專利名稱：：具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥?kù)`芝子實(shí)體提取物，具體地說(shuō)是涉及一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物，以及這種具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法。
背景技術(shù)：
：靈芝為多孔菌科真菌，有幾千年的藥用歷史，收載于中國(guó)最早的本草學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》。兩千多年以來(lái)，人們一直用靈芝來(lái)預(yù)防、治療腫瘤；現(xiàn)代科學(xué)研究也表明，靈芝有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。靈芝三薛類成分被公認(rèn)為靈芝抗胂瘤的有效成分之一。關(guān)于靈芝三辟類成分的提取，常用乙醇加熱回流提取，其存在有機(jī)溶劑殘留多、提取溫度高、成本相對(duì)較高等缺點(diǎn)。超臨界C02流體技術(shù)是提取靈芝三辟類成分的最新技術(shù)，克服了以上缺點(diǎn)。中國(guó)專利200510047263.9公開(kāi)了CCVSFE在提取靈芝子實(shí)體中三萜類物質(zhì)上的應(yīng)用。雖然目前關(guān)于靈芝子實(shí)體超臨界C02萃取三萜類組分的提取工藝研究較多，但對(duì)三辟類組分的純化研究卻相對(duì)較少，臨床多以超臨界C02萃取物直接用藥，或?qū)⒓兓蟮撵`芝三萜酸類成分用于治療。李保明(參見(jiàn):李保明，劉超,王洪慶,等.靈芝總?cè)扑岷繙y(cè)定方法的研究[J].中國(guó)中藥雜志,2007,32(12)1234-1236.)報(bào)道將靈芝子實(shí)體用乙醇加熱回流提取，氯仿溶解，飽和碳酸氬鈉溶液堿提，鹽酸酸化，氯仿萃取的方法獲得靈芝三碎酸類成分；中國(guó)專利200310117112.7公開(kāi)了一種靈芝三辟類抗腫瘤組分的提取方法，它將靈芝子實(shí)體用甲醇或乙醇超聲循環(huán)浸提，然后用飽和碳酸氫鈉溶液石威提，鹽酸酸化，再用氯仿萃取將酸化后的三辟酸類成分，減壓蒸干得到三辟酸類組分。以上報(bào)道有一個(gè)共同之處，即均將飽和碳酸氫鈉溶液堿提之后的氯仿層棄掉，僅保留飽和碳酸氫鈉溶液堿提液中的三辟酸類成分，將之酸化并萃取出。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的，是提供一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物，這是一種從靈芝子實(shí)體超臨界C02萃取物中獲得的具有抗腫瘤活性的提取物。本發(fā)明還提供這種具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法。本發(fā)明將克服以往普遍使用靈芝三辟中三辟酸類成分，而忽略其中含有的其它具有抗腫瘤活性成分利用的問(wèn)題。完成本申請(qǐng)第l個(gè)發(fā)明任務(wù)的方案是，一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物，其特征在于，其中三萜類成分的含量為30~70wt%;同時(shí)，該提取物中含有的有效成分還用以下方法表征用高效液相色譜條件1表征提取物，由色譜峰保留時(shí)間在80128min之間的成分組成(圖1);用高效液相色譜條件2表征提取物，主要包含色譜峰保留時(shí)間為14.8915.67min、30.7431.35min、34.3634.98min、37.03~37.64min、39,47~40.01min的5個(gè)成分(圖2)。所述的高效液相色鐠條件1為ZORBAXSB-C18柱(4.6mmx250mm，5pm);流動(dòng)相A:乙腈，B:0.05%磷酸水溶液，線性梯度洗脫，0min:27°/oA;40min:27%A;60min:35%A;80min:450/0A;90min:65%A;100min:75%A;110min:85%A;120min:100%A;128min:100%A;流速:l.OmL.min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;柱溫30。C。在此條件下，靈芝子實(shí)體超臨界C02萃取的粗提物由色譜峰保留時(shí)間在0128min之間的所有成分組成(圖3);該粗提物的碳酸氬鈉萃取層(即以往普遍使用的靈芝三薛酸類成分)由色語(yǔ)峰保留時(shí)間在0~80min之間的所有成分組成(圖4),色譜峰保留時(shí)間在80~128min之間的所有成分組成本提取物。高效液相色鐠條件2為ZORBAXSB-C18柱(4.6mmx250mm，5jim);流動(dòng)相A:乙腈，B:0.05。/。磷酸水溶液，線性梯度洗脫，0min:60%A;25min:90%A;40min:1000/oA;45min:100%A;;危速:l.OmL.min畫l;才企測(cè)波長(zhǎng)240nm;柱溫30。C。三碎類成分含量測(cè)定方法用分光光度法，以熊果酸為對(duì)照品，在檢測(cè)波長(zhǎng)為543nm下測(cè)定，供試品及空白樣品的光語(yǔ)掃描圖見(jiàn)圖'5、圖6、圖7。申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)靈芝子實(shí)體用超臨界C02萃取技術(shù)提取出的粗提物，經(jīng)飽和碳酸氫鈉溶液堿提后的氯仿層，即以上報(bào)道中棄去的物質(zhì)，亦具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性。所以，本發(fā)明建立了一種從靈芝子實(shí)體中提取靈芝三碎酸以外提取物的方法，獲得一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物。