專利名稱：：一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及多糖組分分析領(lǐng)域。具體涉及一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法。
背景技術(shù)：
：天麻(GastrodiaelataBlume)屬蘭科非自養(yǎng)型植物的干燥塊莖，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥，天麻具有平肝熄風(fēng)止痙之功效，主要用于治療治療頭痛眩暈、驚風(fēng)抽搐、肢體麻木、面肌痙攣、高血壓、冠心病等疾病。早期的研究者提取分離出天麻中許多活性成分，包括天麻素、天麻苷元、派立新、香草醇、對(duì)羥基苯甲醛、留醇、檸檬酸、琥珀酸等。近年來，許多研究工作者都從天麻中分離得到了天麻多糖，并對(duì)其藥理活性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，天麻多糖具有清除自由基、抗眩暈、降血壓，增強(qiáng)免疫，抑菌等功效。多糖是由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，是一類分子機(jī)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，多糖及其綴合物作為支持組織和能量來源的傳統(tǒng)觀念早已被突破，而被認(rèn)為是生物體內(nèi)除核酸以外的又一類重要的信息分子，而且由于它們常是細(xì)胞表面信號(hào)識(shí)別、抗原抗體反應(yīng)、細(xì)胞間信息的傳遞和感受的關(guān)鍵因子，因此，具有生物活性的活性多糖的研究日益受到重視。多糖的生物活性與其平均分子質(zhì)量大小和單糖組成有密切的關(guān)系，所以檢測(cè)多糖中單糖的組成對(duì)多糖生物活性的研究有很大的幫助。用于多糖測(cè)定的方法主要有顯色法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、陰離子色譜法，C18柱HPLC-UV法等。其中顯色法只能檢測(cè)總多糖含量，專屬性差。氣相色譜法過程復(fù)雜而且會(huì)出現(xiàn)異構(gòu)化色譜峰。毛細(xì)管電泳法存在靈敏度差的缺點(diǎn)。陰離子色譜法所用柱子價(jià)格昂貴，且需要很長(zhǎng)的時(shí)間來平衡。C18柱HPLC-UV法對(duì)植物多糖中單糖組分的檢測(cè)具有檢測(cè)設(shè)備相對(duì)便宜，靈敏度高，準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，被越來越多的多糖研究人員采用。目前，天麻多糖的檢測(cè)主要用到上述的顯色法和陰離子色譜法，未見天麻多糖中單糖檢測(cè)用到C18柱HPLC-UV法的研究報(bào)道。由于干擾成分和單糖組成的不同，在直接使用文獻(xiàn)中報(bào)道的其他多糖C18柱HPLC-UV法檢測(cè)時(shí)，總會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種方便、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法。本發(fā)明針對(duì)天麻多糖檢測(cè)過程中干擾成分和組成單糖的不同，在現(xiàn)有C18柱HPLC-UV法檢測(cè)其他植物多糖的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展和改進(jìn)，形成了一種新的方法用于天麻多糖中單糖組成的檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)解決方案為從天麻中提取制得的天麻多糖，先通過酸水解使其成為單糖，然后加入衍生化化試劑進(jìn)行衍生化，衍生化完成后，進(jìn)入HPLC系統(tǒng)檢測(cè)。在HPLC系統(tǒng)中，使用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱進(jìn)行分離，柱溫35°C，流動(dòng)相是按一定比例混合的緩沖鹽和有機(jī)溶劑，流速0.81.5ml/min，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)220360nm。在本發(fā)明中，天麻多糖首先加酸水解形成單糖，所用酸選自無機(jī)酸或有機(jī)酸，包括但不限于鹽酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸等。