專利名稱：用于選擇患者的生物標(biāo)志物及相關(guān)方法
用于選擇患者的生物標(biāo)志物及相關(guān)方法本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是針對由例如感染所引起的疾病或者癌癥對患者進(jìn)行免疫治療。更具體地，本發(fā)明涉及用于在此種免疫治療后預(yù)測患者是否易于產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明涉及通過免疫原性組合物，特別是治療性疫苗來提高待治療的患者的存活率的方法和組合物。常規(guī)免疫接種技術(shù)已久為人知，其涉及向動物系統(tǒng)中引入抗原(如肽、蛋白質(zhì))， 該抗原可誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，從而對所述動物提供針對例如感染的保護(hù)。這些技術(shù)還包括開發(fā)活疫苗及滅活疫苗。活疫苗一般是感染原的經(jīng)減毒的非病原性形式，能夠引發(fā)針對該感染原的病原形式的免疫應(yīng)答。許多研究小組也已經(jīng)研究了疫苗作為對多種癌癥類型的潛在的治療方式的用途。 這種疫苗策略的特定類型一般稱為免疫治療。近年來，重組疫苗、特別是重組活疫苗的研發(fā)取得了進(jìn)展，其中載體編碼和表達(dá)目的外源抗原。其中，基于重組病毒的載體已顯示很有前途，并在新疫苗的開發(fā)中發(fā)揮重要作用。已對許多病毒研究了其表達(dá)來自外源病原體或腫瘤組織的蛋白質(zhì)的能力，以及在體內(nèi)誘導(dǎo)針對這些抗原的特異性免疫應(yīng)答的能力。這些基于基因的疫苗一般能刺激高效的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且病毒載體可能對于遞送抗原編碼基因以及促進(jìn)和增強(qiáng)抗原呈遞而言都是有效的策略。為了作為疫苗載體，理想的病毒載體應(yīng)該是安全的，并能向免疫系統(tǒng)高效呈遞所需的病原體特異性抗原。此外，載體系統(tǒng)必須滿足使其能夠大規(guī)模生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。因此，目前已經(jīng)出現(xiàn)了一些病毒疫苗載體，它們根據(jù)所提出的應(yīng)用均具有相對的優(yōu)點(diǎn)和局限性(重組病毒疫苗的綜述參閱如 Harrop 和 Carroll，2006，F(xiàn)ront Biosci. , 11,804-817 ； Yokoyama 等，1997，J Vet Med Sci.，59，311-322)。在二十世紀(jì)九十年代初期觀察到質(zhì)粒DNA載體可在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞之后， 已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究來開發(fā)通過直接向動物中引入編碼抗原的DNA而基于使用DNA質(zhì)粒來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫接種技術(shù)。這些通稱為DNA免疫接種的技術(shù)目前已經(jīng)用于在大量疾病模型中引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。DNA疫苗的綜述參閱Reyes-Sandoval和Ertl， 2001 (Current Molecular Medicine,1，217—243)。然而，在疫苗領(lǐng)域的一個一般性問題是鑒定在接種的個體中誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的免疫應(yīng)答以保護(hù)和/或治療免于感染和疾病的手段，從而延長患有致命性疾病例如癌癥的患者的存活。因此，近年來已進(jìn)行了大量工作來發(fā)現(xiàn)通過刺激免疫系統(tǒng)的某些關(guān)鍵方面來發(fā)揮作用的新藥物化合物，用于提高疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。多數(shù)這些化合物(稱為免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(IRM)或佐劑)似乎都通過基礎(chǔ)免疫系統(tǒng)機(jī)制，經(jīng)由Toll樣受體(TLI )誘導(dǎo)多種重要細(xì)胞因子(例如干擾素、白介素、腫瘤壞死因子等。參閱如khiller等，2006，Exp Dermatol. ,15,331-341)的生物合成發(fā)揮作用。這些化合物已顯示刺激迅速釋放某些T細(xì)胞、樹突細(xì)胞、或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，還能刺激淋巴細(xì)胞功能，例如B細(xì)胞分泌在IRM化合物的抗病毒及抗腫瘤活性中發(fā)揮重要作用的抗體。備選地，已經(jīng)提出了免疫接種策略，其中多數(shù)是基于引發(fā)-加強(qiáng)免疫接種的方案。根據(jù)這些“引發(fā)-加強(qiáng)”的免疫接種方案，首先通過對患者施用引發(fā)組合物對免疫系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)，然后通過施用加強(qiáng)的第二組合物進(jìn)行加強(qiáng)(參閱如EP1411974或US20030191076)。此外，在醫(yī)療保健背景中已顯示一種治療可能僅在特定組的患者中有效。因此希望為醫(yī)生提供使他們能夠定制最佳的個性化患者療法的工具和方法，即在適當(dāng)?shù)臅r間對適當(dāng)?shù)幕颊咧甘具m當(dāng)?shù)寞煼ㄒ蕴峁└叩闹委煶晒β?，監(jiān)控對治療的反應(yīng)，提高藥物效力和安全性，消除對患者的不必要的治療(對患者不合適的療法)，減少患者的不必要的毒性和副作用，降低患者和保險公司的不必要或危險的無效藥物的費(fèi)用，并提高患者的生活質(zhì)量， 最終使癌癥成為可控的疾病，并根據(jù)情況跟進(jìn)測定。在這一點(diǎn)上，文獻(xiàn)提出了多種工具和方法，例如-藥物遺傳學(xué)，其包括根據(jù)遺傳差異對藥物的個體反應(yīng)的研究。這些反應(yīng)涉及藥物如何在任意給定個體中發(fā)揮功能，其如何被代謝，其毒性和劑量要求。隨著人類基因組計劃的發(fā)展，藥物遺傳學(xué)已擴(kuò)大為藥物基因組學(xué)。藥物基因組學(xué)超越了藥物遺傳學(xué)，可能在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)、靶發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)和臨床試驗中發(fā)揮作用。-也可在預(yù)測醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用代謝組學(xué)(Metabolomics)。與局限于遺傳因子的藥物遺傳學(xué)不同，藥物代謝組學(xué)能夠不但基于遺傳因素而且基于非遺傳因素，例如在患者體內(nèi)的其他藥物，患者目前的健康狀態(tài)等等預(yù)測個體對藥物的反應(yīng)。-生物標(biāo)志物在治療學(xué)的臨床發(fā)展中具有越來越重要的作用。生物標(biāo)志物可為正常生物學(xué)過程、疾病過程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理學(xué)反應(yīng)的指示劑。其作用范圍從對患者群體分組以幫助鑒定應(yīng)答者和非應(yīng)答者，以測定治療的效力。生物標(biāo)志物可作為有價值的工具用于進(jìn)行更好的決策以減少藥物開發(fā)的費(fèi)用和使治療更快地應(yīng)用于最適當(dāng)?shù)幕颊呷后w。本發(fā)明提供了使用生物學(xué)標(biāo)志物(生物標(biāo)志物(biomarker))預(yù)測涉及對患者施用免疫原性組合物(即免疫療法治療)的治療效力的材料和方法，所述生物標(biāo)志物已確定是和預(yù)期臨床結(jié)果相關(guān)的基本可信的信號。在用所述免疫原性組合物治療之前，生物標(biāo)志物存在于從患者處得到的生物樣品中。在治療開始以前預(yù)測治療的臨床效果的能力使臨床醫(yī)生和患者能夠鑒定無效的治療，對相關(guān)治療過程進(jìn)行知情決策，包括是否放棄或允許實施備選的療法。本申請人現(xiàn)已鑒定出新的工具和免疫接種策略。更具體地，本發(fā)明涉及白細(xì)胞介素10/干擾素Y(IL10/IFNY)的比率作為預(yù)測患者是否易于產(chǎn)生通過施用免疫原性組合物的預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答的生物標(biāo)志物的用途。備選地，根據(jù)本發(fā)明， 能夠?qū)⒏蓴_素Y/白細(xì)胞介素10 (IFNY/IL10)比率用作生物標(biāo)志物，但是在那種情況下應(yīng)該改變結(jié)論。Van den Boogaardt 等，2006 (Transplantation，82，844-848)已經(jīng)顯示了干擾素 Y/白細(xì)胞介素10(IFNy/IL10)比率是區(qū)分對于腎臟移植非排異和排異患者的有價值的工具。Jamal等，2007，(Tuberculosis，87，279-287)已經(jīng)顯示在肺和肺外結(jié)核中，干擾素Y/白細(xì)胞介素10 (IFNY/IL10)比率和疾病嚴(yán)重度等級之間有直接的關(guān)系。才目 1以地，Gomes-Silva 等，2007， (Clinical and Experimental Immunology, 149, 440-444)表明高IFNy和低ILlO與黏膜利什曼病的嚴(yán)重度相關(guān)聯(lián)。根據(jù)第一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物來治療患者的人類疾病的方法，其中所述患者選自由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群。因此，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物來治療患者的人類疾病的方法，所述方法包括以下步驟-在由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群中選擇一個患者，-對所選患者施用所述免疫原性組合物。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物，預(yù)測患者是否易于產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括步驟-從患者獲得血液樣品；-在所述血液樣品中測量ILlO和IFNγ的水平，和-計算IL10/IFNY比率，其中低IL10/IFNγ比率說明預(yù)測患者對產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答具有增加的易感性。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物，選擇易于產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答的患者的方法，所述方法包括步驟-從患者獲得血液樣品；-在所述血液樣品中測量ILlO和IFNγ的水平，和-計算IL10/IFNY比率，其中低IL10/IFNγ比率說明患者對產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答具有增加的易感性。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及預(yù)測患者是否易于積極地對包括施用免疫原性組合物的治療產(chǎn)生應(yīng)答的方法，所述方法包括步驟-從患者獲得血液樣品；-在所述血液樣品中測量ILlO和IFNγ的水平，和-計算IL10/IFNY比率，其中低IL10/IFNγ比率說明預(yù)測患者對產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答具有增加的易感性。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及選擇易于積極地對包括施用免疫原性組合物的治療產(chǎn)生應(yīng)答的患者的方法，所述方法包括步驟-從患者獲得血液樣品；-在所述血液樣品中測量ILlO和IFNγ的水平，和
