專利名稱：生物信息獲取方法和煙酰胺代謝物測量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及生物信息獲取方法(biological information acquisitionmethod)，具體地，涉及基于從活生物體(活有機體，living organism)采集(collect)的樣品中煙酰胺代謝物(nicotinamide metabolite)的量來獲取關(guān)于該活生物體的信息。
背景技術(shù)：
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是細胞能量代謝中一種已知的氧化還原反應(yīng)輔酶。NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化形式)是從作為養(yǎng)分消化的煙酰胺(NA)生物合成的。具體地，NA通過煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)轉(zhuǎn)化為煙酰胺單核苷酸(NMN)，而NMN通過煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(Nmnat)轉(zhuǎn)化為NAD+(參見圖14)。除了在氧化還原循環(huán)中被轉(zhuǎn)化為NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原形式)，NAD+通過酶如去乙?；?SIRTl)降解為NA和0-乙?；?ADP-核糖(0-acetyl-ADP-ribose)而轉(zhuǎn)化回到NA(參見圖14)。NAD代謝一度被認為僅局限在細胞內(nèi)的一種現(xiàn)象，現(xiàn)在開始作為也發(fā)生在細胞外部的過程(包括轉(zhuǎn)運)加以尋找。血液中NAD+、NADHjP NMN的濃度保持在幾十微摩爾級別的高水平，該量為血液NA濃度(其僅為幾個微摩爾)的十倍以上。血液NAD+、NADH、*NMN ^cit^ffi NA WjgAM^^ ( #JAL Consideration of diurnal variations in humanblood NAD and NADP concentrations, J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo), 2009, Jun ；55 (3)279-81)。因此，認為血液中NAD+、NADH JPNMN的濃度保持與NA無關(guān)，以及它們的需求和供給在細胞和組織之間、以及在組織和器官之間被控制。事實上，已知的是，將NA轉(zhuǎn)化為NMN的Nampt在神經(jīng)細胞或胰腺β細胞中幾乎不表達，且自身不能合成NAD+的這些細胞依賴于細胞夕卜供應(yīng) NAD+(參見 Nampt/PBEF/Visfatinregulates insulin secretion in betacells as a systemic NAD biosynthetic enzyme,Cell Metab,2007,Nov ；6(5) :363-75,禾口Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delaysaxonal degeneration after axotomy, J Neurosci,2006, Augl6 ；26(33) :8484-91)。關(guān)于煙酰胺代謝物(ΝΑ、NMN、NAD+、NADH)，已知NAD+和NADH的量，或它們的比率(NAD+的量/NADH的量)能夠用作細胞狀態(tài)和個體健康狀況的指標。例如，因為NAD在細胞能量代謝中是功能性的，所以具有小量NAD+的細胞不能代謝脂肪，并傾向于累積脂肪。因此認為，能夠基于NAD+的量獲取關(guān)于個體對超重的易感性，或形成代謝綜合征的風(fēng)險的信息。而且，癌細胞需要大量的能量，并因此包含大量的NADH。