專利名稱：樟芝子實(shí)體三萜類組合物、制備與分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及一種樟芝子實(shí)體組合物，本申請尤其涉及一種樟芝子實(shí)體三萜類組合物，以及該三萜類組合物的制備方法與分析方法。
背景技術(shù)：
樟芝(Androdia cinnamomea)又稱樟燕、牛樟燕、牛樟芝等,為臺(tái)灣特有的真菌菌種，生長于海拔400至2000公尺特有的牛樟樹(Cinnamomum kanehirai)樹干腐朽的心材內(nèi)壁，或枯死倒伏的牛樟木材陰暗潮濕的表面。因此，要尋找到野生的樟芝子實(shí)體(fruitingbody)或確認(rèn)此多孔菌目(Aphyllophorales)真菌菌株的外觀并不容易，也由于其生物活性成分具潛在的醫(yī)藥價(jià)值，因此樟芝的價(jià)格居高不下。由于樟芝子實(shí)體不易被發(fā)現(xiàn)和以人工方式培養(yǎng)，因此目前市面上多為樟芝菌絲體(mycelia)產(chǎn)品，其宣稱具有抗癌、減少治療引起的癥狀及其他副作用。此外，樟芝菌絲體產(chǎn)品也被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化、抗過敏、免疫刺激效果(Liu等人，2007)。這些產(chǎn)品宣稱具有與樟芝子實(shí)體相似的主要成分，包括具有細(xì)胞毒性的三職類(triterpenes)、類固醇(steroid)及具有免疫刺激性的多糖體等(Chen等人，1995 ；Yang等人，1996)。傳統(tǒng)上，樟芝被應(yīng)用于健康食品，以避免發(fā)炎、過敏、皮膚癬、肝癌的發(fā)生，因此，樟芝菌絲體及子實(shí)體萃取物被認(rèn)為是具有潛力的化學(xué)治療藥物，以對抗肝癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌細(xì)胞等(Chen 等人,2007 ;Hsu 等人,2007 ;Peng 等人,2007 ;Shetty 等人,2005 ；ffu等人，2006)，但各類有效成分的活性機(jī)制與抑制癌癥能力并未被完整理清及探討。此外，中華民國專利號1299665揭露了樟芝萃取物及其制備方法，其以乙醇萃取樟芝菌絲體獲得多糖體，用以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，但并非以樟芝子實(shí)體進(jìn)行萃取，其產(chǎn)物也未能抑制癌細(xì)胞的生長；中華民國專利號1279439揭露了以樟芝菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，通過調(diào)整培養(yǎng)時(shí)的酸堿值獲得培養(yǎng)物，并未揭露萃取方法；而中華民國專利號591110揭露了由樟芝菌絲體萃取出Y -氨基丁酸，其先冷凍干燥樟芝菌絲體，再以水或有機(jī)溶劑萃取。上述這些發(fā)明都沒有以樟芝子實(shí)體進(jìn)行有機(jī)溶劑或水萃取，而且未鑒定出其所內(nèi)含的指標(biāo)性二次代謝化合物。再者，前述發(fā)明也并未公開樟芝子實(shí)體所含有的三萜類組合物或其他組成份。本申請的申請人鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，經(jīng)過悉心試驗(yàn)與研究，并本著鍥而不舍的精神，最終構(gòu)思出本申請“樟芝子實(shí)體三萜類組合物、制備與分析方法”，能夠克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，以下為本申請的簡要說明。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)無法有效分離樟芝子實(shí)體(或菌絲體)或樟芝萃取物中的組合物，并確定該組合物的立體結(jié)構(gòu)的問題，本發(fā)明以高效液相色譜及核磁共振圖譜等技術(shù)分離、純化、解析出樟芝子實(shí)體中麥角留燒(ergostane)及羊毛留燒(Ianostane)三職類組合物，及它們的立體結(jié)構(gòu)式和含量。通過現(xiàn)有技術(shù)，可以檢測藥品、保健食品或其他商品中是否含有麥角留烷及羊毛留烷三萜類組合物，及它們的含量。 本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括如下文所揭示的有效劑量的式I 式VI及式VIII 式IX中的一種的麥角留烷三萜類組合物。