-計算IL10/IFNY比率，其中低IL10/IFNγ比率說明患者對產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答具有增加的易感性。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及測試患者是否將會對包括施用免疫原性組合物的治療方法產(chǎn)生治療性應(yīng)答的離體方法(ex-vivo method)，其中測試方法包括步驟-從患者獲得血液樣品；-在所述血液樣品中測量ILlO和IFNy的水平，和-計算IL10/IFNY比率，其中低IL10/IFNγ比率說明患者將對免疫原性組合物產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及測試患者是否會對通過施用免疫原性組合物治療癌癥的方法產(chǎn)生治療性應(yīng)答的離體方法，其中測試方法包括步驟-從患者獲得血液樣品；-在所述血液樣品中測量ILlO和IFNγ的水平，和
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-計算IL10/IFNY比率，其中低ILIO/IFNY比率說明患者將對治療癌癥的方法產(chǎn)生治療性應(yīng)答。本發(fā)明還涉及包括施用免疫原性組合物的離體方法，其中測試方法包括步驟為 測量ILlO和INFY在來自患者的生物樣品，特別地血液樣品中的水平，計算ILIO/IFNY比率，其中低IL10/IFNY比率說明患者將對免疫原性組合物產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，特別地免疫應(yīng)答。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，其中所述患者選自由具有低ILlO/ IFNy比率的患者組成的患者群。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)對至少一個抗原的免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，其中所述患者選自由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，其中所述患者選自由具有低ILlO/ IFNy比率的患者組成的患者群且其中所述產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是先天免疫應(yīng)答。先天免疫應(yīng)答是針對病原體的身體最初免疫防御且由多種細(xì)胞包括抗原呈遞細(xì)胞或者“APC”引發(fā)。這些細(xì)胞表達(dá)識別外源來源的分子(例如，細(xì)菌和病毒核酸、蛋白質(zhì)、碳水組合物)的表面和胞質(zhì)受體。在檢測到這些信號后，樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞引發(fā)了防御性應(yīng)答，包括細(xì)胞因子 (包括干擾素、TNF-α和IL-12)和吸引細(xì)胞如未成熟的樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒細(xì)胞到攻擊部位的趨化因子的釋放。因此，當(dāng)身體在產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答的同時，先天免疫應(yīng)答賦予了非特異性保護(hù)。因此，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，所述方法包括以下步驟-在由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群中選擇一個患者，-對所選患者施用所述免疫原性組合物。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)對至少一種抗原的免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，所述方法包括以下步驟-在由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群中選擇一個患者，-對所選患者施用所述免疫原性組合物。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，其中所述所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是先天免疫應(yīng)答，所述方法包括以下步驟-在由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群中選擇患者，-對所選患者施用所述免疫原性組合物。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，所述方法包括以下步驟-在患者中測量ILlO和IFNy的水平，-計算IL10/IFNY 比率，禾口
-如果所述患者具有低IL10/IFNγ比率，對患者施用所述免疫原性組合物。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)對至少一種抗原的免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，所述方法包括以下步驟-在患者中測量ILlO和IFNγ的水平，-計算IL10/IFNY 比率，禾口-如果所述患者具有低IL10/IFNγ比率，對患者施用所述免疫原性組合物。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及通過施用免疫原性組合物而在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)用于治療人類疾病的方法，其中所述產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是先天免疫應(yīng)答，所述方法包括以下步驟-在患者中測量ILlO和IFNγ的水平，-計算IL10/IFNY 比率，禾口-如果所述患者具有低IL10/IFNY比率，對患者施用所述免疫原性組合物。本申請全文中，術(shù)語單數(shù)形式(“a”和“an”)以表示“至少一個”、“一個或多個” 或“多個”所述組合物或步驟的含義使用，除非其上下文另有說明。例如，術(shù)語“細(xì)胞”包括多個細(xì)胞，包括其混合物。更具體地，“至少一個”和“一個或多個”是指等于或大于1的數(shù)， 特別是1、2或3。本文中使用的全部術(shù)語“和/或”均包括“和”、“或”以及“所述術(shù)語連接的要素的全部或任何其他組合”的含義。本文使用的術(shù)語“約”表示在20%之內(nèi)，優(yōu)選在10%之內(nèi)，更優(yōu)選在5%之內(nèi)。為了明確，加入了 “約X”為包括X的具體值。術(shù)語“患者”、“受試者”指脊椎動物，特別是哺乳動物物種的成員，包括但不僅限于家畜、競技動物、靈長類(包括人)。本文使用的術(shù)語“治療”包括預(yù)防和/或治療。因此，本發(fā)明的免疫原性組合物或方法不僅限于治療應(yīng)用，并且可用于預(yù)防應(yīng)用。這由文中“產(chǎn)生預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答” 涵蓋。“預(yù)防”不僅限于防止立即發(fā)生的疾病(如感染性疾病)，還包括預(yù)防這些感染的長期后果，例如硬化或癌癥。活性化合物的“有效量”或“足量”是足以實現(xiàn)有益或期望的結(jié)果(包括臨床結(jié)果) 的量。有效量可在一次或多次給藥中施用?！爸委熡行Я俊笔菍崿F(xiàn)有益臨床結(jié)果的量，包括但不僅限于緩解與病毒感染相關(guān)的一種或多種癥狀以及預(yù)防疾病(例如預(yù)防感染的一種或多種癥狀)。術(shù)語“在由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群中選擇的患者”應(yīng)當(dāng)理解為是指患者的白細(xì)胞介素10和干擾素Y的水平已經(jīng)如本文所公開來測量，且其具有低 ILlO/IFNy比率。當(dāng)測試的患者的數(shù)量大于1時，所述患者形成患者群。根據(jù)具體的實施方案，術(shù)語“治療性應(yīng)答的患者”或“對治療積極地應(yīng)答的患者”意指所述患者具有增加的存活率(參閱實施例部分)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括初始步驟，其在于在施用免疫原性組合物之前在來自患者的生物樣品中測量白細(xì)胞介素10和干擾素Y水平。根據(jù)本發(fā)明，在獲得自患者的生物樣品中測量白細(xì)胞介素10和干擾素Y的水平。生物樣品包括但不局限于血液和生物來源的其他液體樣品、固體組織樣品，比如活組織檢查標(biāo)本。在優(yōu)選的實施方案中，生物樣品是血液、血漿或血清，在此情況下從患者獲取樣品相對簡單并且是非侵入性操作。獲取血液或血清的方法為本領(lǐng)域公知，不是本發(fā)明的一部分。此外，檢測和定量多肽的多種方法，包括瞬時生物標(biāo)志物，是已知的。此類方法包括但不局限于基于抗體的方法，更具體地基于單克隆抗體的方法。檢測和定量生物標(biāo)志物的具體方法對于本發(fā)明不重要。例如本發(fā)明的材料和方法可用Luminex技術(shù)(Luminex Corporation, Austin, Tex)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA，許多ELISA試劑盒是可商購的，例如，通過 CliniScience、Diaclone、Biosource)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，白細(xì)胞介素10和干擾素Y的水平通過使用抗體測定。