因此，具有過多的大量NADH的細胞能夠被認為是癌性的。在這方面，能夠用來基于NADH的自身熒光(self-fluorescence)觀察癌病變的內(nèi)窺鏡已經(jīng)實際使用，且已經(jīng)被用來基于NADH的量獲取關(guān)于個體形成(發(fā)展，develop)癌癥的風(fēng)險、或有無發(fā)作(發(fā)病，onset)的信息。煙酰胺代謝物涉及能量代謝的事實表明這些代謝物在細胞水平與疲勞相關(guān)。也考慮了在個體水平上疲勞可能涉及NAD+，如在Storage and secretion of beta_NAD，ATP anddopamine in NGF-differentiated rat pheochromocytoma PC12 cells,Eur J Neurosci,
32009，Sep ；30 (5) =756-68, Epub 2009 Aug 27 (2009 年 8 月 27 日電子版)中的報道，描述了神經(jīng)細胞以與神經(jīng)遞質(zhì)(neurotransmitter)相同的方式累積NAD+，并響應(yīng)刺激而釋放 NAD+的機制。而且，已知器官響應(yīng)于壓力而經(jīng)歷代謝狀態(tài)的變化，并且因為認為NAD代謝也經(jīng)歷壓力誘導(dǎo)的變化，所以將有可能基于煙酰胺代謝物的量獲取關(guān)于個體的壓力的信息。如上所述，神經(jīng)細胞和胰腺β細胞依靠外部NAD+供給。在不同細胞類型中，神經(jīng)細胞需要最大量的能量，并要求大量NAD+用于其神經(jīng)活動。在NA缺陷(糙皮病)中，癡呆被認為是最常見癥狀，且NA缺陷認為是引起神經(jīng)細胞能量代謝異常的一個因素。這表明了關(guān)于形成癡呆的風(fēng)險、或有無發(fā)作的信息能夠基于NAD+量獲得的可能性。胰腺β細胞代謝攝入的糖，且通過感測血糖水平而分泌胰島素。因為糖的感測要求NAD+，所以NA也用作I型糖尿病的治療藥物。因此，認為基于煙酰胺代謝物的量，獲取關(guān)于患糖尿病的風(fēng)險、或有無發(fā)作的信息是可能的。已經(jīng)報道了在嚙齒動物的血液中NMN濃度隨年齡增加而降低，這表明年齡相關(guān)的血液NMN水平降低和癡呆或糖尿病之間有關(guān)聯(lián)(參見Age-associated loss of Sirtl—mediated enhancement of glucose-stimulated insulin secretion in beta cell-specific Sirtl-overexpressing(BESTO)mice,Aging Cell, 2008, Jan ；7 (1) :78-88, Epub 2007 Nov 14 (2007 年 11 月 14 日電子版))。如上所述，認為基于煙酰胺代謝物(ΝΑ、NMN, NAD+、NADH)的量，有可能獲取有用的生物信息，如關(guān)于形成疾病，如代謝綜合征、癌癥、癡呆和糖尿病的風(fēng)險，或有無發(fā)作的信息，以及關(guān)于疲勞或壓力狀態(tài)的信息。獲取生物信息，如活生物體的壓力、情感性(affectivity)、和月經(jīng)周期的已知方法包括基于生理評價(psychological evaluation)的生物信息獲取方法，涉及例如，問詢和感覺問卷、測量例如腦電波或肌電的生理測試、以及涉及使用如工作記錄的行為測量。例如JP-A-2006-94969公開了根據(jù)心率確定月經(jīng)周期的技術(shù)。日本專利No. 2582957公開了監(jiān)視體溫波動和心率的生命活動監(jiān)視系統(tǒng)。還開發(fā)了更簡單的獲取關(guān)于活生物體信息的技術(shù)，其中利用在血液、尿液或唾液中包含的生理活性物質(zhì)作為指標。例如，JP-A-11-38004公開了用唾液中的腎上腺皮質(zhì)甾醇和/或其代謝物的濃度作為指標來量化壓力的方法。