專利名稱：GHSR1a激動(dòng)劑藥物的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的篩選方法，尤其涉及一種GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
近年來，生長(zhǎng)激素促分泌素受體la (growth hormone secretagogue receptor,GHSRI a)選擇性配體的研發(fā)成為熱點(diǎn)，已經(jīng)證明有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。GHSRla激動(dòng)劑能夠刺激食欲和生長(zhǎng)激素釋放，因而可以用于厭食癥和惡病質(zhì)的治療，GHSRla激動(dòng)劑還具有抗炎、抗氧化、抑制凋亡、調(diào)節(jié)睡眠和記憶等功能，有可能用于治療與老年或退行性疾病相關(guān)的肌肉萎縮癥等等。根據(jù)其作用機(jī)制建立敏感穩(wěn)定的GHSRla選擇性激動(dòng)劑的動(dòng)物篩選模型就顯得尤為重要。然而生長(zhǎng)激素的分泌受多種環(huán)境，病理或非病理因素的影響因而并不穩(wěn)定。例如外界因素刺激(溫度，噪音，異物接觸等)手 術(shù)應(yīng)激、熱源或大劑量血管加壓素的使用都能刺激生長(zhǎng)激素的分泌，干擾篩選效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，就是為了提供一種GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法，包括以下步驟I)確定目標(biāo)藥物，以雄性小鼠為給藥對(duì)象；2)給藥前多次預(yù)刺激雄性小鼠以穩(wěn)定其體內(nèi)的基礎(chǔ)生長(zhǎng)激素水平；3)對(duì)雄性小鼠按lmg/kg體重的劑量給藥；4)于給藥后5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、180分鐘和300分鐘各取30 μ L血樣；5)每份30 μ L血樣分別分離出10 μ L血衆(zhòng)，分別使用Rat/Mouse GH ELISA試劑盒測(cè)定各份血漿中生長(zhǎng)激素含量，建立目標(biāo)藥物的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線；6)用生理鹽水作為對(duì)照按上述步驟2)-5)建立生理鹽水的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線；7)對(duì)比目標(biāo)藥物的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線和生理鹽水的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線，如果目標(biāo)藥物的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線下的面積AUCf相對(duì)于生理鹽水的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線下的面積AUCf的增加率大于50%，則目標(biāo)藥物為GHSRla激動(dòng)劑藥物。所述的預(yù)刺激為對(duì)尾靜脈進(jìn)行假取血刺激。所述的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線下的面積AUCf為以給藥時(shí)的時(shí)間為0，至給藥后300分鐘這一段時(shí)間內(nèi)曲線下的面積。所述的給藥為腹腔注射。所述的多次預(yù)刺激為3-5次。本發(fā)明GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法采取給藥前多次假采血的手段，建立了穩(wěn)定敏感可重復(fù)的GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選模型，可提供在動(dòng)物體內(nèi)篩選GHSRla激動(dòng)劑藥物的可靠和有效的方法。


圖I是無預(yù)先處理，直接給予GHSRla激動(dòng)劑生長(zhǎng)激素釋放肽時(shí)血漿中的生長(zhǎng)激素分泌情況；圖2是有無預(yù)先處理對(duì)生長(zhǎng)激素分泌的影響對(duì)比；圖3是使用GHSRla激動(dòng)劑生長(zhǎng)激素釋放肽對(duì)此方法進(jìn)行驗(yàn)證；圖4、圖5是用本發(fā)明的方法考察GHSRla激動(dòng)劑生長(zhǎng)激素釋放肽量效關(guān)系圖。
具體實(shí)施方式

一、動(dòng)物飼養(yǎng)雄性C57/BL6J小鼠，20 25g，動(dòng)物SPF級(jí)飼養(yǎng)，室溫22. 7 ± O. 8 °C，濕度60 %，采用12 12小時(shí)晝夜循環(huán)。進(jìn)場(chǎng)后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分組，每組6只，每籠2只。動(dòng)物使用嚴(yán)格遵守動(dòng)物飼養(yǎng)和使用倫理標(biāo)準(zhǔn)。二、生長(zhǎng)激素分泌的穩(wěn)定方法的建立兩組動(dòng)物，分別給予GHSRla激動(dòng)劑生長(zhǎng)激素釋放肽(lmg/kg，腹腔注射)或生理鹽水作為溶劑對(duì)照。兩組于給藥后5，15，30，60及180分鐘取血30 μ L。分離IOyL血漿，使用Rat/Mouse GH ELISA試劑盒測(cè)定血漿中生長(zhǎng)激素含量。結(jié)果如圖I所示，顯示由于小鼠應(yīng)激狀態(tài)下基礎(chǔ)生長(zhǎng)激素水平不穩(wěn)定，使GHSRla激動(dòng)劑的作用難以被準(zhǔn)確判斷。所以，我們將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為兩組，每組6只，均給予生理鹽水腹腔注射。一組于給藥前-60、-45和-30分鐘對(duì)尾靜脈進(jìn)行假取血刺激以模擬應(yīng)激狀態(tài)；另一組給藥前不刺激，兩組都于給藥后5，15，30，60，180及300分鐘取血30 μ L。分離10 μ L血漿，使用Rat/MouseGH ELISA試劑盒測(cè)定血漿中生長(zhǎng)激素含量。