根據(jù)本發(fā)明的一個特定的實施方案，所述一個或多個抗體是ILlO或IFNy特異性的。根據(jù)本發(fā)明的一個特定的實施方案，所述抗體是單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明的一個特定的實施方案，所述抗體例如通過熒光、放射性標(biāo)記、酶、生物素、或者任一其它方法示蹤，旨在使標(biāo)記了所述抗體的細(xì)胞是可檢測的。這些技術(shù)在本領(lǐng)域是廣泛使用并已知的。在相關(guān)方面所述方法包括在對患者施用免疫原性組合物前測定患者體內(nèi)白細(xì)胞介素10和干擾素Y的水平；計算IL10/IFNY比率；將所述IL10/IFNY比率和截斷值 (cut-off value)比較；并基于和截斷值比較的IL10/IFN γ比率水平預(yù)測免疫療法治療的效力。根據(jù)特定的實施方案，所述截斷值為約5，優(yōu)選地約4，更優(yōu)選地約3和特別優(yōu)選地約2。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述截斷值為約3. 7，且更優(yōu)選地為3. 7。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，根據(jù)本發(fā)明“低IL10/IFNY比率”指示IL10/IFNY比率在約5以下，優(yōu)選地約4以下并且更優(yōu)選地在約3以下且特別地在約2以下。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，根據(jù)本發(fā)明所述“低IL10/IFNY比率”指示IL10/IFNY比率在約3. 7以下，且更優(yōu)選地為3. 7以下。 根據(jù)優(yōu)選的實施方案，通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、通過Luminex 分析、通過芯片實驗室系統(tǒng)、通過放射免疫測定或使用抗體或其他特異性分子，基于ILlO和IFNy的特異性分子識別的其他系統(tǒng)測量白細(xì)胞介素10和干擾素Y的水平。本文使用的術(shù)語“免疫原性組合物”、“疫苗組合物”、“疫苗”或相似術(shù)語可互換使用，指這樣的藥劑，其適于刺激/誘導(dǎo)/提高患者的免疫系統(tǒng)，以緩解當(dāng)前的病癥，例如提高存活率，或者保護(hù)免于或降低當(dāng)前或?qū)淼膫蚋腥?包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲感染)，例如降低腫瘤細(xì)胞增殖或存活、降低病原體在患者中的復(fù)制或傳播，或者可檢測地減少與病癥相關(guān)的不想要的癥狀、延長患者的存活率。所述免疫原性組合物可至少含有(i) 至少一種靶標(biāo)抗原的全部或一部分，和/或(ii)至少一種在體內(nèi)表達(dá)至少一種異源核苷酸序列的全部或一部分(特別是編碼至少一種靶標(biāo)抗原的全部或一部分的異源核苷酸序列)的重組載體。根據(jù)一個備選的實施方案，本發(fā)明的免疫原性組合物包含(iii)單獨(dú)或與(i)和/或(ii)組合的至少一種免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。這些免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(IRM)的實例包括 CpG 寡核苷酸(參閱如 US 6，194，388 ；US2006094683 ；WO 2004039829)、脂多糖、聚肌苷聚胞苷酸復(fù)合體(Kadowaki等，2001，J. Immunol. 166,2291-2295)以及已知誘導(dǎo)樹突細(xì)胞和/或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的多肽和蛋白質(zhì)。這些免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑(IRM)的其他實例是有機(jī)小分子，例如咪唑并喹啉胺(imidazoq uinolinamine)、 咪唑并吡啶胺(imidazopyridineamines)、6，7-稠合的環(huán)烷基咪唑并吡啶胺(cycloalkyl imidazopyridineamine)、R^P坐并蔡PjSIl安(imidazonaphthyridine amine)、■^坐并木月安 (oxazoloquinoline amine)、噻唑并喹啉胺(thiazoloquinoline amine)禾口 1，2_ 橋接的咪唑并喹啉胺(參閱如 US 4, 689, 338 ；US 5, 389, 640 ；US 6，110，929 和 US 6,331,539)。 在另一個實施方案中，免疫原性組合物包含刺激病人免疫應(yīng)答以治療疾病，例如癌癥的細(xì)胞。所述細(xì)胞能夠是抗原呈遞細(xì)胞，例如與抗原組合物結(jié)合的樹突細(xì)胞(例如由Dendreon Corporation開發(fā)的ftOvenge)、腫瘤細(xì)胞(例如由Cell Genesis開發(fā)的GVAX)或淋巴細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“抗原”指能作為免疫應(yīng)答之靶標(biāo)的任何物質(zhì)，包括復(fù)雜抗原(例如腫瘤細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞、樹突細(xì)胞等)。例如，抗原可以是患者所產(chǎn)生的細(xì)胞介導(dǎo)和 /或體液免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。術(shù)語“抗原”包括例如病毒抗原、腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲抗原、變應(yīng)原等的全部或一部分-病毒抗原包括如來自以下的抗原甲、乙、丙、丁和戊型肝炎病毒、HIV、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、水痘帶狀皰疹、乳頭瘤病毒、EB病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、細(xì)小RNA病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、痘病毒、鼻病毒、風(fēng)疹病毒、乳多空病毒 (papovirus)、腮腺炎病毒、麻疹病毒；已知病毒抗原的一些非限制性實例包括如下來自 HIV-I 的抗原，例如 tat、nef、gpl20 或 gpl60、gp40、p24、gag、env、vif、vpr、vpu、rev 或其部分和/或組合；來自人皰疹病毒的抗原，例如gH、gL、gM、gB、gC、gK、gE或gD或其部分和 /或組合或者來自HSVl或HSV2的立即早期蛋白例如ICP27、ICP47、ICP4、ICP36 ；來自巨細(xì)胞病毒(特別是人巨細(xì)胞病毒)的抗原，例如gB或其衍生物；來自EB病毒的抗原，例如 gp350或其衍生物；來自水痘-帶狀皰疹病毒的抗原，例如gpl、ll、lll和IE63 ；來自肝炎病毒的抗原，如乙型肝炎、丙型肝炎或戊型肝炎病毒抗原(例如HCV的包膜蛋白El或E2、核心蛋白、NS2,NS3,NS4a,NS4b、NS5a、NS5b,p7或其部分和/或組合)；來自人乳頭瘤病毒的抗原(例如 HPV6，11，16，18，如 L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7 或其部分和 / 或組合)；來自其他病毒病原體的抗原，例如呼吸道合胞體病毒(如F和G蛋白或其衍生物)，副流感病毒、 麻疹病毒、腮腺炎病毒、黃病毒屬(如黃熱病病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒細(xì)胞(例如HA，NP，NA或M蛋白，或其部分和/或組合)；-腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原包括但不僅限于癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這些癌癥的更具體實例包括乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、 非小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、 結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和多種類型的頭頸癌、直腸癌、惡性黑素瘤、喉癌、前列腺癌。癌抗原是可以潛在地刺激明顯的腫瘤特異性免疫應(yīng)答的抗原。這些抗原中的一些由正常細(xì)胞編碼(但不一定表達(dá))。這些抗原可表征為在正常細(xì)胞中通常沉默(即不表達(dá))的抗原，僅以低水平表達(dá)或在分化的某些階段表達(dá)的抗原，以及時序表達(dá)的抗原，例如胚胎抗原和胎兒抗原。另一些抗原由突變的細(xì)胞基因編碼， 例如癌基因(例如活化的ras癌基因)、抑制基因(例如突變的p53)、由內(nèi)部缺失或染色體易位產(chǎn)生的融合蛋白。另一些癌抗原可由病毒基因編碼，例如RNA和DNA腫瘤病毒上攜帶的抗原。腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的一些非限制性實例包括MART-1/Melan-A、gpl00、二肽基肽酶IV(DPPIV)、腺苷脫氨酶結(jié)合蛋白(ADAbp)、親環(huán)蛋白McyclophiIin b)、結(jié)腸直腸相關(guān)抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-I和CAP_2、etv6、 amll、前列腺特異性抗原(PSA)及其免疫原性表位PSA_1、PSA_2和PSA-3、前列腺特異性膜抗原( 3嫩)、11細(xì)胞受體/0)3-4鏈、MAGE家族腫瘤抗原(例如MAGE-Al、MAGE-A2、MAGE_A3、 MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AlO, MAGE-AlU MAGE-Al2, MAGE-Xp2 (MAGE-B2)、MAGE-Xp3 (MAGE-B3)、MAGE_Xp4 (MAGE-B4)、MAGE-Cl、MAGE-C2、 MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5)、GAGE 家族腫瘤抗原(例如 GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、 GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE, RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V, MUM-U CDK4、 酪氨酸酶、p53、MUC家族(例如MUC-1)、HER2/neu、p21ras、RCAS1、甲胎蛋白、E-鈣黏著蛋白、α -聯(lián)蛋白、β-聯(lián)蛋白和 γ-聯(lián)蛋白、pl20ctn、gpl00. sup. Pmelll7、PRAME、NY-ES0_l、 cdc27、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白仏 0、胞影蛋白、連接蛋白37、18-獨(dú)特型、？