JP-A-2000-131318公開了允許用生物物質(zhì)將壓力水平作為“舒適”或“不舒適”，其中利用在血液等中包含的生物物質(zhì)如內(nèi)啡肽、多巴胺、免疫球蛋白Α、和前列腺素D2作為指標。其中在血液、尿液、或唾液中包含的生理活性物質(zhì)用作指標的生物信息獲取方法是有利的，因為這些方法比涉及心理評價、生理測試、或行為測量的方法更簡單，且不需要大型設(shè)備。不久以前，在給定社會中的人具有或多或少相同的生活方式。為了更具體，我們習(xí)慣于在大約相同的時間上床和起床，在每天大約相同的時間進食，且基本在每天相同的時間工作。如今，人們自由選擇他們自己的生活方式生活。日常習(xí)慣模式，如起床時間和就寢時間、飲食、和進食時間隨不同個體而顯著不同。而且，工作方式的更多便利和多樣化產(chǎn)生了大群極度缺少鍛煉時間和鍛煉強度的人。這樣的生活方式的多樣化在過去幾十年的非常短時間內(nèi)快速發(fā)生。生理上不能適應(yīng)這樣的生活方式的變化，導(dǎo)致許多人產(chǎn)生生理和精神痛苦。這些情形已產(chǎn)生了每個個體需要考慮他/她自己的生活方式，適當(dāng)管理他/她健康的情形。而且，生活方式的多樣化產(chǎn)生了需要開發(fā)針對特定生活方式的商品和服務(wù)、或銷售策略規(guī)劃。健康管理和開發(fā)適于不同個體生活方式的商品要求這樣的手段(措施，means)，即利用該手段，多種生活方式都可以標準方式表達和評價。然而，可利用用于個別地表達和評價不同模式的日常習(xí)慣，如起床時間和就寢時間、飲食、進食時間、以及鍛煉時間和鍛煉強度的指標，但還不能獲得可用于綜合表達和評估這些作為生活方式的日常習(xí)慣的指標。

發(fā)明內(nèi)容
如上所述，需要這樣的手段，利用該手段，生活方式的多樣化可以標準化的方式表達和評估，該標準化的方式用于健康管理和以適于不同個體生活方式的方式開發(fā)商品。煙酰胺代謝物量可用作反映疾病的指標，如代謝綜合征、癌癥、癡呆、和糖尿病、以及關(guān)于疲勞或壓力的活生物體的生理狀態(tài)。因此，如果反映這樣的生理狀態(tài)的煙酰胺代謝物量能夠利用以微創(chuàng)方式可從活生物體采集的樣品，如唾液或尿液進行測量，則可以獲取有用的信息，包括關(guān)于形成諸如上述疾病的風(fēng)險、或有無發(fā)作的信息、關(guān)于疲勞或壓力狀態(tài)的信息、甚至關(guān)于生活方式的信息。使用血液作為樣品涉及血液采集，這是創(chuàng)傷性的，且對活生物體有精神上或身體上的要求。這可以作為壓力感知，并且可引起活生物體生理狀態(tài)的變化，且阻止獲取精確的生物信息。因此，如上所述，優(yōu)選用于煙酰胺代謝物量的測量的樣品能夠以微創(chuàng)方式從活生物體中采集，如從來自唾液或尿液。因此，期望提供一種基于能夠以微創(chuàng)方式從活生物體中采集的樣品中的煙酰胺代謝物量，獲取有用的生物信息的方法，該生物信息包括關(guān)于形成諸如代謝綜合征的風(fēng)險、或有無發(fā)作的信息，關(guān)于疲勞狀態(tài)或其他狀況的信息，以及關(guān)于生活方式的信息。根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式，提供了一種生物信息獲取方法，包括測量能夠以微創(chuàng)方式從活生物體中采集、且選自口腔粘膜上皮細胞(oral mucosa epithelial cell)、唾液和表皮體液(表皮流體，epidermal fluid)的一個或多個樣品中的煙酰胺代謝物的量，并基于測得的煙酰胺代謝物的量獲取關(guān)于活生物體的信息。在該生物信息獲取方法中，煙酰胺代謝物可以是選自煙酰胺、煙酰胺單核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸中的一種或多種。該生物信息獲取方法可用于獲取關(guān)于選自代謝綜合征、癌癥、疲勞、壓力、癡呆、糖尿病、生物節(jié)律(biological rhythm)和生活方式中的一種或多種的生物信息。