專利名稱：：用于測定羥丙基-β-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分析方法應(yīng)用研究領(lǐng)域中的質(zhì)譜測定方法，尤其涉及一種用于測定羥丙基-13-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UFLC-MS/MS)。
背景技術(shù)：
：羥丙基-J3-環(huán)糊精(Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin;HP-P-CD)是P-環(huán)狀糊精的一種羥烷基化衍生物，是近幾年有關(guān)制備方法、毒理試驗、應(yīng)用范圍研究比較透徹的P-CD衍生物之一。HP-e-CD不但可以與P-CD—樣對許多化合物具有優(yōu)良的包絡(luò)作用，可以提高被包絡(luò)物質(zhì)的穩(wěn)定性，而且它還具有水溶性高和在生物體內(nèi)提高被包絡(luò)藥物的釋放速度和生物利用度，因此，HP-P-CD因其所具有的一些特殊的優(yōu)良特性而使得應(yīng)用范圍更廣，現(xiàn)已在醫(yī)藥上廣泛應(yīng)用。由于HP-P-CD的水溶性大于50。/。、流動性好、溶血活性低、對肌肉無刺激，并能增加藥物的穩(wěn)定性，因此許多藥物已用HP-3-CD制備注射劑并取得滿意的效果。雖然目前對HP-3-CD制備注射劑已有研究，但集中在對其在體內(nèi)的分布研究。該研究主要通過放射標記后口服"C-HP-P-CD后，研究在組織(主要是肝臟和腎臟)中的14C水平，由于HP-P-CD樣品不純及沒有更有效的質(zhì)量控制方法，用"C-HP-P-CD進行研究時對HP-P-CD真正的體內(nèi)代謝研究證據(jù)不足，同時"C放射標記對人體研究有害。為控制其質(zhì)量和臨床用藥，同時為藥動學(xué)研究和尿中的累計排除量計算，建立科學(xué)的測定HP-P-CD方法非常迫切，準確的定量測定方法建立有著重要的意義。目前關(guān)于HP-3-CD的特性及在應(yīng)用方面的報道比較多，如1984-2009年中國專利數(shù)據(jù)庫中的專利號為ZL02116766.4的《有機藥物與倍他環(huán)糊精衍生物配合物及其制備方法》、申請?zhí)枮?2149146.1的《抗癌藥紫杉醇自乳化固體納米?！⑸溆米仙即嫉闹苽浞椒ā贰＠枮閆L03825141.8的《以衍生環(huán)糊精穩(wěn)定化的含有水性填充組合物的膠囊》等，但對其進行定量研究的色譜、質(zhì)譜方法學(xué)卻未見文獻報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、重現(xiàn)性好、可進行定量分析的用于測定羥丙基-I3-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種用于測定羥丙基-13-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，包括以下步驟(l)羥丙基-B-環(huán)糊精標準曲線溶液的制備將羥丙基-13-環(huán)糊精標準品用流動相定容至10ug/ml，得標準溶液，然后將該標準溶液依次用流動相稀釋成濃度為50，100,250，500，1000，2000，2500ng/ml，即得標準曲線溶液；(2展丙基-B-環(huán)糊精質(zhì)量控制溶液的制備將所述步驟(l沖的10ixg/ml標準溶液用流動相依次稀釋成濃度為50，100，800，2000ng/ml，即得質(zhì)量控制溶液；(3)樣品處理其中所述樣品為含羥丙基-J3-環(huán)糊精的凍干型多西他賽制劑或尿液；(4)分別對標準曲線溶液、質(zhì)量控制溶液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，建立測定樣品溶液中羥丙基-13-環(huán)糊精的方法。所述流動相為甲醇-水、甲醇-醋酸銨、乙腈-水、乙腈-水-乙酸中的任意一種。所述甲醇-水的體積比為1:19:1;甲醇-醋酸銨的體積比為2:1~4:1;乙腈-水的體積比為4:69:1;乙腈-水-乙酸的體積比為40:59:卜60:39:1;其中醋酸銨的濃度為110mM。所述步驟(3)中的含羥丙基-15-環(huán)糊精的凍干型多西他賽制劑的處理方法是指將樣品用流動相稀釋定容至100ug/ml得樣品儲備液，然后在樣品儲備液中加入流動相渦旋混勻，經(jīng)離心后取上清液作為樣品溶液的方法；其中樣品儲備液與流動相的體積比為1:901:110。所述步驟(3)中的尿液處理方法是指在樣品中依次加入樣品體積的1:11:2的乙二胺四乙酸和1:501:55的氨水，渦旋混勻得混合液，然后在混合液中加入流動相，經(jīng)離心后取上清液作為樣品溶液的方法；其中混合液與流動相的體積比為1:6~1:7。所述步驟(4)中的色譜分析是指在柱溫為204(TC的色譜柱中以0.1~10ml/min的流速進行檢測。所述步驟(4)中的質(zhì)譜分析是指通過電噴霧離子化，采用多反應(yīng)檢測方式進行正離子檢測；其中離子源為ESI;檢測離子對為m/zl215.7—1215.7、m/z1273.4—1273.4、m/z1331.6—1331.6、附/z1389.8—1389.8、m/z1447.5—1447.5、附/z1506.7—1506.7、附/z1563.5—1563.5、m/z1622.4—1622.4。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1、本發(fā)明采用超快速液相色譜(UFLC)-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)法測定HP-P-CD，在對其質(zhì)譜條件進行系統(tǒng)優(yōu)化后，并通過測定凍干型多西他賽注射劑中的HP-e-CD含量，考察了本發(fā)明的穩(wěn)定性。