而麥角留烷三萜類組合物是從樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物(以下簡稱乙酸乙酯萃取物)中分離。為了得到乙酸乙酯萃取物，以乙醇溶液、正己烷溶液及乙酸乙酯溶液依次對樟芝子實(shí)體進(jìn)行萃取。麥角留烷三萜類組合物經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有殺死血癌細(xì)胞的活性。本發(fā)明另提供一種制備麥角留烷三萜類組合物的方法，其對乙酸乙酯萃取物進(jìn)行層析，獲得麥角留烷三萜類組合物，其中該麥角留烷三萜類組合物包括下文揭示的式I至式X的組合物(或稱為立體異構(gòu)體純的化合物)。進(jìn)一步而言，該層析步驟還包括使用高效液相色譜柱，在流動(dòng)相溶劑為乙腈與含酸水的條件下分離麥角留烷三萜類組合物，獲得麥角留烷三萜類組合物的立體異構(gòu)體純的化合物。此外，該層析步驟還可獲得羊毛留烷三萜類組合物。麥角留烷三萜類組合物包括樟芝酸A、樟芝酸B、樟芝酸C、antcin A、antcin C和/或antcin K,而羊毛甾燒三職類組合物包括下文所揭示的去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenic acid,式XI)、硫色多孔菌酸(sulphurenic acid,式XII) >15 α -乙?；?去氫硫色多孔菌酸(15a-acetyl-dehydrosulphurenic acid,式 XIII)、變孑L孑L菌酸(versisponic acid D,式 XIV)、去氫齒孔酸(dehydroeburicoic acid,式 XV)和 / 或齒孔酸(eburicoic acid,式XVI)。本發(fā)明另提供一種方法，用以檢測樟芝子實(shí)體中至少一種麥角留烷三萜類立體異構(gòu)體純的化合物的含量，該方法包括下列步驟萃取樟芝子實(shí)體，獲得乙酸乙酯萃取物，以1H核磁共振圖譜儀檢測乙酸乙酯萃取物，確定乙酸乙酯萃取物中是否具有至少一種麥角甾烷三萜類組合物。當(dāng)出現(xiàn)該至少一種麥角留烷三萜類組合物時(shí)，以高效液相色譜儀檢測乙酸乙酯萃取物中該至少一種麥角留烷三萜類立體異構(gòu)體純的化合物的含量。進(jìn)一步而言，前述檢測步驟還包括以1H核磁共振圖譜儀檢測該至少一種麥角甾烷三萜類組合物的28位的亞甲基信號。再者，該檢測方法還用以同時(shí)檢測樟芝子實(shí)體中至少一羊毛留烷三萜類組合物的含量，包括步驟以1H核磁共振圖譜儀檢測乙酸乙酯萃取物，確定該至少一種羊毛留烷三萜類組合物是否出現(xiàn)；以及當(dāng)出現(xiàn)該至少一羊毛留烷三萜類組合物時(shí)，以高效液相色譜儀檢測該至少一種羊毛留烷三萜類組合物的含量。1H核磁共振圖譜儀的檢測是檢測該至少一種羊毛留烷三萜類組合物的28位的亞甲基信號。而高效液相色譜儀包括使用全波長檢測器、單波長檢測器和/或串聯(lián)質(zhì)譜儀所組合的檢測器。本發(fā)明另提供一種分離化合物的立體異構(gòu)體的方法，該化合物的羧基的α位置具有不對稱中心，該方法包括計(jì)算化合物的PKa值(表示為a值)；調(diào)整分離溶媒的pH值為b值，該b值之范圍為a-1. 5彡b彡a+1. 5，且I. O彡b < 7 ;以及以該分離溶媒層析該化合物，以分離出該化合物中的立體異構(gòu)體。本發(fā)明另提出一種檢測待測萃取物中麥角留烷三萜類組合物的方法，包括下列步驟以樟芝酸A的不同濃度樣本為標(biāo)準(zhǔn)品制作核磁共振圖譜及檢量線；以核磁共振圖譜儀分析待測萃取物中麥角留烷三萜類組合物的28位的亞甲基信號；以及比對檢量線及28位的亞甲基信號，由28位的亞甲基信號的積分面積比計(jì)算待測萃取物中麥角留烷三萜類組合物的含量。參照前述檢測方法，本發(fā)明另提出一種檢測待測萃取物中羊毛留烷三萜類組合物的方法，包括下列步驟以去氫齒孔酸的不同濃度樣本為標(biāo)準(zhǔn)品制作核磁共振圖譜及檢量線；以核磁共振圖譜 儀分析待測萃取物中羊毛留烷三萜類組合物的28位的亞甲基信號；以及比對檢量線及28位的亞甲基信號，由28位的亞甲基信號的積分面積比計(jì)算待測萃取物中羊毛留烷三萜類組合物的含量。本發(fā)明另提出一種分析樟芝子實(shí)體中麥角留烷三萜類立體異構(gòu)體純的化合物的方法，包括步驟以高效液相色譜柱層析乙酸乙酯萃取物，以分離出立體異構(gòu)體混合物；以及依據(jù)麥角留烷三萜類立體異構(gòu)體純的化合物的1H核磁共振圖譜、高效液相色譜柱層析的保留時(shí)間及旋光數(shù)據(jù)來判斷麥角留烷三萜類立體異構(gòu)體純的化合物的25位在結(jié)構(gòu)上為R構(gòu)型或S構(gòu)型。