154 75、6112和 ⑶2神經(jīng)節(jié)苷脂；病毒產(chǎn)物如人乳頭瘤病毒蛋白、Smad家族腫瘤抗原、lmp-1、P1A、EBV編碼的核抗原(EBNA)-1、腦糖原磷酸酶、SSX-I、SSX-2 (H0M-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1 和 CT-7 以及 c-erbB-2 ；-細(xì)菌抗原包括如來自以下的抗原導(dǎo)致TB和麻風(fēng)病、肺膨出的分枝桿菌；需氧革蘭氏陰性芽孢桿菌、支原體、葡萄球菌感染、鏈球菌感染、沙門氏菌、衣原體、奈瑟菌；-其他抗原包括如來自瘧疾、利什曼病、錐蟲病、弓形蟲病、血吸蟲病、絲蟲病的抗原；-變應(yīng)原指可在敏感患者中引發(fā)變應(yīng)性或哮喘應(yīng)答的物質(zhì)。變應(yīng)原的列表十分廣泛，可包括花粉、昆蟲毒液、動物皮屑、真菌孢子和藥物(如青霉素)。天然的動物和植物變應(yīng)原的實例包括但不僅限于在以下屬特異性的蛋白犬科動物(家犬(Canis familiaris))；表皮螨屬(Dermatophagoides)(例如，粉塵螨(Dermatophagoides farinae))； 貓屬(Felis)(家貓(Felis domesticus)) ；Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia;黑麥草屬(Lolium)(例如，多年生黑麥草(Lolium perenne)或多花黑麥草(Lolium multiflorum))；柳杉屬(Cryptomeria)(日本柳杉(Cryptomeria japonica))； 鏈格孢屬(Alternaria)(鏈格孢(Alternaria alternata))；赤楊；榿木屬(歐洲榿木 (Alnus gultinoasa))；禪木屬(Betula verrucosa)；櫟屬(Quercus)(白櫟(Quercus alba))；木犀欖屬(Olea)(油橄欖(Olea europa))；蒿屬(Artemisia)(艾蒿(Artemisia vulgaris))；車前草屬(Plantago)(例如長葉車前(Plantago Ianceolata))；墻草屬 (Parietaria)(例如Parietaria officinalis或Parietaria judaica)；蜚爐(Blattella) (例如德國小蠊(Blattella germanica))；蜜蜂屬(Apis)(例如 Apis multiflorum)； 桕木屬(Cupressus)(例如地中海桕木(Cupressus sempervirens)，綠干桕(Cupressus arizonica)禾口大果桕木(Cupressus macrocarpa))；朿Ij桕屬(Juniperus)(例如 Juniperus sabinoides、Juniperus virginiana、歐洲朿Ij 桕(Juniperus communis)禾口阿希朿Ij 桕 (Juniperus ashei)) ；Thuya(例如 Thuya orientalis)；扁柏屬(Chamaecyparis)(例如日本扁柏(Chamaecyparis obtusa))；大爐屬(Periplaneta)(例如美洲大爐(Periplaneta americana))；冰草屬(Agropyron)(例如偃麥草(Agropyron repens))；漂麥屬(Secale)(例如黑麥(Secale cereale))；小麥屬 CTriticum)(例如普通小麥(Triticum aestivum))；鴨茅屬(Dactylis)(例如鴨茅(Dactylisglomerata))；羊茅屬(Festuca) (例如牛尾草(Festuca elatior))；早熟禾屬(Poa)(例如草地早熟禾(Poa pratensis) 或加拿大早熟禾(Poa compressa))；燕麥屬(Avena)(例如燕麥(Avena sativa))；絨毛草屬(Holcus)(例如絨毛草(Holcus Ianatus))；黃花茅屬(Anthoxanthum)(例如黃花茅(Anthoxanthum odoratum))；燕麥草屬(Arrhenatherum)(例如燕麥草(Arrhenatherum elatius))；剪股穎屬(Agrostis)(例如小糠草(Agrostis alba))；梯牧草屬(Phleum)(例如梯牧草(Phleum pratense))；草聲屬(Phalaris)(例如草聲(Phalaris arundinacea))； 雀稗屬(Paspalum)(例如Paspalum notatum)；蜀黍?qū)?例如石茅高粱(Sorghum halepensis))；禾口雀麥屬(Bromus)(例如無芒雀麥(Bromus inermis))。根據(jù)一個具體實施方案，所述抗原由異源核苷酸序列編碼，并由重組載體在體內(nèi)表達(dá)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的異源核苷酸序列編碼一種或多種以下抗原的全部或一部分HBV-PreSl、PreS2和表面包膜蛋白、核心及polHIV_gpl20 gp40、 gpl60、p24、gag、pol、env、vif > vpr、vpu、tat、rev、nef ;HPV_E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、 L1、L2(參閱如 WO 90/10459、WO 98/04705、WO 99/03885) ；HCV 包膜蛋白 El 或 E2、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b、p7(參閱如W02004111082、W02005051420) ；Muc-I (參閱如 US 5，861，381 ；US6, 054，438 ；W098/04727 ；W098/37095)。根據(jù)本發(fā)明的一些變型，所述免疫原性組合物含有至少兩種抗原，或者編碼至少兩種抗原的異源核苷酸序列，或者編碼至少兩種抗原的至少兩種異源核苷酸序列，或其任
思組合。根據(jù)另一個具體實施方案，本發(fā)明的所述異源核苷酸序列編碼HPV抗原的全部或一部分，所述HPV抗原選自HPV的E6早期編碼區(qū)、HPV的E7早期編碼區(qū)及其衍生物或組合。本發(fā)明重組載體所編碼的HPV抗原選自HPV E6多肽、HPV E7多肽，或者同時有HPV E6多肽和HPV E7多肽。本發(fā)明包括使用與p53之結(jié)合發(fā)生改變或至少顯著降低的任何HPV E6，和/或使用與Rb之結(jié)合發(fā)生改變或至少顯著降低的任何HPV E7多肽(Munger等，1989， EMBO J. 8,4099-4105 ;Crook 等，1991，Cell 67，547-556 ；Heck 等，1992，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89,4442-4446 ;Phelps 等，1992，J. Virol. 66，2148-2427)。適用于本發(fā)明目的的一種非癌基因HPV-16E6變體缺失了位于約118位至約122位(+1代表天然HPV-16E6多肽的第一個甲硫氨酸殘基)的一個或多個氨基酸殘基，尤其優(yōu)選完全缺失118至122位殘基 (CPEEK)。適用于本發(fā)明目的的一種非癌HPV-16E7變體缺失了位于約21位至約沈位(+1 代表天然HPV-16E7多肽的第一個氨基酸)的一個或多個氨基酸殘基，尤其優(yōu)選完全缺失 21至沈位殘基(DLYCYE)。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，用于本發(fā)明的一種或多種HPV-16早期多肽經(jīng)進(jìn)一步修飾，以改善I類MHC和/或II類MHC呈遞，和/或刺激抗HPV免疫。HPV E6和E7多肽是核蛋白，之前已顯示膜呈遞可以改善其治療效力(參閱如W099/03885)。因此，將至少一種HPV早期多肽修飾成錨著在細(xì)胞膜上是可取的。膜錨著可通過在該HPV早期多肽中摻入膜錨著序列(如果天然多肽中缺少該序列，則摻入分泌序列，即信號肽)來容易地實現(xiàn)。膜錨著序列和分泌序列為本領(lǐng)域已知。簡言之，分泌序列存在于位于膜上或分泌的多肽的N端，并起始其通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。它們通常含有15至35個基本為疏水性的氨基酸，其后通過位于ER上的特異性內(nèi)肽酶除去，得到成熟多肽。膜錨著序列通常為高疏水性質(zhì)，并用于將多肽錨定在細(xì)胞膜上(參閱如Branden和Tooze，1991，Introduction to Protein Structure p. 202-214, NY Garland)?？捎糜诒景l(fā)明上下文的膜錨著序列及分泌序列的選擇十分廣泛。它們可得自任何包含它的膜錨著多肽和/或分泌多肽(例如細(xì)胞或病毒多肽)，例如狂犬病糖蛋白、Hiv病毒包膜糖蛋白和/或麻疹病毒F蛋白，或者可以是合成的。插入本發(fā)明所用早期HPV-16多肽中的膜錨著序列和/或分泌序列可具有共同或不同的來源。優(yōu)選插入分泌序列的位點(diǎn)是翻譯起始密碼子的N端下游，膜錨著序列的則為C端，例如緊接終止密碼子之后的上游。本發(fā)明使用的HPV E6多肽優(yōu)選地通過插入麻疹F蛋白的分泌和膜錨著信號來進(jìn)行修飾。任選地或與其組合地，本發(fā)明使用的HPV E7多肽優(yōu)選地通過插入狂犬病糖蛋白的分泌和膜錨著信號來進(jìn)行修飾。還可以通過使用一種或多種編碼免疫促進(jìn)劑多肽的核酸來提高重組載體的治療效力。例如，可以有利地將HPV早期多肽與諸如以下的多肽連接鈣網(wǎng)蛋白(Cheng等，2001， J.Clin. Invest. 108，669-678)、結(jié)核分枝桿菌熱休克蛋白(HSP70) (Chen 等，2000，Cancer Res. 60，10；35-1042)、泛蛋白(Rodriguez 等，1997，J. Virol. 71,8497-8503)或者細(xì)菌毒素的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域，例如銅綠假單胞菌外毒素A(ETA(dIII)) (Hung等，200 ICancer Res. 61, 3698-3703)。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明的重組載體包含編碼上述一種或多種早期多肽(特別是HPV-16和/或HPV-18早期E6和/或E7多肽)的核酸。根據(jù)另一個具體的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的所述異源核苷酸序列編碼MUCl抗原的全部或一部分或其衍生物。根據(jù)另一個具體實施方案，本發(fā)明的所述異源核苷酸序列編碼一種或多種以下抗原的全部或一部分HCV包膜蛋白El或E2、核心蛋白、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS 、p7 或其衍生物。