更具體和更優(yōu)化地說(shuō)，本發(fā)明所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物是指采用以下方法制備得到的提取物(1)靈芝子實(shí)體粉碎成粗粉，過(guò)篩；(2)將靈芝子實(shí)體粗粉以乙醇為夾帶劑用超臨界C02萃取技術(shù)進(jìn)行萃取，得到靈芝子實(shí)體粗提物乙醇溶液，減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物；(3)將靈芝子實(shí)體粗提物用醋酸乙酯溶解，飽和碳酸氫鈉溶液萃取，分別得到飽和碳酸氫鈉層和醋酸乙酯層；(4)取醋酸乙酯層減壓回收溶劑，真空干燥，得靈芝子實(shí)體抗腫瘤提取物。本發(fā)明的另一目的是提供上述提取物的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)靈芝子實(shí)體粉碎成粗粉，過(guò)篩；(2)將靈芝子實(shí)體粗粉以乙醇為夾帶劑用超臨界C02萃取技術(shù)進(jìn)行萃取，得到靈芝子實(shí)體粗提物乙醇溶液，減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物；(3)將靈芝子實(shí)體粗提物用醋酸乙酯溶解，飽和碳酸氫鈉溶液萃取，分別得到飽和碳酸氫鈉層和醋酸乙酯層；(4)取醋酸乙酯層減壓回收溶劑，真空干燥，得靈芝子實(shí)體抗腫瘤提取物。在上述步驟(1)中，靈芝子實(shí)體并分碎時(shí)，過(guò)10~50目篩。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例中，靈芝子實(shí)體粗粉過(guò)12目篩。在上述步驟(2)中，超臨界C02萃取條件為萃取壓力為25MPa,萃取溫度為45。C，萃取時(shí)間為1.5h，夾帶劑乙醇用量為3mL.g"生藥。在上述步驟(2)中，靈芝子實(shí)體粗提物乙醇溶液回收乙醇時(shí)，溫度控制在30~60。C，最優(yōu)溫度控制在50。C。在上述步驟(3)中，用醋酸乙酯溶解時(shí)，靈芝子實(shí)體粗提物與醋酸乙酯兩者的比例為靈芝子實(shí)體粗提物質(zhì)量(g):醋酸乙酯(mL)-l:10l:100,優(yōu)選為1:401:80,最優(yōu)選為1:50。在上述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯溶液，萃取次數(shù)為18次，優(yōu)選萃取次數(shù)為2~6次，最優(yōu)選萃取次數(shù)為4次。在上述步驟(3)中，用飽和碳酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯溶液時(shí)，醋酸乙酯與飽和碳酸氫鈉溶液體積比為1:33:1，優(yōu)選為1:22:1，最優(yōu)選為1:1。在上述步驟(4)中，回收醋酸乙酯溶劑和真空干燥提取物時(shí)，溫度控制在30~60。C,優(yōu)選為50。C。在上述步驟(4)中得到的黑褐色固體即為靈芝子實(shí)體抗胂瘤提取物。本發(fā)明的靈芝子實(shí)體提取物的藥用用途是以所述的靈芝子實(shí)體提取物作為抗胂瘤活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔料，制成的任何一種劑型的藥物。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明使用超臨界co2流體技術(shù)萃取靈芝子實(shí)體的活性組分，可以大幅度減少有機(jī)溶劑產(chǎn)生的環(huán)境污染，保護(hù)環(huán)境。2.本發(fā)明抗腫瘤提取物比以往普遍使用的靈芝三辟酸類成分具有更好的抗腫瘤效果，充分利用本發(fā)明提取物可以更好、更充分合理的利用靈芝這味珍貴藥材。圖1為本發(fā)明提取物HPLC圖語(yǔ)(色譜條件1);圖2為本發(fā)明提取物HPLC圖鐠(色鐠條件2);圖3為靈芝子實(shí)體超臨界C02粗提物HPLC圖譜(色譜條件1);圖4為靈芝子實(shí)體超臨界C02粗提物的碳酸氫鈉萃取層的HPLC圖譜(色譜條件1);圖5為熊果酸對(duì)照品的光鐠掃描圖；圖6為供試品的光語(yǔ)掃描圖；圖7為空白樣品的光譜掃描圖。圖8為從靈芝子實(shí)體中獲得一種具有抗腫瘤活性的提取物的制備方法流程圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的范圍并不受這些實(shí)例的限制。實(shí)施例1將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)12目篩，取100g置于超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設(shè)定萃取釜溫度為45°C,分離釜I溫度為50。C,分離釜II溫度為36。C,打開(kāi)C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時(shí)調(diào)節(jié)萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調(diào)節(jié)C02流量為30L/h，萃取時(shí)間1.5h,夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界<:02流體在設(shè)定的壓力、溫度下進(jìn)行萃取循環(huán)，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的萃取時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物。將上述所得到的靈芝子實(shí)體粗提物，用50倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取4次，萃取時(shí)飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:1,得到碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；5(TC減壓回收醋酸乙酯溶劑，并于50。C真空干燥，得黑褐色固體粉末1.06g。