圖I為本發(fā)明的樟芝子實(shí)體乙酸乙酯萃取物的制備方法流程圖。圖2為樟芝酸A立體異構(gòu)體混合物的高效液相色譜的再循環(huán)色譜圖譜。圖3為從樟芝酸A立體異構(gòu)體混合物分離取得的純的化合物E9以及化合物ElO的色譜圖譜。圖4為自antcin C立體異構(gòu)體混合物分離取得純的化合物E3以及化合物E4的色譜圖譜。圖5為自樟芝酸C立體異構(gòu)體混合物分離取得純的化合物E5以及化合物E6的色譜圖譜。圖6 (a)至圖6 (c)分別為(a)樟芝酸A、(b)化合物E9及(C)化合物ElO溶于C5D5N在600MHz的1H核磁共振圖譜。圖7 (a)至圖7 (c)分別為(a)樟芝酸A、(b)化合物E9及(C)化合物ElO溶于C5D5N在150MHz的13C核磁共振圖譜。圖8(a)與圖8(b)分別為(a)酯類合成化合物E9-1RAT及(b)酯類合成化合物E9-1SAT的化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖。圖9為依據(jù)麥角甾烷三萜類(IR)-及(1S)-1_(9-蒽基)-2，2，2_三氟乙醇酯類合成物的1H核磁共振化學(xué)位移的差值判定的結(jié)構(gòu)25位的絕對立體構(gòu)型的示意圖。圖10為樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物于不同有機(jī)酸(O. 1%的三氟乙酸、O. 1%的甲酸以及O. 1%的乙酸)為流動(dòng)相條件下，于254nm波長的高效液相色譜圖譜。圖11為樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物于O. I %乙酸為流動(dòng)相條件下，高效液相色譜圖譜中各波峰所代表的化合物對照，檢測波長為254nm。圖12(a)與圖12(b)分別為樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物于(a)以乙酸銨調(diào)整pH值為3. 75以及4. O、(b)以乙酸銨調(diào)整pH值為4. 25,4.5以及5. O和流動(dòng)相為O. I %乙酸條件下(pH值為3. 3)的高效液相色譜圖譜比較，檢測波長為254nm。圖13為優(yōu)化的分析條件下高效液相色譜圖中各波峰所代表的化合物對照。圖14(a)至圖14(f)分別為(a)化合物E1、E2與antcin K、(b)化合物E3、E4與antcin C、(c)化合物E5、E6與樟芝酸C、(d)化合物E7、E8與樟芝酸B、(e)化合物E9、E10與樟芝酸A及(f)化合物E11、E12與antcin A于254nm波長的高效液相色譜圖譜。圖15(a)與圖15(b)分別為(a)樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品吡嗪溶于DMS0-d6在400MHz的1H核磁共振圖譜、(b)樟芝酸A與去氫齒孔酸的28位的亞甲基特征信號放大圖。
具體實(shí)施例方式本申請?zhí)岢龅摹罢林プ訉?shí)體三萜類組合物、制備與分析方法”將可由以下 的實(shí)施例說明而得到充分了解，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可以據(jù)此完成，然而本申請的實(shí)施并非由下列實(shí)施例限制其實(shí)施方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員仍可依據(jù)示例性實(shí)施例的精神推演出其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例為方便說明本發(fā)明所萃取的麥角留烷(ergostane)三萜類組合物El E12，在此先將組合物El E12對應(yīng)的結(jié)構(gòu)式(式I至式X)及其高效液相色譜圖對應(yīng)的波峰詳列如下。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，包括有效劑量的式I的麥角留烷三萜類組合物
2.一種藥物組合物，包括有效劑量的式II的麥角留烷三萜類組合物
3.—種藥物組合物，包括有效劑量的式III的麥角留烷三萜類組合物