水解物用衍生化試劑進(jìn)行衍生化，所用衍生化試劑包括但不限于1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)。在HPLC系統(tǒng)中，使用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，柱子內(nèi)徑、顆粒粒徑和柱子長(zhǎng)度可任意選擇，只要能分離開各個(gè)單糖即可。流動(dòng)相為緩沖溶液和有機(jī)溶劑的混合液，所用緩沖溶液是弱酸與其鹽的混合溶液，包括但不限于磷酸二氫鉀水溶液_氫氧化鈉、磷酸氫二鈉_磷酸二氫鉀、醋酸_醋酸鈉水溶液、醋酸銨水溶液_醋酸、檸檬酸_檸檬酸鈉水溶液等，所用有機(jī)溶劑包括但不限于甲醇、乙醇、乙腈等。流速在0.81.5ml/min范圍內(nèi)任意選擇。紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)在220360nm間任意選擇。使用本發(fā)明所述方法，可一次性分離檢測(cè)出天麻多糖中各個(gè)單糖含量，方法的專屬性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確性好。所使用的儀器設(shè)備比較常見，方法容易實(shí)現(xiàn)，檢測(cè)成分較低。圖1天麻多糖HPLC檢測(cè)色譜圖具體實(shí)施例方式實(shí)施一1.儀器與試藥1.1儀器Ultimate3000高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)；水浴鍋BC-W203(上海貝凱)；XS105電子天平(Mettler-Tolledo)1.2試藥超純水，娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈均為色譜純迪馬公司；氯仿、甲醇、濃硫酸、葡萄糖、NaOH、鹽酸、冰醋酸、乙酸銨均為分析純廣州試劑廠；甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖均為分析純上海試劑二廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)分析純天津大茂。2.色譜條件色譜柱phenmenex-C18(150*4.6mm,5μm)；柱溫35°C；波長(zhǎng)254nm；流動(dòng)相0.lmol/1醋酸銨水溶液-醋酸緩沖鹽乙腈，梯度洗脫3.標(biāo)準(zhǔn)溶液制備3.1單糖對(duì)照品混合液的配制分別精密稱取甘露糖0.0192g、鼠李糖0.0183g、葡萄糖0.0420g、阿拉伯糖0.0212g，置IOmL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得3.2單糖對(duì)照品混合液的衍生精密吸取單糖對(duì)照品混合液lml，于具塞試管中，分別加入0.3mol/L氫氧化鈉Iml和0.5mol/LPMP甲醇溶液1ml，渦旋混合30s,置于70°C水浴反應(yīng)40min，取出，冷卻至室溫，加入0.3mol/L鹽酸Iml進(jìn)行中和，然后加入5ml氯仿渦旋混勻30s，靜置5min，小心用注射器吸取下層有機(jī)相，上層水相再重復(fù)萃取2次，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣分析4.樣品溶液制備4.1樣品水解精確稱取天麻多糖20.Omg,置于IOmL具塞試管內(nèi)，加入lmol/L的硫酸溶液2.OmL,于100°C水浴中水解2h，得水解樣品溶液。用2mol/L氫氧化鈉水溶液中和至pH7.0，并以純化水稀釋到5.OmL，離心，吸取上清夜，得多糖水解樣品。4.2衍生化化將水解后的天麻多糖按“3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理5.線性關(guān)系考察取適量對(duì)照品混合液按“3.2”方法進(jìn)行衍生，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，分別進(jìn)樣3.0,4.0，5.0,8.0，10.OμL，記錄色譜圖，以紫外測(cè)定的峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)單糖的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明各單糖的進(jìn)樣量(X)與峰面積(Y)有良好的線性關(guān)系，見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>6.結(jié)果天麻多糖樣品水解并衍生化后，經(jīng)HPLC檢測(cè)，各單糖含量為甘露醇1.8%，鼠李糖1.