本發(fā)明提取物中三萜類成分含量測(cè)定取靈芝子實(shí)體抗腫瘤提取物50mg,用無(wú)水乙醇定容到50mL,用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定三碎類成分的含量。對(duì)照品溶液的制備精密稱取熊果酸對(duì)照品2.21mg，置于10mL量瓶中，加無(wú)水乙醇適量使溶解，定容，搖勻，即得。顯色方法及檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取上述熊果酸對(duì)照品溶液0.5mL，置10mL具塞試管中，沸水浴中揮干溶劑，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.5mL，高氯酸0.8mL,密塞，于60。C水浴中加熱15min,取出，水水浴中冷卻5min，加冰醋酸5mL，搖勻。用UV-2802型可見(jiàn)分光光度儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，在543nm處有最大吸收峰，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為543nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密吸取熊果酸對(duì)照品溶液0.2,0,3,0.4，0.5，0.6,0.7,0.8mL,按上述條件及步驟在543nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，熊果酸對(duì)照品含量(嗎)為橫坐標(biāo)(Z)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為0.0035,產(chǎn)0.9995，結(jié)果表明熊果酸在44.2154.7嗎呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。含量測(cè)定取上述制備的靈芝子實(shí)體抗肺瘤提取物乙醇溶液60^L,按"顯色方法"項(xiàng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靈芝三薛的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。固形物的含量測(cè)定精密量取上述靈芝子實(shí)體抗腫瘤提取物乙醇溶液IOmL，置已干燥恒重的蒸發(fā)亞中，水浴揮干溶劑，置105。C烘箱中恒重，稱定，計(jì)算固形物的含量，結(jié)果見(jiàn)表l。表1本發(fā)明提取物的三萜含量、固形物含量的測(cè)定樣品固形物含量/%三砲含量/%本發(fā)明提取物__53.49實(shí)施例2將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)10目篩，取100g置于超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設(shè)定萃取釜溫度為45°C，分離釜I溫度為50°C，分離釜II溫度為36。C,打開(kāi)C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時(shí)調(diào)節(jié)萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa,調(diào)節(jié)C02流量為30L/h,萃取時(shí)間1.5h,夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設(shè)定的壓力、溫度下進(jìn)行萃取循環(huán)，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的萃取時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，30。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物。將上述所得到的靈芝子實(shí)體粗提物，用IOO倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取6次，萃取時(shí)飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為2:1,得到碳酸氬鈉溶液層和醋酸乙酯層；4(TC減壓回收醋酸乙酯溶劑，并于40。C真空干燥，得到黑褐色固體粉末0.95g。實(shí)施例3將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)50目篩，取100g置于超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設(shè)定萃取釜溫度為45°C,分離釜I溫度為50°C，分離釜II溫度為36。C，打開(kāi)C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時(shí)調(diào)節(jié)萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調(diào)節(jié)C02流量為30L/h，萃取時(shí)間1.5h,夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設(shè)定的壓力、溫度下進(jìn)行萃取循環(huán)，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的萃取時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物。13將上述所得到的靈芝子實(shí)體粗提物，用10倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取2次，萃取時(shí)飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:3，得到飽和碳酸氬鈉溶液溶液層和醋酸乙酯層；30。C減壓回收醋酸乙酯，30°C真空干燥，得到黑褐色固體粉末1.31g。