廣東蟲草子實體在制備治療慢性支氣管炎藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及廣東蟲草子實體在制備治療慢性支氣管炎藥 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 慢性肺部阻塞性疾病（COPD)通常定義為最大呼氣氣量的減少的過程，而這一過 程通常是不可逆的，并且是逐步惡化的。目前，90%的coro案例都被歸入慢性支氣管炎的 范疇（Sethi，1999)。慢性支氣管炎的病理癥狀及病因是十分復(fù)雜的，其中由吸煙引起的慢 性支氣管炎受到極大關(guān)注（Gump et al，1976 ;Xu et al，1992 ;Monso et al，1999 ;Sethi， 1999)〇
[0003] 目前，對于蟲草在慢性支氣管炎治療方面的報道主要集中在野生冬蟲夏草及冬 蟲夏草菌絲體，如其可有效擴(kuò)展支氣管及預(yù)防哮喘（Zhang and Zhang，1958;王琴和趙一， 1987);也可通過增加氣管粘膜的分泌功能來緩解小鼠的咳嗽癥狀（Wei et al，2002)。通 過大鼠模型證實，冬蟲夏草菌絲體可以維持支氣管上皮結(jié)構(gòu)，并且可以有效地預(yù)防在慢性 肺阻塞疾病過程中支氣管的發(fā)炎（劉進(jìn)等，2003 ;管彩虹和劉進(jìn)，2007)。冬蟲夏草能擴(kuò)張離 體動物支氣管，對氨霧致咳小鼠能延長其咳嗽潛伏期及減少咳嗽次數(shù)（徐錦堂，1997)。冬 蟲夏草及其菌絲體可明顯增大乙酞膽堿誘發(fā)哮喘潛伏期差值，具平喘作用（王勤和趙一， 1987)。魏濤等（2002)通過實驗發(fā)現(xiàn)灌服冬蟲夏草菌絲體后的大鼠肺巨噬細(xì)胞內(nèi)酶活性有 明顯的提高。冬蟲夏草水提液還具有明顯的增強腎上腺素分泌、擴(kuò)張動物支氣管、平喘、祛 痰等作用，可對肺心病呼吸衰竭發(fā)揮輔助治療作用（楊志彬和展春，2002)。盡管冬蟲夏草 效果顯著，但天然冬蟲夏草主要生長于喜馬拉雅山脈及附近的高海拔地區(qū)，且至今尚未能 進(jìn)行人工栽培生產(chǎn)，資源十分稀缺。而以其菌絲體為主研制的產(chǎn)品在市場上也存在良莠不 齊的現(xiàn)狀。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是提供廣東蟲草子實體在制備治療慢性支氣管炎藥物中的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明通過廣東蟲草子實體粉末對大鼠進(jìn)行慢性支氣管炎治療實驗，實驗結(jié)果表 明，廣東蟲草子實體對于煙熏導(dǎo)致的慢性支氣管炎有良好的改善作用，這提示廣東蟲草子 實體在吸煙人群的肺部健康方面將會發(fā)揮積極有效的作用，可用于制備具有治療慢性支氣 管炎功能的產(chǎn)品。
[0006] 本發(fā)明證明廣東蟲草子實體對于煙熏導(dǎo)致的慢性支氣管炎有良好的改善作用，提 示廣東蟲草子對吸煙人群的肺部健康方面將會發(fā)揮積極有效的作用，可用于制備治療慢性 支氣管炎藥物。
【附圖說明】：
[0007] 圖1是廣東蟲草子實體對實驗動物體重的影響，CG :廣東蟲草子實體；
[0008] 圖2是廣東蟲草子實體對實驗動物攝食量的影響，CG :廣東蟲草子實體；
[0009] 圖3是廣東蟲草子實體對實驗動物飲水量的影響，CG :廣東蟲草子實體；
[0010] 圖4是廣東蟲草對實驗動物BALF白細(xì)胞計數(shù)及分類的影響，CG :廣東蟲草子實體； ▲A與正常對照組相比P〈〇. 01，與空白對照組相比P〈. 0. 01 ; #與空白對照組相比P〈〇. 05 ;
[0011] 圖5是大鼠肺組織病理切片圖（H. EX 100)，依次為正常組（A)，模型組（B)，陽性對 照組（C)，廣東蟲草低、中、高（D-F)劑量組；
[0012] 圖6是大鼠肺組織病理切片圖（H. EX200)，依次為正常組（A)，模型組（B)，陽性對 照組（C)，廣東蟲草低、中、高（D-F)劑量組。
【具體實施方式】：
[0013] 以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0014] 實施例1 :
[0015] 對收集到的野生廣東蟲草子實體（Cordyceps guangdongensis T. H. Li, Q. Y.Lin&B. Song)表面消毒，通過常規(guī)方法進(jìn)行組織分離，獲得原始菌種。分離用培養(yǎng)基為加 富？0八，配方為（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、1(1^0 40.3%、1^04,71120 0.15%、 維生素&少許、瓊脂2%，余量為水。