根據(jù)另一具體實施方案，本發(fā)明的所述異源核苷酸序列編碼一種或多種融合蛋白，其中構(gòu)型是非天然的至少一個NS多肽以不同于天然構(gòu)型的順序出現(xiàn)。因此，如果該融合蛋白包含NS3多肽、NS4A多肽和NS5B多肽，則天然構(gòu)型將是NS3-NS4A-NS5B，NS3在N 端，NS5B 在 C 端。相反，非天然構(gòu)型可以是 NS5B-NS3-NS4A、NS5B-NS4A-NS3、NS4A-NS3-NS5B、 NS4A-NS5B-NS3或NS3-NS5B-NS4A。具體地，本發(fā)明的融合蛋白包含以下至少一種〇與NS3多肽的N端直接融合或通過接頭融合的NS4A多肽；〇與NS5B多肽的N端直接融合或通過接頭融合的NS3多肽；〇與NS5B多肽的N端直接融合或通過接頭融合的NS4B多肽；〇與NS3多肽的N端直接融合或通過接頭融合的NS4A多肽，所述NS3多肽與NS4B 多肽的N端直接融合或通過接頭融合；和/或〇與NS4B多肽的N端直接融合或通過接頭融合的NS3多肽，所述NS4B多肽與NS5B 多肽的N端直接融合或通過接頭融合。在本發(fā)明融合蛋白的這些特定部分中，每個NS多肽可獨(dú)立地是天然的或修飾的。 例如，NS4A-NS3部分中包含的NS4A多肽可以是天然的，而NS3多肽包含下述修飾中至少一種。必要時，用于本發(fā)明的核酸分子可以進(jìn)行優(yōu)化，以在特定宿主細(xì)胞或生物(例如人宿主細(xì)胞或生物)中提供靶標(biāo)抗原(如HPV早期多肽)的高水平表達(dá)。密碼子優(yōu)化一般通過將哺乳動物宿主細(xì)胞中較少使用的一個或多個“天然”(例如HPV)密碼子替換為一個或多個更頻繁使用的編碼相同氨基酸的密碼子來進(jìn)行。這可通過常規(guī)誘變或通過化學(xué)合成技術(shù)(例如產(chǎn)生合成核酸)來實現(xiàn)。沒有必要替換對應(yīng)于較少使用密碼子的所有天然密碼子，因為即使部分替換也可實現(xiàn)提高的表達(dá)。此外，可以產(chǎn)生與嚴(yán)格遵從優(yōu)化的密碼子使用的一些偏離，用于適應(yīng)限制性位點(diǎn)的引入。本文使用的術(shù)語“重組載體”指病毒及非病毒的載體，包括染色體外(如附加體)、 多拷貝和整合型載體(即，整合進(jìn)宿主染色體中)。本發(fā)明中特別重要的是用于基因治療的載體(即，能將核酸遞送至宿主生物的載體)以及用于多種表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)載體。合適的非病毒載體包括質(zhì)粒，例如 pREP4，pCEP4 (Invitrogene)，pCI (Promega)，pCDM8 (Seed，1987， Nature329，840)，pVAX和pgWiz(Gene Therapy System Inc ；Himoudi等，2002，J. Virol. 76， 12735-12746)。合適的病毒載體可來自多種不同病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、AAV、痘病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒等。本文使用的術(shù)語“病毒載體”包括載體DNA/RNA以及由其產(chǎn)生的病毒顆粒。病毒載體可以具有復(fù)制能力，或者可以在遺傳上使其失去能力，從而成為復(fù)制缺陷的或復(fù)制受損的。本文使用的術(shù)語“具有復(fù)制能力”包括復(fù)制選擇性及條件性復(fù)制的病毒載體，它們被改造成在特定的宿主細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞)中更好地復(fù)制或選擇性復(fù)制。在一個方面中，用于本發(fā)明的重組載體是重組腺病毒載體(綜述參閱 "Adenoviral vectors for gene therapy，，, 2002, D. Curiel 禾口 J. Douglas 編輯，Academic Press)。它可來自多種人或動物來源，并且從腺病毒血清型1至51的任何血清型均可使用。特別優(yōu)選的是人腺病毒 2(Ad2)、5(Ad5)、6(Ad6)、ll(Adll)、M(Ad24)和 35 (Ad35)。這些腺病毒可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Rockville, Md.)，并且已有大量文獻(xiàn)描述其序列、組織及產(chǎn)生方法，使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠應(yīng)用它們(參閱如US 6,133,028； US 6, 110, 735 ；WO 02/40665 ；WO 00/50573 ；EP 1016711 ；Vogels 等，2003，J. Virol. 77， 8263-8271)。用于本發(fā)明的腺病毒可以具有復(fù)制能力。具有復(fù)制能力的腺病毒載體的多種實例易于為本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得(參閱如Hernandez-Alcoceba等，2000，Human Gene Ther. 11， 2009-2024；Nemunaitis ，2001， Gene Ther. 8,746-759 ；Alemany ^,2000, Nature Biotechnology 18,723-727).例如，可通過以下方法從野生型腺病毒基因組中改造它們 缺失ElA CR2結(jié)構(gòu)域(參閱如W000/24408)和/或?qū)⑻烊籈l和/或E4啟動子替換為組織、腫瘤或細(xì)胞狀態(tài)特異性啟動子(參閱如US 5,998, 205, W099/25860, US 5，698，443， W000/46355, W000/15820 和 W001/36650)。備選地，用于本發(fā)明的腺病毒載體可以是復(fù)制缺陷型的(參閱如W094/28152 ； Lusky等，1998，J.Virol 72，2022-2032)。優(yōu)選的復(fù)制缺陷型腺病毒載體為El缺陷型(參閱如US 6，136，594和US 6,013, 638)，El缺失大致從459位延伸至3328位，或大致從459 位延伸至3510位(人5型腺病毒的序列公開于GenBank登記號M73260以及Chroboczek 等，1992，Virol. 186，^0- ?？梢酝ㄟ^缺失腺病毒基因組的其他部分(非必需E3區(qū)或其他必需E2、E4區(qū)的全部或一部分)來進(jìn)一步提高克隆容量?？梢匀鏑hartier等(1996， J.Virol. 70,4805-4810)所述通過同源重組在腺病毒載體的任何位置插入核酸。例如，可將編碼HPV-16 E6多肽的核酸替換El區(qū)插入，并將編碼HPV-16E7多肽的核酸替換E3區(qū)插入，或反之亦然。在另一個優(yōu)選的方面，用于本發(fā)明的載體為痘病毒載體(參閱如Cox等“Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press)。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方案，其選自痘苗病毒，合適的痘苗病毒包括但不僅限于哥本哈根毒株(Goebel等， 1990，Virol. 179，247-266 和 517-563 Johnson 等，1993，Virol. 196，381-401) ,Wyeth 毒株以及由它們產(chǎn)生的高度減毒的病毒，包括MVA(綜述參閱Mayr，Α.，等，1975，Infection 3， 6-14)及其衍生物(例如 MVA 痘苗株 575(ECACC V00120707-US 6，913，752)、NYVAC (參閱 WO 92/15672-Tartaglia 等，1992，Virology，188，217-232)。對 MVA 基因組完整序列的測定以及與哥本哈根VV基因組的比較使得可以精確地鑒定在MVA基因組中存在的7個缺失(I至 VII) (Antoine等，1998，Virology 244，365-396)，其中任何一個都可用于插入編碼抗原的核酸。該載體還可得自痘病毒科的任何其他成員，特別是禽痘(例如TR0VAC，參閱I^oletti 等，1995，Dev Biol Stand.，84，159—163)；金絲雀痘(例如 ALVAC，WO 95/27780，Paoletti 等，1995，Dev Biol Stand.，84，159-163)；鴿痘；豬痘等。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考WO 9215672(通過參考并入本文)，其描述了基于痘病毒產(chǎn)生能表達(dá)這些異源核苷酸序列(特別是編碼抗原的核苷酸序列)的表達(dá)載體。根據(jù)特定的實施方案，所述病毒可以是具有復(fù)制能力的痘病毒，特別地可以具有復(fù)制能力的痘苗病毒。在W09531105(例如產(chǎn)品JX594、VV TK-GMCSF或JX963、VV TK-VGF-GMCSF)、W00073479、W02009/065547、W02009/065546 中提供這些病毒的實例。在痘病毒基因組中插入核酸及表達(dá)所需相關(guān)調(diào)節(jié)元件的基本技術(shù)描述于本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的大量文獻(xiàn)中(Paul 等，2002，Cancer gene Ther. 9,470-477 ；Piccini 等，1987，Methods of Enzymology 153，545-563 ;US 4, 769, 330 ；US 4, 772, 848 ；US 4，603，112 ；US 5，100，587和US 5，179，993)。一般通過病毒基因組與帶有待插入核酸的質(zhì)粒之間所存在重疊序列(即，期望的插入位點(diǎn))之間的同源重組來進(jìn)行。編碼本發(fā)明抗原的核酸優(yōu)選地插入痘病毒基因組的非必需基因座中，以使重組痘病毒仍能生存和仍有感染性。非必需區(qū)是非編碼的基因間區(qū)域，或者是其失活或缺失不顯著損害病毒的生長、復(fù)制或感染的任何基因。還可以設(shè)想插入必需的病毒基因座中，只要缺陷功能在病毒顆粒的產(chǎn)生過程中以反式提供即可，例如使用輔助細(xì)胞來提供，其帶有對應(yīng)于痘病毒基因組中所缺失序列的補(bǔ)充序列。在使用哥本哈根痘苗病毒時，抗原編碼核酸優(yōu)選插入胸苷激酶基因(tk)中 (Hruby 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80,3411-3415 ；Weir 等，1983，J. Virol. 46， 530-537)。然而，其他插入位點(diǎn)也是合適的，例如在血凝素基因中(Guo等，1989， J. Virol. 63,4189-4198)、在 KlL 基因座中、在 u 基因中(Zhou 等，1990，J. Gen. Virol. 71， 2185-2190)或者痘苗病毒基因組的左側(cè)末端，這里已經(jīng)在文獻(xiàn)中報道了多種自發(fā)或改造的缺失(Altenburger 等，1989，Archives Virol. 