而且，根據(jù)本公開內(nèi)容的另一個實施方式，提供了一種煙酰胺代謝物測量方法，用于測量選自口腔粘膜上皮細胞、唾液和表皮體液中的一個或多個生物樣品中的煙酰胺代謝物的量，其中煙酰胺代謝物量反映了活生物體的生理狀態(tài)。在本公開內(nèi)容中，“關(guān)于活生物體的信息(生物信息)”涵蓋關(guān)于個體活生物體的生理狀態(tài)的寬范圍的信息。具體地，生物信息是關(guān)于例如形成疾病，如代謝綜合征、癌癥、癡呆、和糖尿病，這些疾病與煙酰胺代謝物量有可能的關(guān)聯(lián)，或有無發(fā)作的信息。生物信息也指關(guān)于例如疲勞狀態(tài)、壓力、生物節(jié)律、或生活方式的信息。而且，在本公開內(nèi)容中，“生物節(jié)律”是指在生物現(xiàn)象中觀察到的自發(fā)振蕩周期節(jié)律。生物節(jié)律決定了在不同生物現(xiàn)象中觀察到的并控制活生物體生理狀態(tài)的寬范圍的節(jié)律。例如，熟知的約M小時周期的晝夜節(jié)律(circadian rhythm)決，定了睡-醒節(jié)律，以及體溫、血壓和荷爾蒙分泌水平的每日波動節(jié)律，控制這些生理狀態(tài)。生物節(jié)律由一組稱為 “生物鐘(internal clock) ”的基因控制。時鐘基因充當(dāng)“生物鐘”，因而這些基因的行為， 包括表達、活動、和定位以周期方式自發(fā)改變(振蕩)，控制生物節(jié)律，以及由生物節(jié)律控制的不同生理狀態(tài)。而且，在本公開內(nèi)容中，“生活方式”指一個人按不同模式的日常習(xí)慣定義的日常生活的方式，如睡眠的起床時間和就寢時間，飲食和進食時間、以及鍛煉時間和鍛煉強度。 注意，“日常習(xí)慣”包括日常生活中進行的寬范圍的活動，包括睡眠、進食、鍛煉、洗澡、飲酒、 抽煙、乘車上學(xué)或上班、以及看電視和顯示器。本公開內(nèi)容提供基于能夠以微創(chuàng)方式從活生物體內(nèi)采集的樣品中的煙酰胺代謝物的量，獲取有用的生物信息的方法，包括關(guān)于形成疾病的風(fēng)險如代謝綜合征、或有無發(fā)作的信息，關(guān)于疲勞狀態(tài)或其他狀況的信息，以及關(guān)于生活方式的信息。


圖IA和圖IB是解釋從手指的皮膚表面獲取生理活性物質(zhì)的方法的圖示。圖2是表示口腔粘膜上皮細胞中的NAD+和NADH量的測量結(jié)果的曲線(試驗例 1)。圖3是表示唾液中的皮質(zhì)醇量的測量結(jié)果的曲線(試驗例1)。圖4是表示口腔粘膜上皮細胞中的CL0CK/BMAL1表達水平的測量結(jié)果的曲線(試驗例1)。 圖5是表示唾液和表皮體液中的NAD+和NADH量的測量結(jié)果的曲線(試驗例2)。圖6A到圖6C是表示檢測表皮體液中的NMN、NAD+、和NA的結(jié)果的色譜圖(試驗例2)。圖7是表示鍛煉負荷(運動負荷，exercise load)后表皮體液中的煙酰胺代謝物量的測量結(jié)果的曲線(試驗例3)。圖8A和圖8B是表示醒來后表皮體液中的煙酰胺代謝物量的測量結(jié)果的曲線(試驗例3)。圖9A和圖9B是表示進食后表皮體液中的煙酰胺代謝物量的測量結(jié)果的曲線(試驗例3)。圖10是表示攝入酒精后表皮體液中的煙酰胺代謝物量的測量結(jié)果的曲線(試驗例3)。圖IlA和圖IlB是表示年齡增加與表皮體液中的煙酰胺代謝物量之間關(guān)系的曲線 (試驗例3)。圖12A和圖12B是表示在將皮質(zhì)醇加入培養(yǎng)液后培養(yǎng)的皮膚的表皮表面的角質(zhì)層上的煙酰胺代謝物量的測量結(jié)果的曲線(試驗例4)。圖13A和圖1 是表示在將葡萄糖加入培養(yǎng)液后培養(yǎng)的皮膚的表皮表面的角質(zhì)層上的煙酰胺代謝物量的測量結(jié)果的曲線(試驗例4)。圖14是解釋煙酰胺代謝物的代謝路徑的圖示。
具體實施例方式
