專利名稱：含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血吸蟲(chóng)病是分布最廣泛、危害最嚴(yán)重的被忽略熱帶疾病之一，我國(guó)流行的是日本血吸蟲(chóng) 病，其病原體為日本血吸蟲(chóng)。日本血吸蟲(chóng)(Schistosoma japonicum, Sj)的生活周期復(fù)雜， 有釘螺作為其中間宿主和人、水牛、黃牛等哺乳動(dòng)物作為其終末宿主。近年來(lái)，對(duì)于血吸蟲(chóng) 生命活動(dòng)的分子機(jī)制和其重要功能分子的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注，其中熱休克蛋白(Heat shock proteins, Hsp)便是一類重要的功能分子，它是很多生命活動(dòng)的參與者。熱休克蛋白 是一類高水平基礎(chǔ)表達(dá)的蛋白質(zhì)，占正常生長(zhǎng)條件下所有類型細(xì)胞中蛋白總量的5%-10%。當(dāng) 細(xì)胞處于逆境時(shí)，熱休克蛋白的表達(dá)量明顯上調(diào)。Hsp60是熱休克蛋白的家族之一，是一種 在細(xì)胞保護(hù)中起重要作用的分子伴侶。真核生物的Hsp60主要定位于線粒體，另有一小部分 存在于胞漿。線粒體中的Hsp60可作用于凋亡相關(guān)因子而抑制線粒體凋亡通路的激活，并且能 夠減少線粒體產(chǎn)生氧自由基；胞漿中的少量Hsp60亦可通過(guò)與凋亡相關(guān)因子的相互作用等途 徑抑制細(xì)胞凋亡。作為分子伴侶，Hsp60幫助變性和不可溶的蛋白聚集體恢復(fù)正確構(gòu)象。正 常條件下，Hsp60以穩(wěn)定狀態(tài)存在于線粒體基質(zhì)和胞漿中；應(yīng)激條件下，Hsp60迅速?gòu)陌麧{轉(zhuǎn) 移到線粒體基質(zhì)以修復(fù)線粒體基質(zhì)中的變性蛋白。張玲等用吡喹酮對(duì)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)進(jìn)行體 外作用，采用二維-納噴霧-液相色譜聯(lián)合串聯(lián)質(zhì)譜的方法，發(fā)現(xiàn)經(jīng)吡喹酮作用后，Hsp60和 Hsp70蛋白明顯上調(diào)，提示熱休克蛋白可能參與緩解吡喹酮對(duì)細(xì)胞損害的作用，導(dǎo)致生物體 合成這類蛋白質(zhì)的能力增強(qiáng)。由此推測(cè)，抑制熱休克蛋白基因表達(dá)或抑制熱休克蛋白活性以 減少其他多種蛋白的合成可能能夠作為一種抗血吸蟲(chóng)的新途徑。
疫苗是控制傳染性疾病的有效手段，也是血吸蟲(chóng)病綜合防治的重要措施之一，世界衛(wèi)生 組織專家認(rèn)為，短效的化療手段必須與長(zhǎng)效的疫苗措施相結(jié)合。盡管目前所有實(shí)驗(yàn)性血吸蟲(chóng) 病疫苗在免疫后均只能誘導(dǎo)出對(duì)血吸蟲(chóng)感染部分抵抗力，但由于血吸蟲(chóng)在其終宿主體內(nèi)不繁 殖，故對(duì)控制血吸蟲(chóng)病仍有重要的生物學(xué)與臨床意義。尋找新的疫苗候選抗原仍是當(dāng)今血吸 蟲(chóng)疫苗研究的重點(diǎn)之一。
到目前為止，還沒(méi)有出現(xiàn)關(guān)于本發(fā)明日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60作為疫苗應(yīng)用的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體，該重組載體表 達(dá)的日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60可作為抗血吸蟲(chóng)的疫苗候選抗原。
此外，還需要提供一種含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體在制備預(yù)防或治療血吸蟲(chóng)病的 疫苗中的應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體，所述基因是閂本 血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因。
優(yōu)選的，所述日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因序列是編碼SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的 核苷酸序列；更優(yōu)選的，該日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因序列為SEQ IDN0:2所示核苷酸序 列。
優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體更優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體 pET28a(+)。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含上述重組表達(dá)載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞。 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60的制備方法，包括以下歩
驟
構(gòu)建含日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因的重組表達(dá)載體；
將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細(xì)胞；