實(shí)施例4將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)12目篩，取100g置于超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設(shè)定萃取釜溫度為45°C,分離釜I溫度為50°C,分離釜II溫度為36。C,打開(kāi)C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時(shí)調(diào)節(jié)萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調(diào)節(jié)C02流量為30L/h,萃取時(shí)間1.5h，夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設(shè)定的壓力、溫度下進(jìn)行萃取循環(huán)，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的萃取時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，60。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物。將上述所得到的靈芝子實(shí)體粗提物，用80倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取5次，萃取時(shí)飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為3:1，得到飽和碳酸氬鈉溶液和醋酸乙酯層；60。C減壓回收醋酸乙酯，60。C真空干燥，得到黑褐色固體粉末0.81g。實(shí)施例5將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)12目篩，取100g置于超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設(shè)定萃取釜溫度為45°C，分離釜I溫度為50°C，分離釜II溫度為36。C,打開(kāi)C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時(shí)調(diào)節(jié)萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調(diào)節(jié)C02流量為30L/h，萃取時(shí)間1.5h，夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設(shè)定的壓力、溫度下進(jìn)行萃取循環(huán)，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的萃取時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物。將上述所得到的靈芝子實(shí)體粗提物，用40倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氬鈉溶液萃取4次，萃取時(shí)飽和碳酸氳鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:2，得到飽和碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；40。C減壓回收醋酸乙酯溶劑，40°C真空干燥，得到黑褐色固體粉末U9g。實(shí)施例6將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)12目篩，取100g置于超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設(shè)定萃取釜溫度為45°C,分離釜I溫度為50°C,分離釜II溫度為36。C,打開(kāi)C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，.同時(shí)調(diào)節(jié)萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa,調(diào)節(jié)C02流量為30L/h，萃取時(shí)間1.5h，夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設(shè)定的壓力、溫度下進(jìn)行萃取循環(huán)，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的萃取時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物。將上述所得到的靈芝子實(shí)體粗提物，用60倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取5次，萃取時(shí)飽和碳酸氬鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:1，得到飽和碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；60。C減壓回收醋酸乙酯溶劑，60。C真空干燥，得到黑褐色固體粉末0.90g。實(shí)施例715將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)12目篩，取100g置于超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設(shè)定萃取釜溫度為45°C，分離釜I溫度為50°C，分離釜II溫度為36。C,打開(kāi)C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時(shí)調(diào)節(jié)萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa,調(diào)節(jié)C02流量為30L/h,萃取時(shí)間1.5h,夾帶劑乙醇用量為300rnL。