105，15-27 ；Moss 等 1981，J. Virol. 40, 387-395 ；Panicali 等，1981，J. Virol. 37，1000—1010 ；Perkus 等，1989，J. Virol. 63， 3829-3836 ；Perkus 等，1990，Virol. 179,276-286 ；Perkus 等，1991，Virol. 180，406-410)。在使用MVA時，抗原編碼核酸可插入已鑒定的缺失I至VII中的任一個或插入D4R 基因座，但插入缺失II或III中是優(yōu)選的(Meyer等，1991，J. Gen. Virol. 72，1031-1038 ；Sutter 等，1994，Vaccine 12，1032-1040)。使用禽痘病毒時，盡管可以考慮插入胸苷激酶基因中，但抗原編碼核酸優(yōu)選導(dǎo)入 ORF 7和9之間的基因間區(qū)域(參閱如EP 314569和US 5，180，675)。根據(jù)一個具體實施方案，所述重組載體是重組質(zhì)粒DNA或重組病毒載體。根據(jù)另一個具體實施方案，所述重組病毒載體是重組痘苗載體。根據(jù)另一個具體實施方案，所述重組痘苗載體是重組MVA載體。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的抗原編碼核酸為適于在宿主細(xì)胞或生物中表達(dá)的形式，這意味著，編碼抗原的核酸序列處于其在宿主細(xì)胞或生物中表達(dá)所需的一個或多個調(diào)節(jié)序列的控制之下。本文使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”指任何序列，其允許、促進(jìn)或調(diào)節(jié)核酸在給定宿主細(xì)胞中的表達(dá)，包括復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯、穩(wěn)定性和/或?qū)⒑怂峄蚱溲苌镏?如mRNA) 轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，調(diào)節(jié)序列的選擇可取決于各種因素，例如宿主細(xì)胞、載體和期望的表達(dá)水平。編碼抗原的核酸與指導(dǎo)該抗原核酸在真核細(xì)胞中表達(dá)的基因表達(dá)序列有效連接。基因表達(dá)序列是有利于與其有效連接的抗原核酸有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的任何調(diào)節(jié)性核苷酸序列，例如啟動子序列或啟動子-增強(qiáng)子組合。例如，基因表達(dá)序列可以是哺乳動物或病毒的啟動子，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子。組成型哺乳動物啟動子包括但不僅限于以下基因的啟動子次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、腺苷脫氨酶、丙酮酸激酶、 b-肌動蛋白啟動子和其他組成型啟動子。在真核細(xì)胞中發(fā)揮組成型功能的示例性病毒啟動子包括如來自以下的啟動子巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳頭瘤病毒、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、莫洛尼白血病病毒和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)(LTR)，以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。其他組成型啟動子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知?？捎米鞅景l(fā)明基因表達(dá)序列的啟動子還包括誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子在誘導(dǎo)物存在下表達(dá)。例如，金屬硫蛋白啟動子在某些金屬離子存在下被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和翻譯。其他誘導(dǎo)型啟動子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。一般地，如需要，基因表達(dá)序列應(yīng)包括分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT 序列等。特別地，這些5’非轉(zhuǎn)錄序列將包括啟動子區(qū)，其包括用于對有效連接的抗原核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動子序列。根據(jù)需要，基因表達(dá)序列任選地包括增強(qiáng)子序列或上游激活子序列。用于痘病毒載體(見下文)的優(yōu)選啟動子包括但不僅限于牛痘啟動子7. ^(、H5R、 TK,p28,pll和K1L，早期和晚期痘病毒之間的嵌合啟動子以及合成啟動子，如Chakrabarti 等(1997，Biotechniques 23，1094-1097)、Hammond 等(1997,J. Virological Methods 66， 135-138)以及 Kumar 和 Boyle (1990，Virology 179,151-158)所述。啟動子特別重要，本發(fā)明包括使用指導(dǎo)核酸在許多宿主細(xì)胞類型中表達(dá)的組成型啟動子以及指導(dǎo)僅在某些宿主細(xì)胞中表達(dá)或應(yīng)答于特定事件或外源因素(如溫度、養(yǎng)分添力口、激素或其他配體)而表達(dá)的啟動子。合適的啟動子廣泛描述于文獻(xiàn)中，值得一提的是病毒啟動子，如RSV、SV40、CMV和MLP啟動子。用于痘病毒載體的優(yōu)選啟動子包括但不僅限于牛痘啟動子7. 5K、H5R、TK、p^、pll和K1L，早期和晚期痘病毒之間的嵌合啟動子以及合成啟動子，如 Chakrabarti 等(1997，Biotechniques 23，1094-1097)、Hammond 等(1997， J. Virological Methods 66，135-138)以及 Kumar 和 Boyle (1990，Virology 179,151-158) 所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，控制本發(fā)明核酸分子表達(dá)的調(diào)節(jié)元件還可包含用于調(diào)節(jié)
1以下的元件宿主細(xì)胞或生物中的正確起始、調(diào)節(jié)和/或終止轉(zhuǎn)錄(如多聚A轉(zhuǎn)錄終止序列)、mRNA運(yùn)輸(如核定位信號序列)、加工(如剪接信號)、穩(wěn)定性(如內(nèi)含子和非編碼5’ 及3’序列)、翻譯(如肽信號、前肽、三聯(lián)先導(dǎo)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、Shine-Dalgamo序列
寸J ο備選地，用于本發(fā)明的重組載體還可包含編碼至少一種細(xì)胞因子的至少一種核酸。合適的細(xì)胞因子包括但不僅限于白介素(如IL-2，IL-7，IL-15，IL-18，IL-21)和干擾素(如IFNY，INFa)，特別優(yōu)選白介素IL-2。當(dāng)本發(fā)明的重組疫苗包含表達(dá)細(xì)胞因子的核酸時，所述核酸可由編碼一種或多種抗原的重組載體攜帶，或者由可為相同或不同來源的獨(dú)立的重組載體攜帶。根據(jù)一個最優(yōu)選的實施方案，用于本發(fā)明的重組載體編碼MUCl抗原的全部或一部分以及以上所列的至少一種細(xì)胞因子，且優(yōu)選白介素，特別是IL2。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的重組載體是編碼MUCl抗原的全部或一部分以及以上所列的至少一種細(xì)胞因子，且優(yōu)選白介素，特別是IL2的MVA。包含上述重組病毒載體的感染性病毒顆?？赏ㄟ^常規(guī)方法產(chǎn)生。示例性方法包括以下步驟a.將病毒載體引入合適的細(xì)胞系中，b.在適當(dāng)條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞系，以允許產(chǎn)生所述感染性病毒顆粒，c.從所述細(xì)胞系的培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的感染性病毒顆粒，和d.任選地純化所回收的感染性病毒顆粒。適用于增殖腺病毒載體的細(xì)胞為例如293細(xì)胞、PERC6細(xì)胞、HER96細(xì)胞或者WO 94/28152, WO 97/00326，US 6，127，175 中公開的細(xì)胞。適用于增殖痘病毒載體的細(xì)胞為禽類細(xì)胞，最優(yōu)選由得自受精卵的雞胚制備的原代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)。感染性病毒顆?？蓮呐囵B(yǎng)物上清液中回收或者在裂解后從細(xì)胞中回收(例如通過化學(xué)方法、凍融、滲透壓休克、機(jī)械休克、超聲處理等)。病毒顆?？赏ㄟ^連續(xù)的斑點(diǎn)純化輪次來分離，接著使用本領(lǐng)域的技術(shù)純化(層析法、在氯化銫或蔗糖梯度上超速離心)。如果需要，根據(jù)本發(fā)明的治療患者的人類疾病的方法或用途(即通過施用包含至少一種抗原的免疫原性組合物)可以與一種或多種常規(guī)的治療方式(例如放射、化學(xué)療法和/或外科手術(shù))在所選擇的患者中聯(lián)合實施。多種治療方法的使用為所選擇的患者提供了基于更寬的干預(yù)。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的治療患者的人類疾病的方法或用途可以先于或后于外科干預(yù)。在另一個實施方案中，它可以先于或后于放射治療(例如Y 放射)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易地制定合適的可以使用的放射治療方案和參數(shù)(參閱如 Perez 禾口 Brady, 1992, Principles and Practice of radiation Oncology,第二版，JB Lippincott Co ；使用的合適的修改和改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。又在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法或用途與使用一種或多種藥物的化學(xué)療法(例如常規(guī)用于治療或預(yù)防病毒感染、病毒相關(guān)的病理病癥、癌癥等的藥物)相關(guān)。因此，本發(fā)明涉及用于改善癌癥患者的治療的方法，所述癌癥患者正在經(jīng)受用化學(xué)治療劑的化學(xué)治療，所述方法包括以下步驟-在由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群中選擇患者，