結(jié)果如圖2所示，證實(shí)尾靜脈假取血刺激可以穩(wěn)定生長(zhǎng)激素基礎(chǔ)水平。三、穩(wěn)定GHSRla激動(dòng)劑藥物篩選方法的驗(yàn)證兩組動(dòng)物，分別給予GHSRla激動(dòng)劑生長(zhǎng)激素釋放肽(lmg/kg，腹腔注射)和生理鹽水。兩組均于給藥前-60、-45和-30分鐘取血，并于給藥時(shí)(O分鐘)和給藥后后5，15，30，60，180及300分鐘取血30 μ L。分離10 μ L血漿，使用Rat/MouseGH ELISA試劑盒測(cè)定血漿中生長(zhǎng)激素含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，證實(shí)進(jìn)行取血刺激可以穩(wěn)定生長(zhǎng)激素基礎(chǔ)水平，使GHSRla激動(dòng)劑促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌這一現(xiàn)象很容易被觀察到，并使這一方法可用于藥物篩選。四、穩(wěn)定GHSRla激動(dòng)劑藥物篩選方法的應(yīng)用實(shí)例GHSRla激動(dòng)劑生長(zhǎng)激素釋放肽量效關(guān)系評(píng)價(jià)四組動(dòng)物，分別給予GHSRla激動(dòng)劑生長(zhǎng)激素釋放肽O. 2、I及5mg/kg和生理鹽水對(duì)照腹腔注射給藥。四組均于給藥前-60、-45和-30分鐘假取血以穩(wěn)定基礎(chǔ)生長(zhǎng)激素水平，并于給藥后5，15，30，60，180及300分鐘取血30 μ L。分離10 μ L血漿，使用Rat/MouseGH ELISA試劑盒測(cè)定血漿中生長(zhǎng)激素含量。由圖4可知，使用該方法，陽(yáng)性藥生長(zhǎng)激素釋放肽能夠劑量依賴性地促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌。低、中、高三個(gè)劑量的生長(zhǎng)激素釋放肽分別將生長(zhǎng)激素濃度時(shí)間曲線下面積AUC0 300提高98 %，163 %和307 %。從而可知，該方法可以成功的應(yīng)用于GHSRla激動(dòng)劑的量效關(guān)系分析。在篩選新的藥物時(shí)，可以將生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線下面積AUCf提高率大于 50% (相對(duì)于生理鹽水對(duì)照組)的藥物挑選出來，作為可能的GHSRla激動(dòng)劑藥物進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
權(quán)利要求
1.ー種GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 1)確定目標(biāo)藥物，以雄性小鼠為給藥對(duì)象； 2)給藥前多次預(yù)刺激雄性小鼠以穩(wěn)定其體內(nèi)的基礎(chǔ)生長(zhǎng)激素水平； 3)對(duì)雄性小鼠按lmg/kg體重的劑量給藥； 4)于給藥后5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、180分鐘和300分鐘各取30μ L血樣； 5)每份30μ L血樣分別分離出10 μ L血漿，分別使用Rat/Mouse GH ELISA試劑盒測(cè)定各份血漿中生長(zhǎng)激素含量，建立目標(biāo)藥物的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線； 6)用生理鹽水作為對(duì)照按上述步驟2)-5)建立生理鹽水的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線； 7)對(duì)比目標(biāo)藥物的血漿生長(zhǎng)激素濃度-吋間曲線和生理鹽水的血漿生長(zhǎng)激素濃度-吋間曲線，如果目標(biāo)藥物的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線下的面積AUC卜·相對(duì)于生理鹽水的血漿生長(zhǎng)激素濃度-吋間曲線下的面積AUCtl的増加率大于50%，則目標(biāo)藥物為GHSRla激動(dòng)劑藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法，其特征在于所述的預(yù)刺激為對(duì)尾靜脈進(jìn)行假取血刺激。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法，其特征在于所述的血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線下的面積AUCc^■為以給藥時(shí)的時(shí)間為0，至給藥后300分鐘這ー段時(shí)間內(nèi)曲線下的面積。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法，其特征在于所述的給藥為腹腔注射。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的GHSRla激動(dòng)劑藥物的篩選方法，其特征在于所述的多次預(yù)刺激為3-5次。
全文摘要
一種GHSR1a激動(dòng)劑藥物的篩選方法，主要包括以下步驟1)給藥前多次預(yù)刺激以穩(wěn)定基礎(chǔ)生長(zhǎng)激素水平；2)給藥后5，15，30，60，180及300分鐘取血30μL；3)分離10μL血漿，使用Rat/Mouse GH ELISA試劑盒測(cè)定血漿中生長(zhǎng)激素含量；4)挑選出使血漿生長(zhǎng)激素濃度-時(shí)間曲線下面積升高率大于50％的藥物。本發(fā)明GHSR1a激動(dòng)劑藥物的篩選方法采取給藥前多次假采血的手段，建立了穩(wěn)定敏感可重復(fù)的GHSR1a激動(dòng)劑藥物的篩選模型，可提供在動(dòng)物體內(nèi)篩選GHSR1a激動(dòng)劑藥物的可靠和有效的方法。
文檔編號(hào)G01N33/00GK102818878SQ20121020159
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者張寶弘, 高煒煒 申請(qǐng)人:輝源生物科技(上海)有限公司