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本公開內(nèi)容的發(fā)明人進行了各種研究，目的是利用煙酰胺代謝物量作為指標，獲取生物信息，如關(guān)于形成疾病風(fēng)險如代謝綜合征，或有無發(fā)作的信息，關(guān)于疲勞狀態(tài)的信息，以及關(guān)于生活方式的信息。這些研究揭示了以下的新發(fā)現(xiàn)。(1) 口腔粘膜上皮細胞中的煙酰胺代謝物的量顯示了反映活生物體生理狀態(tài)的變化。(2)從唾液或表皮體液中檢測煙酰胺代謝物也是可能的。(3)表皮體液中煙酰胺代謝物的量顯示了反映活生物體的生活方式的變化。關(guān)于發(fā)現(xiàn)(1)，(Ia)本公開內(nèi)容的發(fā)明人已經(jīng)揭示了，口腔粘膜上皮細胞中的NAD+和NADH量顯示涉及剛醒來后暫時增加的日變化(晝夜變化，diurnal variation)，與唾液中皮質(zhì)醇的量的情形一樣。(Ib)還已經(jīng)揭示了，口腔粘膜上皮細胞中NAD+和NADH量的日變化與口腔粘膜表皮細胞中時鐘基因CL0CK/BMAL1軛合物(結(jié)合物，conjugate)的表達水平的日變化反相(逆相，antiphase)。熟知唾液中的皮質(zhì)醇類，如皮質(zhì)醇、皮質(zhì)脂酮、和皮質(zhì)酮的分泌量與活生物體的壓力狀態(tài)有關(guān)聯(lián)(參見 Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotidebiosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy, J Neurosci,,2006，Aug 16 ；26 (33) :8484-91)。CLOCK和BMALl是通過寬泛地決定在各種生物現(xiàn)象如睡眠和覺醒、體溫、血壓、和荷爾蒙分泌中觀察到的生物節(jié)律而控制活生物體生理狀態(tài)的代表性時鐘基因?？谇徽衬ど掀ぜ毎蠳AD+和NADH量顯示在皮質(zhì)醇和CL0CK/BMAL1中觀察到的變化是常見的變化的事實，表明NAD+和NADH量的變化也反映活生物體的生理狀態(tài)，且因此能夠用作生理狀態(tài)的指標，如在皮質(zhì)醇和CL0CK/BMAL1中一樣。關(guān)于發(fā)現(xiàn)(3)，發(fā)現(xiàn)表皮體液中的NAD+和NADH的量以這樣的方式改變，即反映日常習(xí)慣模式，包括睡眠、進食、和鍛煉、以及活生物體的年齡的方式。本公開內(nèi)容的發(fā)明人基于這些發(fā)現(xiàn)，完成了生物信息獲取方法，其中測量能夠以微創(chuàng)方式從活生物體中采集的口腔粘膜上皮細胞或表皮體液中的煙酰胺代謝物的量，并基于測得的煙酰胺代謝物的量獲取關(guān)于活生物體的信息。而且，關(guān)于發(fā)現(xiàn)O)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，從唾液中檢測煙酰胺代謝物也是可能的，并設(shè)計了一種利用唾液作為能夠以微創(chuàng)方式從活生物體中采集的樣品來獲取生物信息的方法。關(guān)于發(fā)現(xiàn)(1)和C3)，已經(jīng)實施了測量在各種類型的細胞中的煙酰胺代謝物量。然而，沒有表明能夠以方便、微創(chuàng)方式從活生物體采集的口腔粘膜上皮細胞或表皮體液中煙酰胺代謝物的量顯示反映活生物體的生理狀態(tài)變化的報道。而且，關(guān)于發(fā)現(xiàn)O)，沒有從不同于血液(血漿)的非細胞樣品(noncellularsample)如唾液和表皮體液檢測出煙酰胺代謝物的報道。從表皮體液獲得煙酰胺代謝物的機理可能涉及煙酰胺代謝物分泌到例如汗液或皮脂中的可能性。還有這樣的可能，即血液中煙酰胺代謝物穿過體表細胞到達體表。下面描述根據(jù)本公開內(nèi)容的獲取生物信息方法的優(yōu)選實施方式。應(yīng)該注意，下面所述的實施方式僅是本公開內(nèi)容的示例性實施方式，而不能解讀為限制本公開內(nèi)容的范圍。以下面的順序進行描述。1、樣品采集