，葡萄糖85.2%，阿拉伯糖1.5%。7.分析條件的確定7.1水解用酸的確定分別選用2mol/L鹽酸、lmol/L硫酸、2mol/L甲酸、2mol/L乙酸、2mol/L三氯乙酸和2mol/L三氟乙酸進(jìn)行天麻多糖的水解實(shí)驗(yàn)。各次實(shí)驗(yàn)的多糖用量、水解溫度、水解時(shí)間，酸加入量均相同。結(jié)果各這些酸均能水解多糖，但是甲酸、乙酸、三氯乙酸水解后樣品中各多糖含量的檢測(cè)結(jié)果明顯比用其他酸低。鹽酸的氯離子對(duì)HPLC系統(tǒng)有害，所以不宜用。三氟乙酸和硫酸的結(jié)果相當(dāng)，但是三氟乙酸有毒，所以也不宜用。所以，最后確定水解用酸為lmol/L硫酸。7.2流動(dòng)相中緩沖溶液的確定分別選用磷酸二氫鉀水溶液_氫氧化鈉、磷酸氫二鈉_磷酸二氫鉀、醋酸_醋酸鈉水溶液、醋酸銨水溶液_醋酸、檸檬酸_檸檬酸鈉水溶液等緩沖溶液與有機(jī)溶劑組成流動(dòng)相，恒比例洗脫，其中有機(jī)溶劑為乙腈，比例為30%。結(jié)果使用用醋酸銨水溶液_醋酸時(shí)的分離效果比較好。7.3流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的確定分別選用甲醇、乙醇、乙腈與醋酸銨水溶液-醋酸緩沖溶液按照3070組成流動(dòng)相，恒比例洗脫。結(jié)果使用乙腈時(shí)的分離效果比較好。7.4梯度洗脫的確定在恒比例洗脫條件下，各單糖分離度只達(dá)到0.81.0，不是很好，所以改用梯度洗脫。從030分鐘，乙腈的比例從10%50%之間調(diào)整。結(jié)果按以下梯度洗脫，各單糖分離度能到1.5以上。乙腈緩沖溶液Omin208025min4060。權(quán)利要求一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法，其特征在于天麻多糖首先水解成為單糖，再經(jīng)衍生化試劑衍生，之后進(jìn)HPLC-UV系統(tǒng)檢測(cè)，得到各個(gè)單糖的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法，其特征在于本檢測(cè)方法是檢測(cè)天麻多糖中單糖的含量。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法，其特征在于天麻多糖水解為酸水解，所用的酸選鹽酸、硫酸、甲酸、乙酸、三氯乙酸和三氟乙酸。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法，其特征在于高效液相檢測(cè)系統(tǒng)所用色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的方法，其特征在于流動(dòng)相為緩沖溶液與有機(jī)溶劑的混合液，其中有機(jī)溶劑的比例在10-50%之間。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述色譜檢測(cè)的流動(dòng)相條件，其特征在于所用緩沖溶液由弱酸及其共軛酸鹽組合成的溶液，緩沖溶液選自磷酸二氫鉀水溶液_氫氧化鈉、磷酸氫二鈉_磷酸二氫鉀、醋酸-醋酸鈉水溶液、醋酸銨水溶液_醋酸、檸檬酸_檸檬酸鈉水溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述色譜檢測(cè)的流動(dòng)相條件，其特征在于所用有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測(cè)天麻多糖中單糖組成的新方法。本發(fā)明公開了天麻多糖首先水解成為單糖，再經(jīng)衍生化試劑衍生，之后進(jìn)HPLC-UV系統(tǒng)檢測(cè)，得到各個(gè)單糖的含量。本方法所用高效液相檢測(cè)系統(tǒng)條件為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱，流動(dòng)相為按一定比例混合的緩沖溶液和有機(jī)溶劑，流速0.8～1.5ml/min，紫外或PDA檢測(cè)器。本方法重復(fù)性好，靈敏度高，可以方便、準(zhǔn)確的檢測(cè)天麻多糖中單糖組成。文檔編號(hào)G01N30/02GK101825611SQ201010157658公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年4月21日優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日發(fā)明者侯峰,盧平華,錢陳欽申請(qǐng)人:廣州市和藤醫(yī)藥研究開發(fā)有限公司