培養(yǎng)包含重組表達(dá)載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞，并在合適條件下，誘導(dǎo)該重組表達(dá)載體表 達(dá)日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60;
純化誘導(dǎo)表達(dá)的日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60。
優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)表達(dá)的日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60還連接有包含6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列。 在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述重組表達(dá)載體在制備預(yù)防或治療血吸蟲(chóng)病的疫 苗中的應(yīng)用。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述重組表達(dá)載體在制備診斷血吸蟲(chóng)病的產(chǎn)品中的 應(yīng)用。
本發(fā)明重組載體表達(dá)的日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60可以作為診斷抗原對(duì)血吸蟲(chóng)病畜進(jìn)行 診斷。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述制備方法生產(chǎn)的日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60作為 預(yù)防或治療血吸蟲(chóng)病疫苗的用途。
本發(fā)明含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體，能夠高表達(dá)閂本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60，該高表達(dá)的重組日本血吸蟲(chóng)Hsp60蛋白在小鼠免疫性保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，使免疫組小鼠的減蟲(chóng)率與肝組 織減卵率分別達(dá)到28. 76%和24. 85%，表明本發(fā)明重組曰本血吸蟲(chóng)Hsp60蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生 一定水平的抗日本血吸蟲(chóng)感染保護(hù)作用。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
圖1是本發(fā)明實(shí)施例1重組質(zhì)粒的酶切與PCR鑒定圖2是本發(fā)明實(shí)施例2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖； 圖3是本發(fā)明實(shí)施例3重組日本血吸蟲(chóng)h印60蛋白表達(dá)形式的鑒定與純化圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的 實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本發(fā)明利用重組DNA技術(shù)將日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60 (hsp60)基因的編碼序列克隆至 原核表達(dá)載體，并使其在大腸桿菌中大量表達(dá)，且純化得到其表達(dá)產(chǎn)物。純化產(chǎn)物可應(yīng)用于小 鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估其抗血吸蟲(chóng)的保護(hù)效果，為抗血吸蟲(chóng)病疫苗分子的篩選提供重要的 參考價(jià)值。
實(shí)施例1 日本血吸蟲(chóng)hsp60基因編碼序列原核表達(dá)載體的構(gòu)建 査找日本血吸蟲(chóng)hsp60基因在Genebank中的序列設(shè)計(jì)引物，用DNAstar分析其序列特征，
并找到其最大的開(kāi)放閱讀框(SEQ ID N0:2)，即其編碼蛋白質(zhì)的序列部分，根據(jù)這一部分序
列設(shè)計(jì)引物如下
sense: 5， -CCGGGATCCATGTTACGAGCTCTAAGTTCA_3， ( SEQ ID NO:3)， anti-sense:5， -GCGCTCGAGCATCATGCCTCCCATTCCA-3' ( SEQ ID NO:4)， 分別引入限制性內(nèi)切酶BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。Hsp60開(kāi)放閱讀框的擴(kuò)增 以閂本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR。采用的原核表達(dá)載體pET28a(+)為表達(dá)6XHis標(biāo) 簽的高效表達(dá)載體，該載體設(shè)計(jì)有多克隆酶切位點(diǎn)，可以插入外源基因片段hsp60基因編碼序 列。將擴(kuò)增hsp60基因編碼序列的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、雙酶切后，與同樣雙酶切的質(zhì)粒pET28a(+) 于16。C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含有卡那霉素(100ug/ml) 的LB平板上。挑取單一菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR及單、雙酶切鑒定，將初步鑒定正 確的陽(yáng)性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序。