使超臨界C02流體在設(shè)定的壓力、溫度下進(jìn)行萃取循環(huán)，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的萃取時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，50。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物。將上述所得到的靈芝子實(shí)體粗提物，用80倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取8次，萃取時(shí)飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:1，得到飽和碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；50。C減壓回收醋酸乙酯，50。C真空干燥，得到黑褐色固體粉末0.76g。實(shí)施例8將靈芝子實(shí)體粉碎，過(guò)12目篩，取100g置于超臨界萃取裝置中的1L萃取釜中，設(shè)定萃取釜溫度為45°C，分離釜I溫度為50°C,分離釜II溫度為36。C，打開(kāi)C02鋼瓶(需保持出口壓力在4MPa以上)，同時(shí)調(diào)節(jié)萃取釜壓力為25MPa、分離釜I壓力為7MPa、分離釜II壓力為4MPa，調(diào)節(jié)C02流量為30L/h，萃取時(shí)間1.5h，夾帶劑乙醇用量為300mL。使超臨界C02流體在設(shè)定的壓力、溫度下進(jìn)行萃取循環(huán)，當(dāng)達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的萃取時(shí)間后，從分離釜I和分離釜II出料口接收萃取液；將得到的提取液，60。C減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體^L提物。將上述所得到的靈芝子實(shí)體粗提物，用70倍醋酸乙酯溶解；再用飽和碳酸氫鈉溶液萃取l次，萃取時(shí)飽和碳酸氫鈉溶液與醋酸乙酯體積比為1:1，得到飽和碳酸氫鈉溶液層和醋酸乙酯層；40。C減壓回收醋酸乙酯，40。C真空干燥，得到黑褐色固體粉末1.79g。實(shí)施例9本發(fā)明提取物的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)人肝癌BEL-7402細(xì)胞林取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌BEL-7402細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù))用胰酶消化，用含小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基配制成一定濃度的細(xì)胞懸液，細(xì)胞的濃度為5xl(^個(gè)/mL，然后接種于96孔板，每孔加入100pL，置37°C、5。/。C02培養(yǎng)箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，然后棄去含小牛血清的培養(yǎng)基，每孔加入90pL無(wú)血清培養(yǎng)基，及10jiL不同濃度的藥物，陽(yáng)性藥物組給予60jig.mL"的順柏溶液，空白組加入等體積的PBS緩沖鹽溶液，另每組各設(shè)兩個(gè)本底孔(即不含腫瘤細(xì)胞，只含對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基與藥物)，以去除培養(yǎng)基及藥液顏色的影響。受試藥分別為本發(fā)明提取物(即醋酸乙酯層)和靈芝子實(shí)體三辟酸提取物(即飽和碳酸氫鈉層)，均設(shè)5個(gè)劑量組，分別用PBS稀釋至濃度為20、5、1.25、0.3125、0.0781嗎提取物'mL-l,每組設(shè)3個(gè)平行孔。于37。C、5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，每孔加MTT溶液(5mg.m!/1)10pL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，吸棄孔中上清液，然后每孔加100jxLDMSO溶解MTT曱瓚顆粒，用微型振蕩器振蕩10min后，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值(OD),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，結(jié)果見(jiàn)表2。藥物抑制率=[OD對(duì)照組一OD藥物組]/OD對(duì)照組xl000/0表2本發(fā)明提取物和靈芝子實(shí)體三萜酸提取物.對(duì)人肝癌BEL-7402細(xì)胞的增殖抑制作用比較(-±s，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注陽(yáng)性對(duì)照順鉑組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(70.47±0.65)%"--"表示抑制率均小于50%，不能計(jì)算IC50結(jié)果表明，本發(fā)明提取物有較強(qiáng)的抑制人肝癌BEL-7402細(xì)胞增殖的活性；并且在同樣濃度下，比靈芝子實(shí)體三萜酸提取物抑制率高，具有更好的抑制人肝癌BEL-7402腫瘤細(xì)胞增殖的活性。人肺癌SPC-A-1細(xì)胞抹取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺癌SPC-A-1細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù))用胰酶消化，使其脫壁，用10。/。胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞的濃度為5xl(^個(gè)/mL，然后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100pL。受試藥分別為本發(fā)明提取物(即醋酸乙酯層)和靈芝子實(shí)體三辟酸提取物(即飽和碳酸氫鈉層)，均設(shè)5個(gè)劑量組，分別用PBS稀釋至濃度為20、10、5、1.25、0.3125嗎提取物'mL-l，每組設(shè)3個(gè)平行孔。