-對所選患者施用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物和化學(xué)治療劑。因此，本發(fā)明涉及用于改善治療癌癥患者的方法，所述癌癥患者正在經(jīng)受用化學(xué)治療劑的化學(xué)治療，所述方法包括以下步驟-在來自患者的生物樣品(例如血液或血漿或血清)中測量ILlO和IFNγ的水平，-計算IL10/IFNY 比率，禾口-根據(jù)本發(fā)明，如果所述患者具有低IL10/IFNY比率，對患者施用所述免疫原性組合物。根據(jù)一個實施方案，在施用所述免疫原性組合物之前施用所述化學(xué)治療劑。根據(jù)另一個實施方案，在施用所述免疫原性組合物之后施用所述化學(xué)治療劑。根據(jù)另一個實施方案，在施用所述免疫原性組合物的同時施用所述化學(xué)治療劑。根據(jù)一個實施方案，所述化學(xué)治療劑是順鉬和/或吉西他濱，或者相似的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及改善細(xì)胞毒性藥物(即化學(xué)治療劑)或者放射治療的細(xì)胞毒性效應(yīng)的方法，所述方法包括用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物共治療在由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群中選擇的患者。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法或免疫原性組合物的用途根據(jù)引發(fā)加強(qiáng)治療方式來實施，所述引發(fā)加強(qiáng)治療方式包括順序地施用一種或多種引發(fā)組合物和一種或多種加強(qiáng)組合物。引發(fā)組合物和加強(qiáng)組合物一般使用不同的運(yùn)載體，其包含或編碼至少一種共同的抗原結(jié)構(gòu)域。首先施用引發(fā)免疫原性組合物給宿主生物，然后在1天至12月的不同期間后，將加強(qiáng)免疫原性組合物施用給同一宿主生物。本發(fā)明的方法可以包括1次至10次順序地施用引發(fā)組合物，然后是1次至10次順序地施用加強(qiáng)組合物。根據(jù)需要，注射間隔是大約1周至6月。此外，引發(fā)組合物和加強(qiáng)組合物可以通過相同的施用途徑或者通過不同的施用途徑在相同的部位或在其它的部位施用。根據(jù)具體的實施方案，預(yù)期的臨床益處是獨(dú)立于所表明的對疫苗的免疫應(yīng)答。根據(jù)一個具體實施方案，本發(fā)明涉及上述方法，其中所述人類疾病為癌癥。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述癌癥為例如乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、直腸癌、肺癌、頭頸癌、腎癌、惡性黑素瘤、喉癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、血癌 (haematological cancer)、胃·、根據(jù)一個具體實施方案，本發(fā)明涉及上述方法，其中所述人類疾病為感染性疾病。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述感染性疾病為病毒誘發(fā)的疾病，例如HIV、HCV, HBV, HPV等誘發(fā)的疾病。在另外一個實施方案中，提供了用于制備藥物的包含靶標(biāo)抗原的全部或部分的免疫原性組合物的用途，用于特定患者群中治療患者的人類疾病，其中所述群中的患者具有低 IL10/IFNY 比率。在另外一個實施方案中，提供了用于制備藥物的免疫原性組合物的用途，用于在特定患者群中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)來治療患者的人類疾病，其中所述群的患者具有低IL10/IFNY比率。在另一個實施方案中，提供了用于制備藥物的免疫原性組合物的用途，用于在特定患者群中誘導(dǎo)對至少一種抗原的免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)來治療患者的人類疾病，其中所述群的患者具有低IL10/IFNY比率。在另一個實施方案中，提供了用于制備藥物的免疫原性組合物的用途，用于在特定患者群中誘導(dǎo)對靶標(biāo)抗原的免疫應(yīng)答(即所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)來治療患者的人類疾病， 其中所述群的患者具有低IL10/IFNY比率。在另一個實施方案中，提供了用于制備藥物的免疫原性組合物的用途，用于在特定患者群中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(即，所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答)來治療患者的人類疾病，其中所述群的患者具有低IL10/IFNY比率和其中所述產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是先天免疫應(yīng)答。根據(jù)一個特定實施方案，所述患者群中的所述“所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答”是針對腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原和/或病毒抗原的。根據(jù)一個實施方案，所述患者群中的所述“所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答”是針對不同抗原的。根據(jù)一個具體實施方案，所述患者群中的所述“所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答”是針對MUCl抗原的全部或部分。根據(jù)另一個具體實施方案，所述患者群中的所述“所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答”是T細(xì)胞免疫應(yīng)答，且優(yōu)選為CD8+(細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞)免疫應(yīng)答。根據(jù)另一個具體實施方案，所述患者群中的所述“所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答”是非特異性免疫應(yīng)答，或?qū)ξ窗谝呙缰苿┲械募膊∠嚓P(guān)的抗原的免疫應(yīng)答或?qū)ΜF(xiàn)有技術(shù)所不可測量的疾病相關(guān)的抗原的免疫應(yīng)答。根據(jù)另一個具體實施方案，在所述患者群中的所述“所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答”是先天免疫應(yīng)答的刺激。在動物或人類生物中通過施用來誘導(dǎo)或刺激免疫應(yīng)答的能力可以在體外或體內(nèi)使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的多種測定法來評價。對于可用來評價免疫應(yīng)答的起始和活化的技術(shù)的一般性描述，參閱如 Coligan 等(1992 和 1994，Current Protocols in Immunology ;J Wiley & Sons有限公司編著，National Institute of Health)。細(xì)胞免疫的測量可以通過以下方法進(jìn)行通過測量由活化的效應(yīng)細(xì)胞包括那些源自⑶4+和⑶8+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子譜 (例如通過ELIspot定量產(chǎn)生IL-IO或IFN γ的細(xì)胞)，通過測定免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化狀態(tài) (例如通過經(jīng)典的[3Η]胸腺嘧啶攝取的T細(xì)胞增殖測定法)，通過在敏化的患者中測定抗原特異的T淋巴細(xì)胞(例如在細(xì)胞毒性測定法中的肽特異性裂解)或者通過利用熒光MHC 和/或肽多聚體(例如四聚體)檢測抗原特異性T細(xì)胞。刺激體液應(yīng)答的能力可以通過抗體結(jié)合和/或結(jié)合競爭來測定(參閱如Harlow，1989，Antibodies，Cold Spring Harbor出版社)。本發(fā)明的方法也可以在用合適的腫瘤誘導(dǎo)劑(例如表達(dá)MUCl的鼠腫瘤細(xì)胞)攻擊的動物模型中進(jìn)一步驗證以確定抗腫瘤活性，反映誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗抗原免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明還涉及通過施用免疫原性組合物來延長進(jìn)行人類疾病如癌癥治療的患者的存活率的方法，所述方法包括以下步驟-在由具有低IL10/IFNY比率的患者組成的患者群中選擇患者，-向所述選擇的患者施用所述免疫原性組合物。本發(fā)明還涉及通過施用免疫原性組合物來延長進(jìn)行人類疾病如癌癥治療的患者的存活率的方法，所述方法包括以下步驟-在患者中測量ILlO和IFNY的水平，-計算IL10/IFNY 比率，禾口-如果所述患者具有低IL10/IFNγ比率，向患者施用所述免疫原性組合物。本發(fā)明還涉及通過施用免疫原性組合物和化學(xué)治療劑(參閱上述)來延長進(jìn)行人類疾病如癌癥治療的患者的存活率的方法，所述方法包括以下步驟