圖l為重組質(zhì)粒Sjhsp60-pET28a(+)的酶切與PCR鑒定圖，在圖l中，Ml: DNA標(biāo)志物 (DL15000); h重組質(zhì)粒BamH I單酶切鑒定；2:重組質(zhì)粒BamH I 、 Xhol I雙酶切鑒定；3:
5重組質(zhì)粒PCR鑒定；M2: DNA標(biāo)志物(DL2000)。從圖l可以看出，在"2"、 "3"泳道都有明顯 的1725bp大小的hsp60條帶，表明經(jīng)PCR擴(kuò)增出的hsp60基因片段，成功地插入了原核表達(dá)載體 pET28a(+)的多克隆酶切位點(diǎn)。
重組質(zhì)粒DNA經(jīng)測(cè)序得知，重組質(zhì)粒中插入片段的序列與Genebank中公布的日本血吸蟲(chóng) SJCHGC09129蛋白mRNA完整編碼區(qū)完全一致，達(dá)到100%的吻合度，且與曼氏血吸蟲(chóng)熱休克蛋白 60的mRNA也有81W的吻合度，可以證明本發(fā)明成功地將日本血吸蟲(chóng)hsp60的編碼序列插入了原 核表達(dá)載體，且插入方向正確。
實(shí)施例2日本血吸蟲(chóng)hsp60基因原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)
將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒S jhsp60-pET28a (+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞 中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，挑取單一菌落，鑒定正確后接種于液體LB培養(yǎng)基中， 待達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入異丙基-13-D-硫代半乳糖苷(IPTG，終濃度為lmM/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表 達(dá)，分別收集誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后lh、 2h、 4h及6h的菌液，用十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳(SDS-PAGE電泳，5。/。濃縮膠80V電壓，127。分離膠120V電壓)分析驗(yàn)證。
結(jié)果如圖2所示，在圖2中，M:蛋白質(zhì)標(biāo)志物；1:未誘導(dǎo)的菌液；2:誘導(dǎo)后lh; 3:誘 導(dǎo)后2h; 4:誘導(dǎo)后4h; 5:誘導(dǎo)后6h。從圖2可以看出，誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后各時(shí)相，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE, 其中l(wèi)條帶隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增寬，4h達(dá)最大，該條帶與目的蛋白大小Mr67000Da相近(閂 本血吸蟲(chóng)hsp60基因所編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO:l所示，其相對(duì)分子質(zhì)量約為62000Da， 表達(dá)出的產(chǎn)物為包含有部分載體序列的6個(gè)組氨酸標(biāo)簽和插入片段Sjhsp60基因所編碼的蛋白 質(zhì)的融合體rSjhsp60，該融合體蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為67000Da)。可以證實(shí)，重組質(zhì)粒在 大腸桿菌當(dāng)中獲得了高水平的表達(dá)。
實(shí)施例3 原核表達(dá)載體表達(dá)產(chǎn)物的純化
小量誘導(dǎo)重組菌(100ml) ,4。C，4000rpm離心15min，收集菌體沉淀，用PBS洗滌后，加 入1X結(jié)合緩沖液(binding buffer)重懸菌體，反復(fù)凍融3次后，超聲破碎細(xì)胞。將超聲 后的懸液于4t:， 12000rpm，離心30min，分別收集上清和沉淀鑒定其表達(dá)形式。由圖3可知， 重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)在超聲后的沉淀中，說(shuō)明其表達(dá)形式為包涵體。在圖3中，1:超聲 后的上清；2:超聲后的沉淀；3:純化后的蛋白。
利用重組表達(dá)的融合體蛋白中的組氨酸和鎳離子的親和性可將該融合體蛋白加以純化，
純化步驟按照Novagen His-tag純化手冊(cè)進(jìn)行。
將沉淀用含6M尿素的1X結(jié)合緩沖液溶解，4°C， 12000rpm，離心30min，收集上清。用
His.Bind樹(shù)脂純化表達(dá)產(chǎn)物。具體操作如下
(1)將400pL樹(shù)脂懸液加入到1.5mL離心管中，低速離心后除去上清。(2) 按以下順序和次數(shù)進(jìn)行樹(shù)脂的離子化和平衡。