4.一種藥物組合物，包括有效劑量的式IV的麥角留烷三萜類組合物
5.一種藥物組合物，包括有效劑量的式V的麥角留烷三萜類組合物
6.一種藥物組合物，包括有效劑量的式VI的麥角留烷三萜類組合物
7.—種藥物組合物，包括有效劑量的式VIII的麥角留烷三萜類組合物
8.—種藥物組合物，包括有效劑量的式IX的麥角留烷三萜類組合物
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中該麥角留烷三萜類組合物是從樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物中分離。
10.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中該麥角留烷三萜類組合物具有殺死血癌細(xì)胞的活性。
11.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物通過依次以乙醇溶液、正己烷溶液和乙酸乙酯溶液萃取樟芝子實(shí)體而獲得。
12.—種制備麥角留烷三萜類組合物的方法，包括 提供樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物；且 層析該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物，以獲得該麥角留烷三萜類組合物，其中該麥角甾烷三萜類組合物選自由3a，40，70_三羥基-4a-甲基麥角甾烷_8，24 (28) - 二烯-11-酮-25S-26-酸、3 a，43，7@-三羥基_4 0-甲基麥角甾烷-8,24(28)- 二烯-11-酮-25R-26-酸、70-羥基-4a-甲基麥角甾烷 _8，24 (28) - 二烯 _3，11-二酮-25S-26-酸、7 P -羥基-4 a -甲基麥角留烷 _8，24 (28) - 二烯-3，11- 二酮-25R-26-酸、3a，12 a-二羥基-4 a -甲基麥角甾烷-8，24 (28) - 二烯 _7，11-二酮-25R-26-酸、3 a，12 a - 二羥基-4 a -甲基麥角甾烷-8，24 (28) -二烯 _7，11- 二酮-25S-26-酸、3 a -羥基-4 a -甲基麥角甾烷-8，24 (28) -二烯_7，11- 二酮_26_酸、4 a -甲基麥角甾烷-8，24(28) - 二烯-3,7,11-三酮-25S-26-酸、4 a -甲基麥角甾烷 _8，24 (28) - 二烯-3，7，11-三酮-25R-26-酸、4 a -甲基麥角留烷_8，24 (28) -二烯-3，11- 二酮-26-酸及其組合組成的組之一。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物通過依次以乙醇溶液、正己烷溶液和乙酸乙酯溶液萃取樟芝子實(shí)體而獲得。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該層析步驟還可獲得羊毛留烷三萜類組合物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該羊毛留烷三萜類組合物選自由去氫硫色多孔菌酸、硫色多孔菌酸、15 a -乙酰基-去氫硫色多孔菌酸、變孔孔菌酸、去氫齒孔酸、齒孔酸及其組合組成的組之一。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該層析步驟還包括 使用高效液相色譜柱，在流動(dòng)相溶劑為乙腈與含酸水的條件下分離該麥角留烷三萜類組合物，獲得麥角留烷三萜類組合物的立體異構(gòu)體純的化合物。
17.一種用以檢測樟芝子實(shí)體中至少一種麥角留烷三萜類立體異構(gòu)體純的化合物的含量的方法，該方法包括下列步驟萃取該樟芝子實(shí)體，獲得該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物； 以1H核磁共振圖譜儀檢測該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物，確定該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物中是否具有該至少一種麥角留烷三萜類組合物；以及 當(dāng)該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物中具有該至少一種麥角留烷三萜類組合物時(shí)，以高效液相色譜儀檢測該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物中該至少一種麥角留烷三萜類立體異構(gòu)體純的化合物的含量。