譜分析，得到脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，將正常人組群和糖尿病腎病組群分別計(jì)為ck及sb；

步驟1.2對(duì)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，利用opls-da模型對(duì)ck及sb進(jìn)行s-plot分布得到s形曲線，并進(jìn)行強(qiáng)制分組，計(jì)算影響ck及sb分組的變量重要性，即得vip值；

步驟1.3按照vip值大于1的標(biāo)準(zhǔn)得到77個(gè)化合物，并將該77個(gè)化合物作為與糖尿病腎病相關(guān)度最高的差異性化合物；

步驟1.4將所得77個(gè)化合物按照vip值大小從高到低排列，取前6位，即得步驟1中所述差異性化合物。

優(yōu)選的是，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型2進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型2的計(jì)算公式為：

tc＝5.658+5.698r67+0.377r751+(-2.073)r754+(-2.029)r1250+(-5.073)r1604。

優(yōu)選的是，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型3進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型3的計(jì)算公式為：

tc＝4.22+4.54r67+(-2.14)r1250+(-5.32)r1604。

本發(fā)明至少包括以下有益效果：

本發(fā)明通過脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)血液中所有的脂質(zhì)，從而有針對(duì)性地篩選出和血脂密切相關(guān)的脂質(zhì)化合物，并能夠通過提前發(fā)現(xiàn)變化的脂質(zhì)來(lái)進(jìn)行糖尿病所引起的腎病，從而進(jìn)行一定的干預(yù)和預(yù)防措施。

通過篩選，首次發(fā)現(xiàn)與糖尿病腎病密切相關(guān)的6個(gè)脂質(zhì)化合物，即與糖尿病腎病相關(guān)的脂質(zhì)生物標(biāo)志物，并通過構(gòu)建邏輯回歸模型，得到根據(jù)這些脂質(zhì)標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病的方法，快捷方便，準(zhǔn)確度高。通過aic值初步判斷，并進(jìn)行roc曲線繪制，準(zhǔn)確度高達(dá)96.3％。

本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中所述的opls-da模型的s-plot分布圖；

圖2為本發(fā)明中利用opls-da模型對(duì)ck和sb進(jìn)行強(qiáng)制分組的結(jié)果；

圖3為本發(fā)明中用來(lái)考察篩選出的化合物的火山圖；

圖4為本發(fā)明中roc曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。

應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。

一種利用脂質(zhì)生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病的方法，其中，主要包括以下步驟：

步驟1、篩選出正常人組群和糖尿病腎病組群之間vip值大于1的排名前6位的差異性化合物，分別為表1所示：

表1

步驟2、利用邏輯回歸模型1進(jìn)行計(jì)算，得到tc值，所述邏輯回歸模型1的計(jì)算公式為：

tc＝5.324+5.803r67+0.132r749+0.220r751+(-1.502)r754+(-2.680)r1250+(-5.112)r1604；

步驟3、根據(jù)所得tc值進(jìn)行判斷，tc＝0為否；tc＝1為是。

一個(gè)優(yōu)選方案中，步驟1中利用opls-da模型對(duì)差異性化合物進(jìn)行篩選，篩選條件vip>1。

一個(gè)優(yōu)選方案中，步驟1中篩選的具體方法為：

步驟1.1將樣品進(jìn)行超高效液相色譜和質(zhì)譜分析，得到脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，將正常人組群和糖尿病腎病組群分別計(jì)為ck及sb；

步驟1.2對(duì)脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，利用opls-da模型對(duì)ck及sb進(jìn)行s-plot分布得到s形曲線，并進(jìn)行強(qiáng)制分組，計(jì)算影響ck及sb分組的變量重要性，即得vip值；

步驟1.3按照vip值大于1的標(biāo)準(zhǔn)得到77個(gè)化合物，并將該77個(gè)化合物作為與糖尿病腎病相關(guān)度最高的差異性化合物；