a. 2倍體積滅菌去離子水，2次
b. 2倍體積1X離子化緩沖液(charge buffer), 3次
c. 2倍體積1X結(jié)合緩沖液，2次
(3) 加入前述用尿素溶解后的上清，輕柔混勻，孵育5min， 2000rpm，離心5min，棄上清。
(4) 3倍體積1X結(jié)合緩沖液清洗樹(shù)脂3次。
(5) 3倍體積1X沖洗緩沖液(washing buffer)清洗樹(shù)脂3次。
(6) 1倍體積1X洗脫緩沖液(stripping buffer)將目的蛋白從樹(shù)脂上剝離下來(lái)。 由圖3可知，表達(dá)產(chǎn)物rSjhsp60得到了純化(見(jiàn)圖3第"3"泳道箭頭所指的條帶)，且純
度較高。
實(shí)施例4純化后表達(dá)產(chǎn)物對(duì)小鼠的免疫
將6周齡雄性BALB/c小鼠分為兩組(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)，每組10只。首次免疫按每只小 鼠10(Vg純化后的日本血吸蟲(chóng)hsp60 (rSjhsp60)與206佐劑混合的乳劑，皮下注射。每隔 14天同樣劑量進(jìn)行第二次和第三次免疫。用PBS與206佐劑的混合乳劑以同樣方法處理對(duì)照 組小鼠。
第三次免疫一周后，每只小鼠攻擊日本血吸蟲(chóng)尾蚴40條。
感染后42天將兩組小鼠剖殺，肝門(mén)靜脈沖蟲(chóng)，計(jì)算減蟲(chóng)率。同時(shí)每只小鼠取0.5g肝臟， 勻漿后，經(jīng)氫氧化鉀消化后進(jìn)行肝組織蟲(chóng)卵計(jì)數(shù)，計(jì)算減卵率。通過(guò)對(duì)減蟲(chóng)率與減卵率的分 析，評(píng)估本發(fā)明重組日本血吸蟲(chóng)hsp60蛋白作為抗原的免疫保護(hù)效果。
減蟲(chóng)率=(1-免疫組平均蟲(chóng)荷數(shù)/對(duì)照組平均蟲(chóng)荷數(shù))X100%
減卵率=(1-免疫組平均卵荷數(shù)/對(duì)照組平均卵荷數(shù))X100%
結(jié)果如下表l所示，rSjhsp60實(shí)驗(yàn)組的減蟲(chóng)率與減卵率分別為28. 76%和24. 85%，表明 rSjhsp60能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的抗日本血吸蟲(chóng)感染保護(hù)作用，本發(fā)明重組抗原rSjhsp60
具有一定的免疫保護(hù)效果。
表1 rSjhsp60免疫小鼠的減蟲(chóng)率和減卵率
平均蟲(chóng)荷數(shù)減蟲(chóng)率t檢驗(yàn)平均卵荷減卵率t檢驗(yàn)(p
(x土s)(%)數(shù)(x士s)(%)< 0. 05)
實(shí)驗(yàn)組12. 00±2.828. 76p<0. 052568924. 85p<0. 05
對(duì)照組18.20±3. 1一一34184—一
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而 理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此， 本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所
<120>含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體及其應(yīng)用
<160> 4
<]70> Patentln version 3.3
<2丄0> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> Schistosoma japonicum
<400> 1
Met Leu Arg Ala Leu Ser Ser Leu 1 5 Gin Lys Val Val Gin Arg Phe Tyr 20
Asp Ala Arg Ser Ala Met Leu lie 35 40 Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys
50 55 Ser Trp Lys Ser Pro Lys lie Thr 65 70 Gly lie Glu Leu Lys Asp Lys Phe 85
Gin Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn 100
Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ala 115 120 lie Ser Lys Gly Ala Asn Pro lie
130 135 Ala Val Asp Ala Val Val Lys Glu 145 150 Ser Thr Pro Glu Glu lie Ala Gin 165
Asp Lys Ala lie Gly Asp Leu lie 180
Asn Asp Gly Thr lie Thr Val Lys 195 200 Leu Glu Phe lie Glu Gly Met Lys
210 215 Tyr Phe lie Asn Thr Glu Lys Gly 225 230 Phe lie Leu Phe Ser Glu Lys Lys 245
Pro Ala Leu Glu Leu Cys His Gin 260
Ala Lys Asp Val Glu Gly Glu Ala
Arg Gly Ser Leu Val Pro Ala Arg
10 15 Ala Lys Glu Val Lys Phe Gly Ala 25 30 Gly Val Asp Val Leu Ala Asp Ala 45
Gly Arg Asn Val lie lie Glu Ser 60