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中該萃取步驟依次以乙醇溶液、正己烷溶液和乙酸乙酯溶液萃取該樟芝子實(shí)體，而獲得該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，還包括以該1H核磁共振圖譜儀檢測該至少一種麥角甾烷三萜類組合物的28位的亞甲基信號。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中該方法還用以同時(shí)檢測該樟芝子實(shí)體中至少一種羊毛留烷三萜類組合物的含量，包括以下步驟 以該1H核磁共振圖譜儀檢測該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物，確定該樟芝子實(shí)體乙酸乙酯的萃取物中是否具有該至少一種羊毛留烷三萜類組合物；以及 當(dāng)該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物中具有該至少一種羊毛留烷三萜類組合物時(shí)，以該高效液相色譜儀檢測該樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物中該至少一種羊毛留烷三萜類組合物的含量。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，還包括以該1H核磁共振圖譜儀檢測該至少一種羊毛甾烷三萜類組合物的28位的亞甲基信號。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該高效液相色譜儀包括檢測器，該檢測器選自由全波長檢測器、單波長檢測器及串聯(lián)質(zhì)譜儀及其組合組成的組之一。
23.一種分離化合物的立體異構(gòu)體的方法，該化合物的羧基的a位具有不對稱中心，該方法包括 計(jì)算該化合物的PKa值,該pKa值表示為a ； 調(diào)整分離溶媒的PH值為b值，b值的范圍為a-1. 5彡b彡a+1. 5，且1.0彡b<7;且 以該分離溶媒層析該化合物，以分離出該化合物中的立體異構(gòu)體。
24.一種檢測待測萃取物中麥角留烷三萜類組合物的方法，包括下列步驟 以樟芝酸A的不同濃度樣本為標(biāo)準(zhǔn)品制作核磁共振圖譜及檢量線； 以核磁共振圖譜儀分析該待測萃取物中的該麥角留烷三萜類組合物的28位的亞甲基信號；以及 比對該檢量線及該28位的亞甲基信號，由該28位的亞甲基信號的積分面積比計(jì)算該待測萃取物中該麥角留烷三萜類組合物的含量。
25.一種檢測待測萃取物中羊毛留烷三萜類組合物的方法，包括下列步驟 以去氫齒孔酸的不同濃度樣本為標(biāo)準(zhǔn)品制作核磁共振圖譜及檢量線； 以核磁共振圖譜儀分析該待測萃取物中該羊毛留烷三萜類組合物的28位的亞甲基信號；以及 比對該檢量線及該28位的亞甲基信號，由該28位的亞甲基信號的積分面積比計(jì)算該待測萃取物中該羊毛留烷三萜類組合物的含量。
26.一種分析樟芝子實(shí)體中麥角留烷三萜類的立體異構(gòu)體純的化合物的方法，包括步驟 以高效液相色譜柱層析樟芝子實(shí)體的乙酸乙酯萃取物，分離出該立體異構(gòu)體混合物；以及 依據(jù)該麥角留烷三萜類的立體異構(gòu)體純的化合物的1H核磁共振圖譜、該高效液相色譜柱層析的保留時(shí)間及旋 光數(shù)據(jù)，判斷該麥角留烷三萜類立體異構(gòu)體純的化合物的25位在結(jié)構(gòu)上為R構(gòu)型或S構(gòu)型。
全文摘要
本發(fā)明以高效液相色譜及核磁共振圖譜技術(shù)分離、純化、解析出樟芝子實(shí)體中的麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類組合物及它們的立體結(jié)構(gòu)式和含量，并測試它們的細(xì)胞毒性。通過前述技術(shù)，可以檢測藥品、保健食品或其他商品中是否含有麥角甾烷及羊毛甾烷三萜類組合物及它們的含量。
文檔編號G01N24/08GK102614195SQ201110092150
公開日2012年8月1日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者呂美津, 吳東穎, 吳永昌, 張芳榮, 杜英齊, 許育銘 申請人:高雄醫(yī)學(xué)大學(xué)