步驟1.4將所得77個(gè)化合物按照vip值大小從高到低排列，取前6位，即得步驟1中所述差異性化合物。

一個(gè)優(yōu)選方案中，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型2進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型2的計(jì)算公式為：

tc＝5.658+5.698r67+0.377r751+(-2.073)r754+(-2.029)r1250+(-5.073)r1604。

一個(gè)優(yōu)選方案中，步驟2中tc值或者用邏輯回歸模型3進(jìn)行計(jì)算，所述邏輯回歸模型3的計(jì)算公式為：

tc＝4.22+4.54r67+(-2.14)r1250+(-5.32)r1604。

本發(fā)明通過篩選，首次發(fā)現(xiàn)與糖尿病腎病相關(guān)的一組化合物，即與糖尿病腎病相關(guān)的脂質(zhì)生物標(biāo)志物，并通過構(gòu)建邏輯回歸模型，得到根據(jù)這些脂質(zhì)標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病腎病的方法，快捷方便，準(zhǔn)確度高。通過aic值初步判斷，并進(jìn)行roc曲線繪制，準(zhǔn)確度高達(dá)96.3％。

實(shí)施例1

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象(均選自中國(guó)人)：59例糖尿病患者(無(wú)其他并發(fā)癥)，19例糖尿病腎病患者，抽取靜脈血5ml。準(zhǔn)確量取100μl的血液，加入0.9ml的提取液(100％異丙醇)，轉(zhuǎn)入2ml離心管中，漩渦振蕩10s以上，超聲10min，然后在-20度冰箱中冷凍1小時(shí)，取出后在室溫下漩渦振蕩，用冷凍離心機(jī)10000rpm離心10min，然后取上清液1ml到玻璃進(jìn)樣瓶中，保存在冰箱中待測(cè)。

2.主要儀器

2.1.1冷凍離心機(jī)：型號(hào)d3024r，scilogex公司，美國(guó)

2.1.2漩渦振蕩器：型號(hào)mx-s，scilogex公司，美國(guó)

2.1.3高分辨質(zhì)譜儀：esi-qtof/ms；型號(hào)：xevog2-sq-tof；廠家：waters

2.1.4超高效液相色譜：uplc；型號(hào)：acquityuplci-class系統(tǒng)；廠家：waters

2.1.4數(shù)據(jù)采集軟件：masslynx4.1；廠家：waters

2.1.5分析鑒定軟件：progenesisqi；廠家：water

2.1.6作圖軟件：ezinfo；hemi；simca-p

3.主要試劑

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨、亮氨酸腦啡肽、甲酸鈉。廠家均為fisher。

4.實(shí)驗(yàn)設(shè)置

以提取液(100％異丙醇)作為空白對(duì)照(blank)樣品；從每個(gè)樣品的進(jìn)樣品種取出100μl混合到新的進(jìn)樣品種作為質(zhì)控(qc)樣品；正式樣品按照每組樣品間隔進(jìn)樣，例如先是blank1，然后是qc1，然后是w1，然后是w2這個(gè)順序，然后再進(jìn)行下一輪進(jìn)樣。

液相方法

色譜柱：acquityuplccshc18column,1.7μm,1mmx50mm,1/pkg[186005292]；

柱溫：55度

流速：0.4ml/min

流動(dòng)相：

a：acn/h2o(60％/40％)，含有10mm甲酸銨和0.1％甲酸

b：ipa/acn(90％/10％)，含有10mm甲酸銨和0.1％甲酸

(注：acn為乙腈，ipa為異丙醇)

進(jìn)樣體積：0.2μl

洗脫程序：

質(zhì)譜方法

數(shù)據(jù)采集方式：mse；分子量掃描范圍：50-1500m/z；分辨率模式(輪廓圖)。

正負(fù)離子模式各采集一次。

離子源：電噴霧電離源(esi)