a、專屬性本發(fā)明對空白溶液(參見圖2中的a)、1wg/mlHP-P-CD的標準溶液(參見圖2中的b)溶液進行了分析，可知樣品中其它成份不干擾HP-P-CD的測定。b、基質(zhì)效應(yīng)以凍干型多西他賽為研究對象，在多西他賽標準溶液中加入HP-P-CD標準溶液配成含HP-P-CD為1Pg/ml的溶液來考察基質(zhì)效應(yīng)對測定HP-P-CD的影響。采用UFLC-MS/MS對所配制溶液進行分析，得峰面積A，保留時間為0.89min;采用UFLC-MS/MS對1yg/mlHP-P-CD標準溶液進行分析，得到相應(yīng)的峰面積B，以A/B考察方法的基質(zhì)效應(yīng)，A/B"l，結(jié)果表明本方法無基質(zhì)效應(yīng)(參見圖3)。c、標準曲線和檢出限分別對HP-P-CD濃度為50，100，250，500，1000，2000，2500ng/ml的標準曲線溶液進行UFLC-MS/MS分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行處理，結(jié)果表明在502500ng/mL范圍內(nèi)線形關(guān)系良好，y=5.6x-158(r2=0.9991)，權(quán)重為l/x2，最低檢測線為50ng/mL(參見表l)。表l:標準曲線的準確度和精密度濃度(ng/ml)平均值±標準偏差(n二6)準確度(％)精密度(％)5050.15±0.430.87100.3010099.93±0.620.6299.94250251.00士2.711.08100.00500487.33±6.071.2597.531000949.67±12.631.3395.0720002026.67±20.551.01101.3225002638.33±38.911.47105.676d、準確度和精密度對質(zhì)量控制樣品(QC樣品)進行分析，連續(xù)測定3天，每天重復(fù)6次，求算本發(fā)明的準確度和精密度，數(shù)據(jù)表明本發(fā)明符合分析要求。(參見表2)表2:閂內(nèi)及日間精密度測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>e、加標回收率分別取2ug/ml多西他賽標準溶液950、900、800uL，依次加入10ug/mlHP-P-CD標準溶液50、100、200yL，混勻后進行加標回收實驗，回收率見表3。表3:加標回收率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>f、穩(wěn)定性對低、高濃度的QC樣品進行分析，考察0h，樣品池中放置6h，室溫放置7h、24h、5d，3次反復(fù)冷凍-室溫，4。C下保存5d條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果表明在上述條件下被測物穩(wěn)定。(參見表4)表4:穩(wěn)定性測定結(jié)果濃度(ng/ml)穩(wěn)定性平均值土標準偏差(n=6)準確度(％)精密度(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2、由于本發(fā)明具有特異性高、重現(xiàn)性好、靈敏度高、分析速度快，操作簡單等特點，因此可適用于制劑中HP-P-CD質(zhì)量的控制和體內(nèi)HP-P-CD的代謝研究，為HP-P-CD藥代動力學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。圖1為本發(fā)明的全離子掃描質(zhì)譜圖。圖2為本發(fā)明的專屬性實驗色圖譜;其中a為空白標準溶液，b為1pg/mlHP-P-CD的標準溶液。圖3為本發(fā)明的基質(zhì)抑制實驗色圖譜；其中A為1wg/mlHP-P-CD標準溶液，B為1ug/mlHP-3-CD的樣品溶液。圖4為本發(fā)明的測定HP-3-CD標準品色圖譜。圖5為本發(fā)明的測定多西他賽(凍干型)制劑中HP-I3-CD色圖譜。圖6為本發(fā)明的測定尿液中HP-3-CD色圖譜。具體實施例方式實施例1用超快速液相色譜(UFLC)-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)法測定制劑中HP-3-CD的含量，包括以下步驟(1)HP-0-CD標準曲線溶液的制備精密稱取NIHONSHOKUHIN公司生產(chǎn)的HP-P-CD標準品0.0050g于10ml容量瓶，用體積比為l:19:l的甲醇-水流動相定容，搖勻得500ng/mlHP-P-CD標準溶液作為儲備液；吸取儲備液200tx1于另一10ml容量瓶，流動相定容，搖勻得10txg/mlHP-3-CD標準溶液。取500pL、10|ig/ml的HP-(3-CD標準溶液于3ml離心管中，加流動相1500(iL后放入渦旋混勻器(金壇市金城教學(xué)儀器廠)中渦流混勻，得2500ng/ml溶液；取800(iL、2500ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相200pL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得2000ng/ml溶液；取500(iL、2000ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相500(iL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得1000ng/ml溶液；取500iaL、1000ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相500pL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得500ng/ml溶液；取500