-在患者中測量ILlO和IFNy的水平，-計算IL10/IFNY 比率，禾口-如果所述患者具有低IL10/IFNγ比率，向患者施用所述免疫原性組合物和化學(xué)治療劑。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明涉及IL10/IFNY比率作為生物標(biāo)志物的用途，用于預(yù)測患者是否易于通過施用免疫原性組合物產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答。更具體地，本發(fā)明涉及IL10/IFNY比率作為生物標(biāo)志物的用途，用于預(yù)測患者是否易于通過施用免疫原性組合物產(chǎn)生預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答，其中低IL10/IFNY比率表明預(yù)測患者具有對產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答，優(yōu)選地免疫應(yīng)答增加的敏感性。換言之，本發(fā)明涉及IL10/IFNY比率作為生物標(biāo)志物的用途，用于預(yù)測在施用免疫原性組合物后患者是否傾向于存活更長，其中低IL10/IFNY比率表明預(yù)測患者與經(jīng)治療的具有更高IL10/IFNY比率的患者比具有更長的存活率。換言之，本發(fā)明涉及離體方法，用于預(yù)測在施用免疫原性組合物后患者是否傾向于存活更長，其中測試方法包括步驟為在來自患者的生物樣品(例如血液或血漿或血清) 中測量ILlO和INFy的水平，計算ILIO/IFNY比率，其中低IL10/IFN Υ比率表明患者將具有更長的存活率。因此，本發(fā)明還涉及IL10/IFNY比率作為生物標(biāo)志物的用途，用于預(yù)測正在經(jīng)受用化學(xué)治療劑進(jìn)行化學(xué)治療的患者是否易于在施用免疫原性組合物后產(chǎn)生預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答(例如存活更長)。因此，本發(fā)明還涉及IL10/IFNY比率作為生物標(biāo)志物的用途，用于預(yù)測正在經(jīng)受用化學(xué)治療劑進(jìn)行化學(xué)治療的患者是否易于在施用免疫原性組合物后產(chǎn)生預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答(例如存活更長)，其中低IL10/IFNY比率表明患者預(yù)計具有對產(chǎn)生預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答增加的敏感性。因此，本發(fā)明涉及用于改善癌癥患者的治療的方法，所述癌癥患者正在經(jīng)受用化學(xué)治療劑的化學(xué)治療，所述方法包括以下步驟-在患者中測量ILlO和IFNy的水平，-計算IL10/IFNY 比率，禾口-根據(jù)本發(fā)明如果所述患者具有低IL10/IFNY比率，向患者施用所述免疫原性組合物和化學(xué)治療劑。本發(fā)明也提供了試劑盒(即同組測試(companion test))，其包括實施本文所述方法的部分，并且這在本文所提供的實施例中是顯而易見的。多部分的試劑盒(kit of parts)或者試劑盒可以包括用于收集和或測量ILlO和IFNy的血清水平的試劑。此類試劑可以包括抗體。試劑盒還可以包括用于收集和/或處理生物樣品的設(shè)備。試劑盒也可能含有使用說明書，用于其確定的截斷值(見上)和/或說明書，以及用于解釋使用試劑盒所獲得的數(shù)據(jù)的說明書。根據(jù)一個特定的實施方案，所述多部分的試劑盒或者試劑盒還可以包括如上所公開的和/或如在以下的實施例部分所公開的免疫原性組合物。本發(fā)明還提供了計算機(jī)程序和/或算法，用于監(jiān)測臨床試驗，ILlO和IFNy的水平以ILlO和IFNy比率，測定此類比率是否高于或低于閾水平，和/或建議治療以改善患者對免疫療法治療的應(yīng)答。計算機(jī)程序或算法可以與必要的硬件一起提供，例如以試劑盒或裝置的形式，其也可以接受生物樣品并測量其中存在的ILlO和IFNy的相對水平和計算 ILlO和IFNy的比率。上述計算機(jī)程序和/或裝置可能與合適的說明書和試劑包括抗體一起提供給醫(yī)生或臨床實驗室。ILlO和IFN Y的水平在產(chǎn)生建議對治療修改以改善患者對通過免疫組合物的免疫療法治療的應(yīng)答的算法中的用途。已經(jīng)以說明性方式描述了本發(fā)明，并且應(yīng)該理解，所用術(shù)語旨在以說明性方式使用，而非限制。顯然，從以上教導(dǎo)中可得到對本發(fā)明的許多修改和改變。因此，應(yīng)該理解，在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，本發(fā)明可以與上文的具體描述不同的方式實施。上文引用的專利、出版物和數(shù)據(jù)庫的公開內(nèi)容均明確地完整并入本文作為參考， 如同每個單個的專利、出版物或條目均具體地單獨(dú)指出并入本文作為參考一樣。
實施例

圖1 描述在肺癌中疫苗免疫治療的存活曲線在治療之前，患者具有《或者> 3. 7的血漿IL-10/IFNg比率第1組在具有低血漿IL-10/IFNY比率的患者中進(jìn)行疫苗(即免疫原性組合物)+化學(xué)治療。低血漿IL-10/IFNY比率定義為彡3. 7。40例患者。存活中位數(shù)=21. 2 個月第2組在具有高血漿IL-10/IFNY比率的患者中進(jìn)行疫苗+化學(xué)治療。高血漿 IL-10/IFNy比率定義為>3.7。21例患者。存活中位數(shù)=5. 6個月顯著性差異，通過對數(shù)等級p = 0. 0070完整的+經(jīng)檢查的圖2 描述在肺癌中化學(xué)治療的存活曲線在治療之前，患者具有<或者> 3. 7的血漿IL-10/IFNg比率第1組在具有低血漿IL-10/IFN γ比率的患者中進(jìn)行化學(xué)治療。低血漿IL-10/ IFNy比率定義為彡3.7。57例患者。存活中位數(shù)=10. 8個月第2組在具有高血漿IL-10/IFN γ比率的患者中進(jìn)行化學(xué)治療。高血漿IL-10/ IFNy比率定義為>3. 7。11例患者。存活中位數(shù)=8. 4個月非顯著性差異，通過對數(shù)等級p = 0. 920完整的+經(jīng)檢查的在具有ILlO/IFNg預(yù)治療比率彡3. 7的患者當(dāng)中，那些用TG4010+化學(xué)治療治療的患者(存活中位數(shù)=21. 2個月)比單獨(dú)用化學(xué)治療治療的患者(存活中位數(shù)=10. 8個月)顯著性地存活更長(P = 0.03，通過對數(shù)等級檢驗)。在不依賴于血漿IL-10/IFNY比率的患者當(dāng)中存活中位數(shù)沒有顯著性地不同對于用164010+化學(xué)療法治療的患者10.7個月；和對于單獨(dú)用化學(xué)療法治療的患者10. 3個月。實施例1 免疫原性組合物，著名的疫苗TG4010，與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法聯(lián)合用于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者。
TG4010是既表達(dá)IL2又表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原MUCl的重組經(jīng)修飾病毒Ankara (MVA) (參閱 Rochlitz 等，2003，J. Gene Med.，5，690-699)。使148名患者隨機(jī)接受-僅化學(xué)療法(每3周的第1天順鉬75mg/m2以及第1天和第8天吉西他濱1250mg/ m2，直到6個循環(huán))(研究組2)或者-與TG4010—起的化學(xué)療法(研究組1)。每6周評價腫瘤(WHO標(biāo)準(zhǔn))。終點(diǎn)是在第6月時的疾病無惡化的生存(PFS)，以及總存活旨在治療分析。在第1天(治療第一天)治療前采集血液樣品并立即運(yùn)往中心免疫實驗室，在此處分離血漿并且冷凍儲存直到分析。在中心實驗室評價血漿樣品的細(xì)胞因子，使用Luminex多重分析物分析系統(tǒng) (Luminex mutli-analyte profiling system)。圖1顯示了在治療前具有白細(xì)胞介素10/干擾素γ的血漿濃度的比率< 3.7的患者研究組1(TG4010+化學(xué)療法)(存活中位數(shù)=21. 2個月)比在治療前具有白細(xì)胞介素10/干擾素Y的血漿濃度的比率>3. 7的患者(存活中位數(shù)為5. 6個月)存活更長時間。圖2中的數(shù)據(jù)顯示，基于在治療前白細(xì)胞介素10/干擾素Y的血漿濃度的比率 < 3. 7選擇患者的效用限于接受了疫苗的患者，因為圖2顯示在用TG4010治療前具有白細(xì)胞介素10/干擾素Y的血漿濃度的比率<或者>3. 7的患者具有相同的存活期望。
權(quán)利要求
1.用于測試患者是否對包括施用免疫原性組合物的治療方法會治療性應(yīng)答的離體方法，其中測試方法包括如下步驟-從患者獲得生物樣品；-在所述生物樣品中測量ILlO和IFN γ的水平；-計算IL10/IFNY比率；和-比較所述IL10/IFNY比率和閾水平，其中低IL10/IFNY比率表明具有低ILlO/ IFNy比率為5以下的患者將對免疫原性組合物產(chǎn)生預(yù)防性或治療性應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述低IL10/IFNY比率為4以下。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述治療方法是治療癌癥的方法。
4.任何前述權(quán)利要求的方法，其中用LMinM技術(shù)或酶聯(lián)免疫吸附測定測量所述 ILlO/IFNy 比率。
5.任何權(quán)利要求的方法，其中通過分別使用ILlO和IFNy特異性的抗體測定所述 ILlO/IFNy 比率。
6.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述生物樣品選自總血液樣品、血漿或血清。
7.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述免疫原性組合物含有至少一個重組載體，其體內(nèi)表達(dá)至少一個異源核苷酸序列的全部或部分。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述重組載體是病毒載體。
9.權(quán)利要求7和8任一項的方法，其中所述病毒載體是具有復(fù)制能力的。
10.權(quán)利要求7和8任一項的方法，其中所述病毒載體是復(fù)制缺陷型的。
11.權(quán)利要求7到10任一項的方法，其中所述病毒載體是腺病毒的。
12.權(quán)利要求7到10任一項的方法，其中所述病毒載體是痘苗載體。
13.權(quán)利要求7到10任一項的方法，其中所述病毒載體是MVA載體。
14.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述患者是用化學(xué)治療劑治療的患者。
15.ILlO/IFNy比率作為生物標(biāo)志物的用途，用于預(yù)測患者是否易于通過施用免疫原性組合物產(chǎn)生預(yù)防性或者治療性應(yīng)答。
16.測試患者是否對包括施用免疫原性組合物的治療方法會治療性應(yīng)答的試劑盒，其中試劑盒包含-用于在來自患者的生物樣品中測定ILlO和IFNy的水平的抗體；和-用于解釋獲得的數(shù)據(jù)的說明書，所述說明書描述了低IL10/IFNY比率表明患者將對免疫原性組合物產(chǎn)生預(yù)防性或治療性應(yīng)答，其中低比率是少于約5的比率。
17.用于預(yù)測在施用免疫原性組合物后患者是否易于存活更長的離體方法，其中測試方法包括步驟-從患者獲得生物樣品；-在所述生物樣品中測量ILlO和IFN γ的水平；-計算IL10/IFNY比率；和-比較所述IL10/IFNY比率和閾水平，其中低IL10/IFNY比率表明具有低ILlO/ IFNy比率為5以下的患者將具有更長的存活率。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物和其用途，用于測定受試者在此類治療后是否易于產(chǎn)生預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答。
文檔編號G01N33/574GK102483405SQ201080031162
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者B·格雷利耶, B·阿克爾 申請人:特朗斯吉有限公司