(1) 口腔粘膜上皮細胞的采集(2)唾液的采集(3)表皮體液的采集2、樣品中煙酰胺代謝物的量的測量(1)體外測量(2)體內(nèi)測量3、生物信息的獲取1.樣品采集本公開內(nèi)容的實施方式的生物信息獲取方法首先測量以微創(chuàng)方式可從活生物體采集的樣品中的煙酰胺代謝物的量。然后基于測得的煙酰胺代謝物的量獲取下面所述的生物信息。具體地，口腔粘膜上皮細胞、唾液、或體表體液被用作以微創(chuàng)方式可從活生物體采集的樣品。采集每個樣品的方法如下。(1) 口腔粘膜上皮細胞的采集口腔粘膜上皮細胞是能夠以最小創(chuàng)傷方式從活生物體采集的細胞樣品的一個實例。口腔粘膜上皮細胞能夠利用工具，如刷子和刮板從口腔粘膜表面刮取細胞采集。采集的部位優(yōu)選是面頰背面上的粘膜。用刷子等采集的口腔粘膜上皮細胞能夠通過填充在樣品管中的緩沖液，如磷酸鹽緩沖液(PBQ洗滌刷子而采集在樣品管中。這里，細胞要么利用例如包含表面活性劑的緩沖液進行細胞溶解，要么通過例如在緩沖懸浮液中超聲處理而物理分裂并細胞溶解，以便制備包含來源于口腔粘膜上皮細胞的煙酰胺代謝物的樣品溶液。(2)唾液的采集唾液是非細胞樣品，且能夠以微創(chuàng)方式從活生物體采集。唾液能夠通過例如將濾紙或毛細管放入口腔中并允許唾液吸收到濾紙或進入毛細管而被采集。采集的唾液被直接制備為含煙酰胺代謝物的樣品溶液或在緩沖液中的樣品溶液。(3)表皮體液的采集表皮體液，如汗液和皮脂也是非細胞樣品，且能夠以微創(chuàng)方式從活生物體采集。表皮體液可通過濾紙或毛細管與體表接觸，并允許表皮體液吸收到濾紙或進入毛細管而采集。采集的表皮體液被直接或在緩沖液中制備為含煙酰胺代謝物的樣品溶液。可替換地，溶劑可以接觸體表從而將表皮體液采集在溶劑中并制備樣品溶液。溶劑可以是水或各種有機溶劑，例如酒精水溶液。接觸溶劑的體表沒有特別限制，且能夠方便地使用例如手指或手掌的皮膚表面。作為優(yōu)選的獲取表皮體液程序的具體實例，下面參考圖IA和圖IB描述從手指的皮膚表面獲取表皮體液的方法。圖IA是利用微管(microtube)從食指的皮膚表面獲取表皮體液的程序的圖示。用拇指握持包含溶劑如乙醇水溶液的微管底端，其中微管的上部開口與食指的尖部接觸。在微管以食指和拇指握持下，翻轉(zhuǎn)微管以使溶劑與食指皮膚表面接觸。以該方式， 食指皮膚表面上的表皮體液可采集在容納在微管內(nèi)的溶劑中。圖IB是舉例說明利用注射器從食指的皮膚表面獲取表皮體液的程序的圖示。裝有溶劑如乙醇水溶液的注射器在尖端以拇指和中指握持，其中注射器與食指尖
8部接觸。然后以右手拉注射器的活塞從而在注射器中產(chǎn)生負壓。作為結(jié)果，皮膚表面被注射器吸住，且溶劑接觸食指的皮膚表面。以該方式，相比于利用圖IA中所示的微管的方法，基于注射器的負壓，能夠以更高產(chǎn)率采集接觸皮膚表面的溶劑。在圖IA和圖IB的采集程序中，表皮體液被采集在直接接觸體表的溶劑中；然而，體表體液也可以下面的方式采集在溶劑中。具體地，例如，將塑料板以允許體表上的表皮體液附著到塑料板表面的方式壓靠在體表上。然后，將溶劑滴在塑料板的表面上從而附著的表皮體液溶解并采集在溶劑中。2、樣品中煙酰胺代謝物量的測量制備的樣品溶液中的煙酰胺代謝物量可測量如下。(1)體外測量樣品溶液中的煙酰胺代謝物可通過檢測通過利用諸如液相色譜(HPLC)和毛細管電泳的技術(shù)分離的分子的光吸收、熒光、或氧化還原電勢而進行測量。以該方法，可以利用通過使HPLC移動相溶劑或毛細管電泳凝膠直接接觸皮膚表面而采集的表皮體液進行測量。煙酰胺代謝物量也可以通過檢測樣品溶液和包含氧化還原酶和底物加輔酶NAD+和NADH的反應(yīng)液體的混合物中的NAD+和NADH的氧化還原電勢而進行測量。例如，心肌黃酶和2-氨基-1，4-萘醌(ANQ)可用作氧化還原酶和底物。利用NAD+和NADH的氧化還原電勢進行煙酰胺代謝物量的測量是在NMN (用Nampt從樣品溶液中的NA轉(zhuǎn)化而來)用Nmnat轉(zhuǎn)化為 NAD+之后進行的。