pL、500ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相500pL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得250ng/ml溶液;取400(aL、250ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相600(iL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得100ng/ml溶液；取500pL、100ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相500)iL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得50ng/ml溶液。上述50，100，250，500，1000，2000和2500ng/ml溶液即為標準曲線溶液。(2)HP-P-CDQC溶液的制備取200[^L、10嗎/ml的HP-(3-CD標準溶液于1.5ml離心管中，加入流動相800fiL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得2000ng/ml溶液；取400)aL、2000ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相600pL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得800ng/mlQC溶液；取125pL、800ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相875nL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得100ng/ml溶液;取500fiL、100ng/ml溶液于1.5ml離心管中，加入流動相500^iL后，放入渦旋混勻器中渦流混勻，得50ng/ml溶液。上述50，100，800，2000ng/ml溶液即為QC溶液。(3)樣品采用凍干型多西他賽制劑(山東齊魯制藥有限公司)，其處理方法是精密稱取凍干型多西他賽0.0010g于10ml容量瓶內(nèi)，用體積比為l:卜9:l的甲醇-水流動相溶解，并稀釋至刻度定容至10ml，搖勻得100ug/ml樣品儲備液；然后精密吸取樣品儲備液于5ml離心管中，加入流動相混勻，得1txg/ml樣品溶液；將該1ug/ml樣品溶液放入渦旋混勻器中渦旋混勻lmin后，放入高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)中以5000r/min的速率離心5min后，用移液槍吸取上清液作為樣品溶液放入進樣瓶中備用。其中樣品儲備液與流動相的體積比為l:901:110。(4)分別對標準曲線溶液、質(zhì)量控制溶液采用超快速高效液相色譜儀(日本島津)一三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB公司)進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到全掃描離子圖(參見圖l)及色譜圖4。建立測定樣品溶液中羥丙基-J3-環(huán)糊精的方法，該方法的色譜分析條件如下色譜柱Shim-packXR-ODS柱(直徑3.0mm、長度75mm)(日本島津公司)，流速0.1~10ml/min，柱溫25°C，進樣量lOul，整個分析流程用時3min;質(zhì)譜分析條件如下通過電噴霧離子化，采用多反應(yīng)檢測方式進行正離子檢測分析，離子源為ESI+和ESI—;檢測離子對為w/zl215.7—1215.7、w/z1273.4—1273.4、m/z1331.6—1331.6、w/z1389.8—1389.8、w/z1447.5—1447.5、w/z1506.7—1506.7、w/z1563.5—1563.5、Wz1622.4—1622.4。同時對相應(yīng)的參數(shù)DP、EP、TEM、CE等進行了優(yōu)化——DP:70;EP:5;CE:100;CXP:9;CUR:10，CAD:1，IS:5500;TEM:260;GS1:50;GS2:60。所測定樣品中的HP-P-CD含量為19.8mg/ml。實施例2用超快速液相色譜(UFLC)-串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)法測定尿液中的HP-0-CD的含量為4.5mg/ml，并得到色譜圖6。其中HP-e-CD標準曲線溶液、HP-P-CDQC溶液的制備及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析均同實施例l。樣品采用尿液，其處理方法是用移液槍精密吸取受試者尿液，加入尿液體積的1:lh2的乙二胺四乙酸(EDTA)后，放入渦旋混勻器中渦旋混勻后加入尿液體積的1:50~1:55的氨水，渦旋混勻得混合液，然后在混合液中加入體積比為l:19:l的甲醇-水流動相，渦旋混勻2min，再放入高速離心機中以5000r/min的速率離心5min后，用移液槍吸取上清液作為樣品溶液放入進樣瓶中備用。其中混合液與流動相的體積比為1:61:7。實施例3用于測定HP-P-CD的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其中HP-3-CD標準曲線溶液、HP-P-CDQC溶液的制備及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析均同實施例1。樣品的處理同實施例1或?qū)嵤├?。流動相為體積比為2:14:1的甲醇-醋酸銨；其中醋酸銨的濃度為110mM。