[0016] 將原始菌種接入無菌的加富PDA斜面培養(yǎng)基中，20 - 25°C下，暗培養(yǎng)10 - 15天 后，光照4-6天，選取轉(zhuǎn)色快且菌絲生長整齊的菌種，作為母種。
[0017] 經(jīng)多次栽培，挑選出品質(zhì)優(yōu)良的母種，在其培養(yǎng)基中增加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% - 2%的葡 萄糖，進(jìn)行復(fù)壯。
[0018] 將經(jīng)篩選的母種接至經(jīng)滅菌的發(fā)酵液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄 糖1%，蛋白胨0.5%，麥芽浸出粉0.3%，酵母浸膏0.3%，余量為水，PH6.0 - 6. 5)中，并 放入一個螺旋鋼絲圈，用于分散菌絲球，在25°C，140r/m，振蕩培養(yǎng)7 - 10天。選取菌絲球 大小均勻一致、直徑為2 - 3毫米的作為一級菌種。
[0019] 將一級菌種按5% - 8%的比例（體積比）接入發(fā)酵液體培養(yǎng)基（配方同上）中， 并放入一個螺旋鋼絲圈，用于分散菌絲球，按一級菌種的培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，至菌球充滿全 部液體培養(yǎng)基即可。選取菌絲球大小均勻一致、直徑為2 - 3毫米的作為二級菌種，直接用 于栽培生產(chǎn)。
[0020] 栽培培養(yǎng)基由大米和營養(yǎng)液按1 :1. 2的比例（重量比）進(jìn)行配制混合而成，用 聚乙烯耐高溫薄膜封口，經(jīng)121°C，高壓滅菌40分鐘，冷卻后即可用于接種。營養(yǎng)液配方 為（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，麥芽浸出粉0.3%，酵母浸膏0. 3 %，余量為水， pH6. 0 - 6. 5〇
[0021] 在無菌室或超凈工作臺內(nèi)，用無菌水按1 :2的比例稀釋二級菌種，再將經(jīng)稀釋的 菌種接入無菌的栽培培養(yǎng)基中，每瓶接入17 - 22毫升。避光培養(yǎng)9 一 14天，待菌絲長滿培 養(yǎng)基后，進(jìn)行光照培養(yǎng)，光強400 - lOOOLux，空氣相對濕度80 - 90%，18 - 25°C，經(jīng)7 - 12天即可長出子實體原基，再培養(yǎng)40 - 50天，待子實體頂部變成圓形，并出現(xiàn)顆粒狀小點 時，即可采收。采收后的廣東蟲草子實體經(jīng)60°C烘干，粉碎后經(jīng)100目過篩后備用。
[0022] 取64只雄性SPF級SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，檢疫合格后將SD大鼠，雌雄各 半，隨機分為正常對照組10只和模型組54只。正常對照組：將10只大鼠置于特制的 50cmX50cmX40cm的煙室中（無須煙熏），2次/天，每次50min，持續(xù)57d。模型組54只， 平均置于特制的5個50cmX 50cmX 40cm的煙室中，2次/天，20g煙葉/次，每次50min，持 續(xù)57d。煙熏第21d，取造模大鼠雌雄各2只，作組織病理學(xué)檢查。煙熏第31d將50只模型 動物隨機分為模型對照組、地塞米松組（〇. 25mg/kg)、廣東蟲草子實體低劑量組（0. 325g/ kg)、中劑量組（0. 65g/kg)及高劑量組（1. 3g/kg)，10只/組（雌雄各半）。各組灌胃給予 相應(yīng)濃度的藥物，模型對照組給予等量的蒸餾水，正常對照組不給藥，連續(xù)給藥26d。末次給 藥lh，頸椎脫臼處死動物。打開胸腔結(jié)扎右肺，左肺按2ml/100g bw用0. 01mol/l PBS分 2次進(jìn)行肺泡灌洗，每次反復(fù)灌洗3遍。所得BALF 4°C 1000r/min離心10min，用預(yù)冷PBS 液lml重懸，用血細(xì)胞計數(shù)板做細(xì)胞計數(shù)。離心去掉上清，余液制成細(xì)胞涂片，瑞氏染色進(jìn) 行細(xì)胞分類計數(shù)。
[0023] 實驗結(jié)果：
[0024] 1、對慢性支氣管炎大鼠體重的影響
[0025] 模型對照組大鼠在各個測定時間點的體重與正常對照組比較均無顯著性差異 (P>0. 05);地塞米松組大鼠在給藥第三、四周的體重與模型對照組比較具有顯著性差異 (P〈0. 05);其余各給藥組大鼠在各個測定時間點的體重與模型對照組比較均無顯著性變化 (P>0. 05)。結(jié)果見圖1。
[0026] 2、對慢性支氣管炎大鼠進(jìn)食量、飲水量的影響