其余操作與人肝癌BEL-7402細(xì)胞的相同，計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率，結(jié)果見(jiàn)表3。表3本發(fā)明提取物和靈芝子實(shí)體三萜酸提取物對(duì)人肺癌SPC-A-1細(xì)胞的增殖抑制作用比較(5±&n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注陽(yáng)性對(duì)照順鉑組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為(74.08±0.59)%"---"表示抑制率均小于50%，不能計(jì)算ICso所得結(jié)果表明本發(fā)明提取物有較強(qiáng)的抑制人肺癌SPC-A-1的增殖活性；并且在同樣濃度下，比靈芝子實(shí)體三萜酸提:f又物抑制率高，具有更好的抑制SPC-A-1腫瘤細(xì)胞增殖的活性。實(shí)施例10本發(fā)明提取物的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)選擇接種7d，生長(zhǎng)良好的荷Heps肝癌小鼠，頸推脫臼處死，無(wú)菌抽取腹水，以無(wú)菌生理鹽水按l:4比例稀釋成2xl(^個(gè)/mL的瘤細(xì)胞懸液，接種于健康小鼠右前肢皮下，每只0.2mL。接種次日，按體重隨機(jī)分為6組，分別為生理鹽水空白對(duì)照組；環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組；本發(fā)明提取物高低劑量組(140mg提取物'kg-l'd-l、70mg提取物'kg-l'd-l);靈芝子實(shí)體三薛酸提取物高低劑量組(140mg提取物'kg-l'd-l、70mg提取物'kg-l'd-l)。環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組為腹腔注射UOmg'kg^d-1),其它組為灌胃給藥，均為每曰1次，連續(xù)7d。期間，每日觀察小鼠的一般活動(dòng)、皮毛、糞便等情況。與末次給藥后24h后頸推脫臼處死小鼠剝?nèi)×鼋M織，同時(shí)剖耳又小鼠脾臟、胸腺，稱重，計(jì)算抑瘤率、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4、表5。抑瘤率(％)=(l-治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)xioo%;脾指數(shù)=脾重(mg)/小鼠體重(g);胸腺指數(shù)=胸腺重(mg)/小鼠體重(g)。表4本發(fā)明提取物和靈芝子實(shí)體三萜酸提取物對(duì)Heps移植性腫瘤的抑制作用比較(5±力<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注與陰性對(duì)照組比較承P0.05結(jié)果表明本發(fā)明提取物有較強(qiáng)的抑制小鼠體內(nèi)肝癌Heps腫瘤的生長(zhǎng)作用，其高、低劑量組與對(duì)照組的瘤重相比均有顯著性降低(P〈0.05);并且在相同濃度下，比靈芝子實(shí)體三萜酸提取物抑瘤率高，具有更好的抑制小鼠體內(nèi)肝癌Heps肺瘤的生長(zhǎng)的活性。表5本發(fā)明提取物和靈芝子實(shí)體三萜酸提取物對(duì)荷瘤小鼠免疫器官的影響比較(5±力組別提取物給藥量(mg.kg".d誦1)脾指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g)空白組06.93±1.542.64±0.47環(huán)磷酰胺組203.73±1.15*1.46±0.55*本發(fā)明1406.77±0.932.49±0.88提取物組706.42±1.222.53±0.86靈芝子實(shí)體1406.81±1.302.64±0.72三萜酸提取物組707.20±1.002.61±0.61注與陰性對(duì)照組比較*P<0.05實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提取物組的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)與空白組比較無(wú)顯著性差異，即表明靈芝子實(shí)體提取物對(duì)荷瘤小鼠的免疫器官物無(wú)毒副作用，可以保持機(jī)體的免疫活性。權(quán)利要求1、一種具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物，其特征在于，其中三萜類成分的含量為30～70wt％；同時(shí)，該提取物中的有效成分還用以下方法表征用高效液相色譜條件1表征提取物，由色譜峰保留時(shí)間在80～128min之間的成分組成；用高效液相色譜條件2表征提取物，包含色譜峰保留時(shí)間為14.89～15.67min、30.74～31.35min、34.36～34.98min、37.03～37.64min、39.47～40.01min的5個(gè)成分；所述的高效液相色譜條件1為ZORBAXSB-C18柱；流動(dòng)相A乙腈，B0.05％磷酸水溶液，線性梯度洗脫，0min27％A；40min27％A；60min35％A；80min45％A；90min65％A；100min75％A；110min85％A；120min100％A；128min100％A；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫30℃；所述的高效液相色譜條件2為ZORBAXSB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A乙腈，B0.05％磷酸水溶液，線性梯度洗脫，0min60％A；25min90％A；40min100％A；45min100％A；流速1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)240nm；柱溫30℃。