毛細(xì)管電壓：3kv

錐孔電壓為：25v

碰撞能：15-60v

源溫度：120度

脫溶劑溫度：500度

錐孔氣體速度：50l/h

脫溶劑氣體速度：500l/h

掃描時(shí)間：0.2s

使用亮氨酸腦啡肽(m/z556.2771，正離子；554.2615，負(fù)離子)進(jìn)行實(shí)時(shí)校正。使用甲酸鈉進(jìn)行校正。

脂質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

progenesisqi軟件(waters,massachusetts,usa)用于結(jié)果分析，抽提非靶向脂質(zhì)分子的特征峰，進(jìn)行比對(duì)和篩選。同時(shí)，用qc(quantifyingcontrol)和blank(空白)來(lái)篩選背景數(shù)據(jù)。最終的數(shù)據(jù)，導(dǎo)入ezinfo3.0，并進(jìn)行principalcomponentanalysis(pca)分析,orthogonalsignalcorrectionpartialleastsquarediscriminationanalysis(opls-da)建模,variableimportanceinprojection(vip)的計(jì)算，同時(shí)得到s-plot和火山圖(coefficientsvs.vipspots)。其中，邏輯回歸模型以及roc曲線通過r語(yǔ)言進(jìn)行建設(shè)和繪制。

結(jié)果描述

糖尿病(無(wú)其他并發(fā)癥)與糖尿病腎病人群脂質(zhì)差異物質(zhì)的鑒定。

首先建立opls-da模型，對(duì)糖尿病(無(wú)其他并發(fā)癥)(ck)和糖尿病腎病(sb)組群進(jìn)行分類，并研究造成他們出現(xiàn)差異的原因?？吹皆趏pls-da模型中，利用相關(guān)性(correlation)和協(xié)方差(covarience)的p值作出的s-plot形成了s形曲線，如圖1所示，更多的差異脂質(zhì)顯示有極大的升高。

利用opls-da將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行強(qiáng)制分組，分組結(jié)果如圖2所示。

計(jì)算影響ck和sb分組的變量重要性，即vip(variableimportanceinprojection)值。一共篩選到vip值大于1的77個(gè)化合物。

通過vip>1篩選出來(lái)的化合物在s-plot上用紅色方框標(biāo)出，發(fā)現(xiàn)他們均勻的分布在兩側(cè)。同時(shí)，利用火山圖，來(lái)考察篩選出的化合物的分布，如圖3所示，發(fā)現(xiàn)篩選出來(lái)的化合物都分布在火山圖的外圍。這些結(jié)果都說明，借由opls-da模型，成功篩選出造成ck和sb差異的化合物。

建立邏輯回歸模型以及roc曲線。

對(duì)脂質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作(rproject：scale)。然后將vip>1的排名前6的數(shù)據(jù)提取出來(lái)，建立邏輯回歸模型和roc曲線。

公式中，tc：是否患有腎病，0為否，1為是。

模型1：tc＝5.324+5.803r67+0.132r749+0.220r751+(-1.502)r754+(-2.680)r1250+(-5.112)r1604

模型2：tc＝5.658+5.698r67+0.377r751+(-2.073)r754+(-2.029)r1250+(-5.073)r1604

模型3：tc＝4.22+4.54r67+(-2.14)r1250+(-5.32)r1604

針對(duì)以上三個(gè)邏輯回歸模型，進(jìn)行roc曲線繪制，如圖4所示，模型1為m1，auc值達(dá)到0.963；模型2為m2，auc值為0.957；模型3為m3，auc值達(dá)到0.915。我們發(fā)現(xiàn)模型1最靠近左上角定點(diǎn)，同時(shí)auc值最高，最終，確定模型1為基于脂質(zhì)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)糖尿病血脂異常較好的預(yù)測(cè)模型。也可以根據(jù)所測(cè)樣品數(shù)據(jù)情況，選擇模型2或者模型3進(jìn)行計(jì)算預(yù)測(cè)，或者優(yōu)先選擇模型1進(jìn)行計(jì)算，同時(shí)使用2和3模型進(jìn)行輔助驗(yàn)證，協(xié)同分析預(yù)測(cè)。

本發(fā)明利用opls-da模型，首次發(fā)現(xiàn)與糖尿病腎病相關(guān)的6個(gè)biomarker。利用邏輯回歸模型以及roc曲線，首次提出了基于脂質(zhì)生物標(biāo)志物的糖尿病腎病預(yù)測(cè)模型。

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。