Lys Asp Gly Val Thr Val Ala Lys
75 80 Gin Asn lie Gly Ala Lys Leu Val
90 95 Glu Glu Ala Gly Asp Gly Thr Thr 105 110 lie Ala Lys Glu Gly Phe Glu Lys 125
Glu Phe Arg Arg Gly Val Met Leu 140
Leu Lys Ser Phe Ser Lys Gin lie 155 160 Val Ala Thr lie Ser Ala Asn Gly
170 175 Ala Ser Ala Met Lys Arg Val Gly 185 190 Asp Gly Lys Thr Leu His Asp Glu 205
Phe Asp Arg Gly Tyr lie Ser Pro 220
Ala Arg Cys Glu Phe Gin Asp Ala 235 240 lie Asn Ser lie Gin Thr Leu Leu
250 255 Gin Lys Arg Pro Leu Leu lie "lie 265 270 Leu Thr Ala Leu Val Leu Asn Axg
9Leu Lys 290 Gly Asp 305
Gly lie
Thr Thr
Arg Leu
Thr Tyr 370 Met Lys 385
Val Ala
Lys Lys
Glu Glu
Pro Val 450 Val Arg 艦
His Asn
Met Ser
Met lie
Leu Val 530 Val Val 545
Met Gly
275 Leu
Asn
Val
Ala
Phe 355 Arg
Lys
Val
Asp
Gly 435 Leu
lie
Ala
Gin
Glu 515 Asp
Thr
Gly
Gly
Arg
Phe
Arg 340 Thr
His
Glu
lie
Arg 420 lie
Asp
Val
Gly
Asn 500 Ala
Ala
Asp
Met
Leu
Glu
Gly 325 Phe
Asn
Lys
Lys
Lys 405 丁yr
Val
Thr
Leu
Val 485 Met
Gly
Ala
Leu
Gly 565
Gin
Lys 310 Thr
Gly
Ala
Leu
Met 390 Val
Thr
Pro
Leu
Arg 470 Asn
Gly
lie
Gly
Pro 550 Gly
Val 295 Tyr
Lys
Thr
Arg
Lys 375 His
Gly
Asp
Gly
Ser 455 Ala
Ala
Tyr
lie
Val 535 Lys
Met
280 Cys
lie
Gin
Cys
Ser 360 Met
Glu
Gly
Ala
Gly 440 Thr
Leu
Ser
Asp
Asp 520 Ala
Glu
Gly
<210> 〈211> <212> 〈213>
〈220〉 <221> <222>
2
1725 膽
Schistosoma japonic咖
CDS
(l).. (1725)
285
Ala Val Lys Ala Pro Lys Val Phe 300
Lys Arg Tyr Gly Cys Ser Asn Arg 315 320 lie Phe Val Gin Val Arg Gly Cys
330 335 Phe Arg Ser Cys Asn Asn Lys Arg 345 350 Trp Lys Gin Asn Gly His Arg Gin 365
Lys Trp Lys Pro Pro Thr Ala Ser 380
Arg Leu Ala Lys !>eu Ser Asn Gly 395 400 Ser Ser Glu Val Glu Val Ser Glu
410 415 Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala lie 425 430 Gly Thr Ala Leu Leu Arg Cys lie 445
Lys Asn Glu Asp Gin Arg Thr Gly 460
Ser Thr Pro Cys Tyr Thr lie Ala 475 480 Val Val Val Glu Lys Val Lys Gly
490 495 Ala Gin Asn Asp Val Tyr Val Asp 505 510 Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala 525
Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Thr 540
Glu Thr Gly Gly Asn Ala Ala Gly 555 560 Gly Met Gly Gly Met Met 570
〈400〉 2atgMet1
caaGin
Asp
gttVal
tcg
Ser
65
ggt
Gly
ttaLeu
Lys
gcaAla
gca
Ala
50
tgg
Trp
attlie
cgetArg
gttVal
卿
Arg
35
gtc
Val
Lys
gagGlu
cag gac gttGin Asp Val
Thr
atailie
getAla145tecSer
gccAla
agtSer130gttVal
acaThr
actThr115aaaLys
gatAsp
CC3
Pro
ggic aag getAsp Lys Ala
aatAsn
ttgLeu
tatTyr225ttcPhe
gatAsp
g明Glu210tttPhe
3talie
ggcGly195tttPhe
atelie
ttgLeu
getAla
gtt
Val
20
tea
Ser
accThr
tctSer
ctgLeu
getAla100gttVal
ggcGly
getAla
g肪Glu
attlie180acgThr
etaLeu5
caaGin
getAla
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ccaPro