[0027] 模型對照組大鼠在各個測定時間點的進(jìn)食量、飲水量與正常對照組比較均無顯著 性差異（P>〇. 05);各給藥組大鼠在各個測定時間點的進(jìn)食量、飲水量與模型對照組比較均 無顯著性變化（P>〇. 05)。結(jié)果見圖2及圖3。
[0028] 3.對慢性支氣管炎大鼠BALF白細(xì)胞計數(shù)及分類的影響
[0029] BALF白細(xì)胞總數(shù)：模型對照組動物肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)與正常對照組比較 顯著增加（P〈〇. 01)。地塞米松組、廣東蟲草子實體中、高劑量組肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)顯 著降低（P〈0. 01)。廣東蟲草子實體低劑量組動物肺泡灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)與模型對照組比 較無顯著性差異（P>〇. 05)
[0030] BALF巨噬細(xì)胞百分比:模型對照組動物肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞百分比（％ ) 與正常對照組比較顯著降低（P〈〇. 01)。地塞米松組、廣東蟲草子實體低、中、高劑量組肺泡 灌洗液中巨噬細(xì)胞百分比顯著升高（P〈〇. 01)。
[0031] BALF中性粒細(xì)胞百分比:模型對照組動物肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞百分比 (% )與正常對照組比較顯著升高（P〈〇. 01)。地塞米松組、廣東蟲草子實體低、中、高劑量組 肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞百分比（％ )與模型對照組比較顯著性降低（P〈〇. 01)。
[0032] BALF淋巴細(xì)胞百分比:模型對照組動物肺泡灌洗液中淋巴細(xì)胞百分比（％ ) 與正常對照組比較顯著升高（P〈〇. 01)。地塞米松組、廣東蟲草子實體低、中、高劑量組肺泡 灌洗液中中性粒細(xì)胞百分比（％ )與模型對照組比較顯著性降低（P〈〇. 01)。結(jié)果見圖4。
[0033] 4.對慢性支氣管炎大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響
[0034] 模型對照組大鼠支氣管粘膜病變、支氣管管壁病變、基底部炎性細(xì)胞浸潤和肺泡 間隔病變與正常對照組比較差異顯著。模型對照組大鼠肺組織鏡下見細(xì)、小支氣管粘膜增 厚，皺襞增多，纖毛不整，部分纖毛消失，杯狀細(xì)胞顯著增多，支氣管粘膜上皮部分脫落，支 氣管周不同程度炎細(xì)胞浸潤（多為淋巴細(xì)胞），部分支氣管管壁平滑肌增厚明顯，肺泡間隔 不同程度增厚、間隔中淋巴細(xì)胞增多，肺泡壁毛細(xì)血管充血、小血管充血。支氣管周炎細(xì)胞 浸潤，肺泡間隔增厚。
[0035] 地塞米松能降低慢性支氣管炎大鼠改善支氣管粘膜病變。廣東蟲草子實體低、中 和高劑量能改善支氣管粘膜病變、支氣管管壁病變，高劑量還能改善基底部炎性細(xì)胞浸潤， 但未見廣東蟲草受試各劑量對肺泡間隔病變有改善作用。結(jié)果見表1，圖5及圖6。
[0036] 表1廣東蟲草子實體對慢性支氣管炎大鼠氣管肺組織形態(tài)學(xué)改變的影響
[0037]
【主權(quán)項】
1. 廣東蟲草子實體在制備治療慢性支氣管炎藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的治療慢性支氣管炎藥物是治療由 煙熏導(dǎo)致的慢性支氣管炎藥物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了廣東蟲草子實體在制備治療慢性支氣管炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過廣東蟲草子實體粉末對大鼠進(jìn)行慢性支氣管炎治療實驗，實驗結(jié)果表明，廣東蟲草子實體對于煙熏導(dǎo)致的慢性支氣管炎有良好的改善作用，這提示廣東蟲草子實體在吸煙人群的肺部健康方面將會發(fā)揮積極有效的作用，可用于制備具有治療慢性支氣管炎功能的產(chǎn)品。
【IPC分類】A61P11-00, A61K36-068
【公開號】CN104622917
【申請?zhí)枴緾N201510018654
【發(fā)明人】閆文娟, 李泰輝
【申請人】廣東省微生物研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月14日