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物，其特征在于，該具有抗肺瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物是指采用以下方法制備得到的提取物(1)靈芝子實(shí)體粉碎成粗粉，過(guò)篩；(2)將靈芝子實(shí)體粗粉以乙醇為夾帶劑用超臨界C02萃取技術(shù)進(jìn)行萃取，得到靈芝子實(shí)體粗提物乙醇溶液，減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物；(3)將靈芝子實(shí)體粗提物用醋酸乙酯溶解，飽和碳酸氫鈉溶液萃取，分別得到飽和碳酸氬鈉層和醋酸乙酯層；(4)取醋酸乙酯層減壓回收溶劑，真空干燥，得靈芝子實(shí)體抗腫瘤提取物。3、一種權(quán)利要求1所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法，其特征在于，步驟如下(1)靈芝子實(shí)體粉碎成粗粉，過(guò)篩；(2)將靈芝子實(shí)體粗粉以乙醇為夾帶劑用超臨界C02萃取技術(shù)進(jìn)行萃取，得到靈芝子實(shí)體粗提物乙醇溶液，減壓回收溶劑，得到靈芝子實(shí)體粗提物；(3)將靈芝子實(shí)體粗提物用醋酸乙酯溶解，飽和^f友酸氫鈉溶液萃取，分別得到飽和碳酸氬鈉層和醋酸乙酯層；(4)取醋酸乙酯層減壓回收溶劑，.真空干燥，得靈芝子實(shí)體抗腫瘤提取物。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法，其特征在于，在所述步驟(l)中，靈芝子實(shí)體粉碎時(shí)，過(guò)1050目篩；'在所述步驟(2)中，超臨界C02萃取條件為萃取壓力為25MPa，萃取溫度為45。C，萃取時(shí)間為1.5h，夾帶劑乙醇用量為3mL.g"生藥；靈芝子實(shí)體粗提物乙醇溶液回收乙醇時(shí)，溫度控制在3060°C;在所述步驟(3)中，用醋酸乙酯溶解時(shí)，靈芝子實(shí)體粗提物與醋酸乙酯兩者的比例為靈芝子實(shí)體粗提物質(zhì)量(g):醋酸乙酯(mL)-l:10~1:100;在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯時(shí)，萃取次數(shù)為1~8次；在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯時(shí)，醋酸乙酯與飽和碳酸氬鈉溶液體積比為醋酸乙酯飽和碳酸氬鈉溶液=1:3~3:1;在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯時(shí)，萃取次數(shù)為18次。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗胂瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法，其特征在于，在所述步驟(l)中，靈芝子實(shí)體粗粉過(guò)12目篩；在所述步驟(2)中，靈芝子實(shí)體粗提物乙醇溶液回收乙醇時(shí)，溫度控制在50°C;在所述步驟(3)中，用醋酸乙酯溶解時(shí)，靈芝子實(shí)體粗提物與醋酸乙酯兩者的比例為靈芝子實(shí)體粗提物質(zhì)量g:醋酸乙酯容積mL為1:401:80;在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯時(shí)，萃取次數(shù)為2~6次。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，用醋酸乙酯溶解時(shí)，靈芝子實(shí)體粗提物與醋酸乙酯兩者的比例為靈芝子實(shí)體粗提物質(zhì)量g:醋酸乙酯容積mL為1:50。在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯時(shí)，萃取次數(shù)為4次。7、根據(jù)權(quán)利要求4~6之一所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯時(shí)，醋酸乙酯與飽和碳酸氫鈉溶液體積比1:33:1;在所述步驟(4)中，回收醋酸乙酯溶劑和真空干燥提取物時(shí)，溫度控制在3060。C。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，用飽和碳酸氫鈉溶液萃取醋酸乙酯時(shí)，醋酸乙酯與飽和碳酸氫鈉溶液體積比為1:22:1。在所述步驟(4)中，回收醋酸乙酯溶劑和真空干燥^是:取物時(shí)，溫度控制在50。C。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物的制備方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，用飽和^f友酸氬鈉溶液萃取醋酸乙酯時(shí)，醋酸乙酯與飽和碳酸氫鈉溶液體積比為1:1。全文摘要具有抗腫瘤活性的靈芝子實(shí)體提取物及其制備方法，其中靈芝子實(shí)體提取物中三萜類成分的含量為30～70wt％；同時(shí)提取物中含有以下方法表征的有效成分用條件1表征提取物，由色譜峰保留時(shí)間在80～128min之間的成分組成；用條件2表征提取物，包含色譜峰保留時(shí)間為14.89～15.67min、30.74～31.35min、34.36～34.98min、37.03～37.64min、39.47～40.01min的5個(gè)成分。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)使用靈芝三萜中三萜酸類成分忽略其它具有抗腫瘤活性成分利用的問(wèn)題，可以更好、更充分利用靈芝藥材。并大幅度減少有機(jī)溶劑產(chǎn)生的環(huán)境污染，保護(hù)環(huán)境。文檔編號(hào)A61K36/06GK101559083SQ200910027230公開(kāi)日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年5月25日優(yōu)先權(quán)日2009年5月25日發(fā)明者宋師花,賈曉斌,彥陳申請(qǐng)人:江蘇省中醫(yī)藥研究院