專利名稱：一種檢測三聚氰胺的免疫膠體金試劑板的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種檢測動物飼料、牛奶和奶粉中三聚氰胺殘留的試劑板，具體 涉及一種檢測三聚氰胺的免疫膠體金試劑板。
背景技術：
三聚氰胺(melamine)是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機物，又名蜜胺，氰尿三酰胺。由 于其氮的含量高，無味低毒，加上既有的食品和飼料工業(yè)蛋白質含量測試方法存在一定缺 陷，三聚氰胺被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質含量指標。然而長期 攝入這種含三聚氰胺的食品，會造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害、膀胱和腎臟結石，甚至可進一 步誘發(fā)膀胱癌。2007年3月，美國曾發(fā)生多起因喂食受到三聚氰胺污染的原料生產的飼料 而導致寵物貓、狗中毒死亡事件；而在2008年9月份，中國多個品牌嬰幼兒奶粉因含三聚氰 胺而導致孩子腎結石。這一系列事件引起國內外對食品安全問題的廣泛關注，對食品和動 物飼料中三聚氰胺殘留的檢測已成為必須。2008年10月7日，繼“毒奶粉”事件之后，衛(wèi)生部、工業(yè)和信息化部、農業(yè)部、工商總 局、質檢總局聯(lián)合印發(fā)了關于乳制品及含乳食品中三聚氰胺臨時管理限量值規(guī)定的公告。 在公告中規(guī)定嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為lmg/kg ；液態(tài)奶(包括原料乳)、奶 粉、其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值為2. 5mg/kg ；含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺 的限量值為2. 5mg/kg。目前，對于三聚氰胺殘留的檢測方法主要有理化分析法和免疫分析法。理化分析 法，如HPLC及LC-MS，具有特異性好、準確率高的特點，是各大檢測機構對檢測樣本進行確 證的首選方法，但存在對設備、環(huán)境、操作技能等要求，所需費用高，不利于大規(guī)模樣本篩 選，因而不適合廣大基層部門。免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，具有檢測量大，操 作相對簡單等優(yōu)點，越來越多地被用于動物性食品中抗生素殘留的檢測，但是ELISA法整 個操作時間仍需要l_2h，且需用到昂貴的特殊儀器設備，具有一定局限性。食品安全關系國計民生，研制開發(fā)一種檢測限符合要求，重現性好，檢測時間短， 適合現場快速檢測，技術產品或儀器設備成本較低，運行費用低的快速檢測試劑迫在眉睫。

實用新型內容本實用新型的目的在于提供一種靈敏度高，特異性好，簡便快速，生產成本低的三 聚氰胺免疫膠體金快速檢測試劑板。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品 墊、膠金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有l(wèi)_2mm的重疊以保證層析作用從 樣品墊到吸水墊部位的順利進行。本實用新型試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標示各功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液PH值的作用。膠金結合墊，由聚酯膜制成，其上有抗三聚氰胺單克隆抗體與膠體金結合物。為樣 品溶液中有效成分和金標抗體反應提供場所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和質控線，將反應結果 以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊，由濾紙制成，將反應過程中多余的溶液吸收。本實用新型試劑板具有如下有益效果(1)特異性好。本實用新型試劑板對三聚氰胺的交叉反應率為100%，對鏈霉素、 氯霉素、慶大霉素等其他抗生素的交叉反應率均低于1%。可見，本實用新型試劑板對三聚 氰胺反應具有高度專一性。(2)靈敏度高。本實用新型試劑板對成品飼料及飼料原料、牛奶和奶粉(非嬰兒配 方)中三聚氰胺的檢出限為2mg/kg，符合國家限量要求。(3)操作簡單快捷。本實用新型試劑板將反應所需的大部分原料整合到PVC背襯 中，滴樣后，抗原抗體反應在固相膜上快速進行，大大縮短檢樣時間，且樣品無需特殊處理， 滴樣后5-10分鐘即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和質控線的顏色深淺讀取 結果。檢測實施過程不依賴任何實驗設備，普通人員均可操作，不需專業(yè)培訓。(4)成本低，易推廣。本實用新型試劑板生產工藝簡單，流程成熟。生產成本低廉， 投資少，收效快。

圖1為三聚氰胺免疫膠體金快速檢測試劑板背襯結構示意圖，其中1為樣品墊，2 為膠金結合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為質控線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC 底板。圖2為三聚氰胺免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控 制區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3為三聚氰胺免疫膠體金快速檢測試劑板結果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T 為檢測區(qū)。
具體實施方式
本實用新型試劑板的制備包括三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物的制備，抗三聚氰胺單克隆 抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標記抗三聚氰胺單克隆抗體的制備和三聚氰胺免 疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。1.三聚氰胺與載體蛋白的偶聯(lián)采用戊二醛法將三聚氰胺與載體蛋白偶聯(lián)制備免疫抗原和包被抗原。稱取48mg 三聚氰胺溶于2mL水中，用IOmLPB緩沖液(0. lmol/LPH6. 0)溶解50mg牛血清白蛋白，加入 到上述溶液中，再緩慢加入ImLlO %戊二醛溶液，將混合溶液室溫下攪拌2h，雙蒸水透析5 天，濾膜過濾后，收集。2.抗三聚氰胺單克隆抗體的制備[0027]取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物與等體積的 弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強免疫1次，用不完全佐 劑替代完全佐劑進行腹腔注射。