Further, measurement may be made using the epidermal fluidcollected by directly contacting the reaction liquid to the skin surface.在這種方法中，可在用刷子等采集口腔粘膜上皮細胞，或采集的唾液直接采集到反應(yīng)液體中之后進行測量。而且，可以利用通過使反應(yīng)液體直接接觸皮膚表面采集的表皮體液進行測量。而且，煙酰胺代謝物量的測量可以使用利用酶循環(huán)反應(yīng)的比色分析進行。使用比色分析的測量可以利用商購試劑盒實施(參見下面描述的實驗例1)。(2)體內(nèi)測量在本公開內(nèi)容的實施方式中，煙酰胺代謝物的量利用從活生物體采集的口腔粘膜上皮細胞、唾液、和表皮體液進行測量。然而，關(guān)于口腔粘膜上皮細胞，測量方法不限于在采集和分離的細胞中的煙酰胺代謝物量的測量，并且口腔粘膜上皮細胞中的煙酰胺代謝物的量可以原位測量，而無需從活生物體分離細胞。原位測量口腔粘膜上皮細胞中的煙酰胺代謝物量的方法的一個實例是基于NADH的自身熒光實施測量的方法。NADH在約350nm的激發(fā)波長，以及約450nm的發(fā)射波長處展現(xiàn)自身熒光。因而，在用飛秒激光(femtosecond laser)輻照口腔粘膜后，通過檢測通過多光子激發(fā)在上皮細胞中的NADH的自身熒光，基于熒光強度的NADH的量化是可能的。使用多光子使得能夠測量細胞中的煙酰胺代謝物的量，同時不損傷粘膜。注意該方法也可用于皮膚細胞中的煙酰胺代謝物量的原位測量。對于表皮體液中的煙酰胺代謝物量的原位測量，可使用這樣的方法，其中例如固定與煙酰胺代謝物特異性地發(fā)生反應(yīng)(相互作用)的酶的電極或FET傳感器與皮膚表面接觸。3、生物信息的獲取CN 102375049 A
說明書
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煙酰胺代謝物的測定量可用作反映活生物體的生理狀態(tài)的指標。本公開內(nèi)容的實施方式的生物信息獲取方法可用來基于煙酰胺代謝物量，獲取有用的生物信息，如關(guān)于形成疾病如代謝綜合征、癌癥、癡呆、和糖尿病，它們可能與煙酰胺代謝物量關(guān)聯(lián)的風(fēng)險，或有無發(fā)作的信息，關(guān)于疲勞或壓力的信息，以及關(guān)于生活方式的信息。該生物信息獲取方法使用口腔粘膜上皮細胞、唾液、或體表體液作為能夠以微創(chuàng)方式從活生物體采集的樣品，并因此可用于便利地獲取生物信息。當(dāng)體表體液用作樣品時， 反映對象的生理狀態(tài)的信息可特別精確地進行獲取，而無需使對象太擔(dān)心采集程序。因此， 根據(jù)本公開內(nèi)容的實施方式的生物信息獲取方法可用來發(fā)現(xiàn)活生物體的健康狀況，用于疾病、疲勞、和壓力的診斷、預(yù)防、和預(yù)后。而且，該方法可用來提供反映日常習(xí)慣如起床時間和就寢時間、飲食、進食時間、和鍛煉時間和鍛煉強度的指標，且因此能夠提供以標準化方式表達和評估各種各樣的生活方式的裝置。實施例試驗例11、口腔粘膜上皮細胞中的NAD+和NADH量的測量上皮細胞利用刷子(CytoSoft細胞檢查刷；Medical Packaging Corp.)從單個對象(成年男性)的口腔粘膜采集。細胞是以4小時間隔共采集九次。第一次采集在7:00 在對象醒來后立即進行，然后分別在11:00、15:00、和19:00、以及在23:00剛要就寢前進行一系列采集，最后在3:00在暫時喚醒對象后進行。每次采集三個樣品。每個采集時間采集的細胞通過在緩沖液(20mM Tris_HCl，pH7. 5，150mM NaCl，ImM EDTA，和的蔗糖單月桂酸酯)中細胞溶解而破碎。然后利用2μ 1得到的細胞溶解產(chǎn)物 (cell lysate)用商購比色分析試劑盒(Amplite Colorimetric NAD/NADH Assay Kit ；ABD Bioquest Inc.)測量NAD+和NADH的量。測量結(jié)果在圖2中給出。