肪g
Lys
85
aac
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getAla
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gagGlu165ggcGly
lie
肪cAsn
tttPhe
agt tea cttSer Ser Leu
agg ttt tatArg Phe Tyr
atgMet
ggcGly
aaa
Lys
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〈210〉 3
<211〉 30
<212〉 鵬〈213〉人工序列
<220>
〈221> misc一feature
<222〉 (l).. (30)
<223> 引物
<220>
<221> misc—signal
<222> (4).. (9)
<223> BamH I酶切位點(diǎn)
<400> 3
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〈210> 4
<211> 28
<212> DNA<213〉人工序列
<220>
<221> misc—feature
<222> (l)..咖
〈223> 引物
<220>
<221> misc—signal
<222> (4).. (9)
〈223〉 Xhol酶切位點(diǎn)
〈400> 4
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權(quán)利要求
1.一種含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述基因是日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因序列是編碼SEQ ID NO:l所示氨基酸序列的核苷酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因序列為SEQ ID N0:2所示核苷酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體pET28a(+)。
5. —種包含權(quán)利要求1所述重組表達(dá)載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞。
6. —種日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60的制備方法，其特征在于，包括以下歩驟構(gòu)建含閂本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因的重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌宿主細(xì)胞；培養(yǎng)包含重組表達(dá)載體的大腸桿菌宿主細(xì)胞，并在合適條件下，誘導(dǎo)該重組表達(dá)載體表達(dá)閂本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60;純化誘導(dǎo)表達(dá)的R本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)表達(dá)的日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60還連接有包含6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽序列。
8. 權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體在制備預(yù)防或治療血吸蟲(chóng)病的疫苗中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體在制備診斷血吸蟲(chóng)病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求6所述制備方法生產(chǎn)的日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60作為預(yù)防或治療血吸蟲(chóng)病疫苗的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體，所述基因是日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60基因。本發(fā)明還公開(kāi)了日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60的制備方法及上述重組表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的含日本血吸蟲(chóng)基因的重組表達(dá)載體，能夠高表達(dá)日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白60，該高表達(dá)的重組日本血吸蟲(chóng)Hsp60蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的抗日本血吸蟲(chóng)感染的保護(hù)作用。
文檔編號(hào)G01N33/53GK101671689SQ20091005767
公開(kāi)日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日
發(fā)明者磊 張, 朱傳剛, 林矯矯, 汪勇沛, 珂 陸 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所