融合前3d強化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細胞融合 按常規(guī)方法進行將Sp20多發(fā)性骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按1 10的比例混合，在50% PEG作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初 篩選擇10mg/L三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊 抗鼠IgG-HRPd 1000)，OPD顯色。篩選出的陽性孔再用三聚氰胺-OVA偶聯(lián)物包被的酶 聯(lián)板進行阻斷間接ELISA。將細胞培養(yǎng)上清與2X 10_3mOl/L三聚氰胺溶液等量混合，37°C 感作lh，加入已包被的酶標板中。另外用PBS (0. Olmol/L、pH7. 4)替代三聚氰胺溶液作對 照，其余步驟同上。若三聚氰胺阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經 2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細胞株擴大培養(yǎng)，細胞濃度達5 X IO5Hir1時停止換液，細胞 全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆 化細胞株IO7個細胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImLl %檸 檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標記抗三聚氰胺單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用0. lmol/L碳酸鉀溶液調pH到8. 0。邊攪拌 邊加入1. 5mg抗三聚氰胺單抗，攪拌20min，再逐滴加入2mL25mol/L聚乙二醇20000 (PEG 20000)，攪拌15min。20，OOOrpm離心15min，棄上清液，加入IOmL pH 7. 4PBS緩沖液(含 0. 4mol/LPEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH7. 4)溶解，用0. 22 μ m 無菌過濾器過濾后，4 0C保存?zhèn)溆谩?.三聚氰胺免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝參照圖1，用點膜機把適當濃度的三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖 維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標記三 聚氰胺單克隆抗體包被在膠金結合墊上。檢測試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素 膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑 板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.三聚氰胺免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6. 1樣品制備成品飼料及飼料原料的樣品處理方法稱取待測樣品2. 5g放入50ml帶蓋離心管中，加入三聚氰胺專用PBST緩沖液 7. 5ml，蓋緊蓋子充分混勻3min。室溫靜置30min，3000轉/分離心5分鐘，取上清液待檢。牛奶的樣品處理方法取400 μ L三聚氰胺專用PBST緩沖液加入潔凈的1. 5mL離心管中；用滴管吸取3 滴(約ΙΟΟμ 牛奶加入離心管中，混合均勻。吸取混合溶液待檢。[0043]當檢測樣本為奶粉時，稱取少量奶粉，按照奶粉水(Ig 8mL)的比例溶解到水 中，取3滴(約100 μ L)溶解好的樣本，后續(xù)步驟同牛奶樣品處理方法。6. 2檢測步驟從包裝袋中取出試劑板，用滴管吸取待檢溶液，在加樣孔中滴入3滴(約100 μ L)， 加樣后開始計時，結果應在3 5min讀取，其他時間判讀無效。6. 3結果判讀讀取結果時，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側所示。陰性(-):T線顯色比C線深或一樣深，表明樣品中三聚氰胺濃度低于2mg/kg或無 三聚氰胺殘留。如圖3. a所示。陽性⑴T線顯色比C線淺，或T線無顯色，表明樣品中三聚氰胺濃度高于2mg/ kg ；T線比C線越淺，表明樣品中三聚氰胺濃度越高。如圖3. b所示。無效未出現C線，可能操作不當或試劑板已失效。應再次閱讀說明書，并用新試 劑板重新測試。如圖3. c所示。
權利要求一種檢測三聚氰胺的免疫膠體金試劑板，其特征在于試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有1 2mm的重疊。
2.如權利要求1所說的試劑板，其特征在于硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依 次噴有檢測線和質控線。
3.如權利要求1所說的試劑板，其特征在于膠體金顆粒的平均大小為30nm。
4.如權利要求1所說的試劑板，其特征在于硝酸纖維素膜上包被有三聚氰胺載體蛋白 偶聯(lián)物，偶聯(lián)三聚氰胺的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白和血藍蛋白。
5.根據權利要求1所述的試劑板，其特征在于背襯為一面涂有不干膠的PVC板，樣品墊 由玻璃纖維制成，膠體金結合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測三聚氰胺的免疫膠體金試劑板，可用于檢測成品飼料以及飼料原料和牛奶中三聚氰胺殘留。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠金結合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和質控線，可將反應結果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需5～10min，且無需任何昂貴實驗設備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合廣大基層部門對飼料以及牛奶中的三聚氰胺進行大規(guī)模快速檢測。
文檔編號G01N33/52GK201724941SQ20102010799
公開日2011年1月26日 申請日期2010年2月1日 優(yōu)先權日2010年2月1日
發(fā)明者卜令杰, 張少恩, 桑麗雅, 邵偉 申請人:杭州南開日新生物技術有限公司