2、唾液中皮質(zhì)醇量的測量唾液利用Sorbette(Salimetrics)采集。在用唾液浸泡Sorbette棉后，將塑料柄部對半切開，并置于2. 0-ml試管中，然后將其離心以采集唾液。皮質(zhì)醇的量用商購酶免疫測定(EIA)試劑盒(Salivary Cortisol EIAKit ；Salimetrics)利用唾液來測量。測量結(jié)果在圖3中給出。3、口腔粘膜上皮細胞中的CL0CK/BMAL1表達水平的測量CL0CK/BMAL1軛合物的表達水平根據(jù)JP-A-2008-67694的方法，利用通過破碎采
集的口腔粘膜上皮細胞而獲得的一部分細胞溶解產(chǎn)物進行測量。首先，合成分別連接到CL0CK/BMAL1軛合物的DNA結(jié)合序列(SEQ ID NO 1)的 5，-端和3，-端的帶有熒光染料(FITC)的oligoDNA和淬滅物質(zhì)(quencher substance) (BHQ)的寡DNA(oligoDNA)作為檢測核酸鏈(參見表1)。SEQ ID NO=I的堿基序列是作為轉(zhuǎn)錄因子的CL0CK/BMAL1軛合物的識別序列。CL0CK/BMAL1軛合物識別這個序列，并在結(jié)合到該 DNA 后展現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性。An oligoDNA with the base sequence of SEQ ID NO: 2 was also synthesized as the complementary nucleic acid chain that binds to the detection nucleic acid chain to form a double strand (see Table 1).還合成帶有SEQ ID NO :2的堿基序列的寡DNA作為結(jié)合到檢測核酸鏈(detection nucleic acid chain)從而形成雙鏈(double strand)的互補核酸鏈(complementary nucleic acid
10chain)(參見表 1)。表 權(quán)利要求
1.一種生物信息獲取方法，包括測量能夠以微創(chuàng)方式從活生物體采集的樣品中的煙酰胺代謝物的量；以及基于測得的所述煙酰胺代謝物的量，獲取關(guān)于所述活生物體的信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述樣品是選自由口腔粘膜上皮細胞、唾液和表皮體液組成的組中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述煙酰胺代謝物是選自由煙酰胺、煙酰胺單核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸組成的組中的一種或多種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，獲取的所述生物信息是關(guān)于選自由代謝綜合征、 癌癥、疲勞、壓力、癡呆、糖尿病、生物節(jié)律和生活方式組成的組中的一個或多個的信息。
5.一種煙酰胺代謝物測量方法，包括測量選自由口腔粘膜上皮細胞、唾液和表皮體液組成的組中的一個或多個生物樣品中的煙酰胺代謝物的量，其中，所述煙酰胺代謝物的量反映所述活生物體的生理狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明申請涉及生物信息獲取方法和煙酰胺代謝物測量方法。更具體地，涉及一種生物信息獲取方法，包括測量能夠以微創(chuàng)方式從活生物體采集的樣品中的煙酰胺代謝物的量；以及基于測得的煙酰胺代謝物的量獲取關(guān)于該活生物體的信息。
文檔編號G01N30/74GK102375049SQ20111009093
公開日2012年3月14日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者中川和博 申請人:索尼公司