實施例4用于測定HP-P-CD的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其中HP-P-CD標準曲線溶液、HP-P-CDQC溶液的制備及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析均同實施例l。樣品的處理同實施例1或?qū)嵤├?。流動相為體積比4:69:l的乙腈-水。實施例5用于測定HP-P-CD的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其中HP-P-CD標準曲線溶液、HP-3-CDQC溶液的制備及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析均同實施例l。樣品的處理同實施例1或?qū)嵤├?。流動相為體積比40:59:1~60:39:l的乙腈-水-乙酸。上述實施例中的甲醇、醋酸銨、乙腈、乙酸均為德國默克公司生產(chǎn)的色譜純；水采用西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的滅菌注射用水。權(quán)利要求1、一種用于測定羥丙基-β-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，包括以下步驟(1)羥丙基-β-環(huán)糊精標準曲線溶液的制備將羥丙基-β-環(huán)糊精標準品用流動相定容至10μg/ml，得標準溶液，然后將該標準溶液依次用流動相稀釋成濃度為50，100，250，500，1000，2000，2500ng/ml，即得標準曲線溶液；(2)羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量控制溶液的制備將所述步驟(1)中的10μg/ml標準溶液用流動相依次稀釋成濃度為50，100，800，2000ng/ml，即得質(zhì)量控制溶液；(3)樣品處理其中所述樣品為含羥丙基-β-環(huán)糊精的凍干型多西他賽制劑或尿液；(4)分別對標準曲線溶液、質(zhì)量控制溶液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，建立測定樣品溶液中羥丙基-β-環(huán)糊精的方法。2、如權(quán)利要求1所述的用于測定羥丙基-J3-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在于所述流動相為甲醇-水、甲醇-醋酸銨、乙腈-水、乙腈-水-乙酸中的任意一種。3、如權(quán)利要求2所述的用于測定羥丙基-(3-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在于所述甲醇-水的體積比為1:19:1;甲醇-醋酸銨的體積比為2:14:1;乙腈-水的體積比為4:6~9:1;乙腈-水-乙酸的體積比為40:59:160:39:1;其中醋酸銨的濃度為110mM。4、如權(quán)利要求1所述的用于測定羥丙基-I3-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在于所述步驟(3)中的含羥丙基-l3-環(huán)糊精的凍干型多西他賽制劑的處理方法是指將樣品用流動相稀釋定容至100ug/ml得樣品儲備液，然后在樣品儲備液中加入流動相渦旋混勻，經(jīng)離心后取上清液作為樣品溶液的方法；其中樣品儲備液與流動相的體積比為1:901:110。5、如權(quán)利要求1所述的用于測定羥丙基-B-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在于所述步驟(3)中的尿液處理方法是指在樣品中依次加入樣品體積的L.11:2的乙二胺四乙酸和1:501:55的氨水，渦旋混勻得混合液，然后在混合液中加入流動相，經(jīng)離心后取上清液作為樣品溶液的方法；其中混合液與流動相的體積比為1:6~1:7。6、如權(quán)利要求1所述的用于測定羥丙基-fi-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在于所述步驟(4)中的色譜分析是指在柱溫為204(TC的色譜柱中以0.1~40ml/min的流速進行檢測。7、如權(quán)利要求1所述的用于測定羥丙基-13-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在于所述步驟(4)中的質(zhì)譜分析是指通過電噴霧離子化，采用多反應(yīng)檢測方式進行正離子檢測；其中離子源為ESI;檢測離子對為附/zl215.7—1215.7、m/z1273.4—1273.4、附/z1331.6—1331.6、m/z1389.8—1389.8、附/z1447.5—1447.5、附/z1506.7—1506.7、w々1563.5—1563.5、附/z1622.4—1622.4。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于測定羥丙基-β-環(huán)糊精的超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，該方法包括以下步驟(1)羥丙基-β-環(huán)糊精標準曲線溶液的制備；(2)羥丙基-β-環(huán)糊精質(zhì)量控制溶液的制備；(3)樣品處理；(4)分別對標準曲線溶液、質(zhì)量控制溶液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析，建立測定樣品溶液中羥丙基-β-環(huán)糊精的方法。本發(fā)明操作簡單、重現(xiàn)性好、可對HP-β-CD進行定量分析。文檔編號G01N30/02GK101685083SQ20091002239公開日2010年3月31日申請日期2009年4月30日優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日發(fā)明者張娟紅,榮王,華謝,賈正平申請人:賈正平