專利名稱：：一種檢測(cè)三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫和檢測(cè)分析
技術(shù)領(lǐng)域：
中的一種檢測(cè)三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：三聚氰胺(Melamine)分子式是C3H6N6，又稱蜜胺、2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪。三聚氰胺外觀和物理性狀是純白色單斜棱晶體(粉末狀)，白色無味，與蛋白粉外觀相似。是一種重要的有機(jī)化工原料，主要用于生產(chǎn)三聚氰胺樹脂，廣泛用于木材加工、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革等行業(yè)。三聚氰胺具有輕微毒性，據(jù)有關(guān)資料，大鼠口服的半數(shù)致死量大于3克/公斤體重。動(dòng)物長(zhǎng)期攝入三聚氰胺會(huì)造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。2008年9月的我國(guó)的毒奶粉事件就是不法分子向奶粉中添加三聚氰胺所導(dǎo)致的。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已造成1.3萬嬰兒住院治療，其中4人死亡，104人生命垂危，在全國(guó)范圍內(nèi)已影響5.3萬嬰幼兒。22家毒奶粉生產(chǎn)廠家涉及消費(fèi)人群超過6000萬。國(guó)家工商總局已對(duì)涉及22家企業(yè)69個(gè)批次含三聚氰胺的嬰幼兒奶粉開展市場(chǎng)清查。三聚氰胺檢測(cè)將被納入中國(guó)新食品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國(guó)食品中蛋白質(zhì)含量檢測(cè)主要辦法來自"凱氏定氮法"，但是該法只能測(cè)出含氮量，不能區(qū)別飼料中有無違規(guī)添加劑或違規(guī)化學(xué)物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，它含有(1)包被三聚氰胺抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)三聚氰胺特異性抗體；(4)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。本發(fā)明所述試劑盒酶聯(lián)板中三聚氰胺包被抗原是采用活潑酯法將三聚氰胺半抗原與牛丙種球蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的，抗抗體可為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被三聚氰胺抗原或抗抗體的載體物質(zhì)可為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠、瓊脂糖凝膠等；載體的形式可以是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠、小圓片等；所用的洗滌液為磷酸鹽緩沖液；所用的封閉液是含有8%~15%的馬血清和1%惰性蛋白的溶液。本發(fā)明所述試劑盒中包被三聚氰胺抗原或抗抗體的酶聯(lián)板，是用包被緩沖液將三聚氰胺半抗原與牛丙種球蛋白(BGG)偶聯(lián)物或抗抗體稀釋后，加入酶聯(lián)板中37""C溫育2h，用洗滌液洗滌后再加封閉液37。C溫育l-2h，干燥后真空密封。本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記三聚氰胺抗原，所用酶可為過氧化物酶或半乳糖甘酶，本發(fā)明優(yōu)選過氧化物酶;酶標(biāo)記物形式可為凍干粉、濃縮液和工作液；酶標(biāo)記物工作液所用的稀釋液為含有50體積％甘油(可防止放入-20°0環(huán)境的酶標(biāo)記物凍結(jié)，亦可長(zhǎng)時(shí)間保持酶標(biāo)記物的生物活性)、1%的疊氮化鈉防腐劑(便于保存)的溶液。士4^口fi^二1:^^||在1+1船+;_:=]拾4^/+^生||々止順?biāo)?x"/力^12wv川j血ts呼vj、Kj]乂lx/lK"P口:j巾u甘火鄰yv:(1)抗抗體的制備以鼠源性抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；或以兔源性抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。(2)過氧化物酶標(biāo)記抗抗體的制備將抗抗體與過氧化物酶(HRP)進(jìn)行偶聯(lián)，采用的方法是戊二醛法，采用戊二醛法使得抗抗體與辣根過氧化物酶的結(jié)合率升高，傳統(tǒng)GA—步法偶聯(lián)反應(yīng)不易控制，反應(yīng)速度快的分子易發(fā)生自生聚合，且偶聯(lián)效率不高。為了解決這些問題，我們將一步法進(jìn)行了改進(jìn)，克服了一步法的缺點(diǎn)。首先在被偶聯(lián)的兩種分子中，與偶聯(lián)劑反映較弱的分子先用過量的偶聯(lián)劑活化，然后去處多余的偶聯(lián)劑；第二步將一端與某種分子連接的偶聯(lián)劑，通過改變反應(yīng)條件而與另一種分子連接起來。二步法雖然操作較繁，但偶聯(lián)效率提高，而且形成的同分子聚合物減少。本發(fā)明所述試劑盒中酶標(biāo)記三聚氰胺抗原是采用活性酯法將標(biāo)記酶與三聚氰胺半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。本發(fā)明所述試劑盒中三聚氰胺特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是采用活潑酯法將三聚氰胺半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的；抗體形式可為凍干粉、濃縮液、工作液；抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%馬血清和5%。明膠的磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中當(dāng)標(biāo)記酶為過氧化物酶時(shí)底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液、終止液為0.10.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為半乳糖廿酶時(shí)，底物顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩沖液;濃縮洗滌液為磷酸鹽緩沖液；濃縮復(fù)溶液為PBST緩沖液。本發(fā)明中首次選用了單底物液，相較于其他同類試劑盒的雙底物液(使用時(shí)需加2種溶液)，操作更為簡(jiǎn)便。本發(fā)明所述試劑盒中三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液為六個(gè)濃度梯度的三聚氰胺溶液，三聚氰胺濃縮復(fù)溶液為PBST緩沖液。本發(fā)明所述試劑盒中試劑的配制具體為a.三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液:三聚氰胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液6瓶，濃度為Opg/L、20|ug/L、50ng/L、100ng/L、200pg/L、500,，13ml/瓶。b.包被緩沖液pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。c.封閉液8%~15%的馬血清和1%惰性蛋白的溶液。d.濃縮洗滌液0.1%-0.5%吐溫80，0.5%疊氮化鈉防腐劑和磷酸緩沖液，l瓶。e.酶標(biāo)記物酶標(biāo)記抗抗體工作液或酶標(biāo)記三聚氰胺抗原工作液，712ml/瓶，l瓶。f.底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲與鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺CTMB)的混合液；g.終止液l~2mol/L硫酸、鹽酸或2mol/L氫氧化鈉緩沖液，58m1/瓶，1瓶。h.抗體工作稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%馬血清和5%。明膠的磷酸鹽緩沖液。i.濃縮復(fù)溶液PBST(去離子水1L):1.72gKH2P04+2.84gNa2HP04+4gNaCl+2沐C1本發(fā)明所述檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的方法，包括了以下步驟1.樣品前處理(1)取2ml去除脂肪奶樣至離心管中或取lg奶粉加入lml水中；(2)加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩10min，15°C4000r/min以上離心10min，取5ml上清液在60。C氮?dú)饬飨峦耆稍铮?3)用lml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入lml稀釋后的復(fù)溶液混合lmin，離心去除正己烷相；(4)取下層相用稀釋好的復(fù)溶液按(l)稀釋；(5)取50W用于分析。樣本稀釋倍數(shù)12.用試劑盒檢測(cè)向三聚氰胺偶聯(lián)抗原包被的96孔酶標(biāo)板微孔中加系列標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液(各2孔)5(Hd，再加入三聚氰胺抗體工作液5(Hi1，用蓋板膜封板，25'C恒溫箱中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入250W洗滌液，30秒后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體IOOjliI，用蓋板膜封板，25'C恒溫箱中反應(yīng)30min，重復(fù)洗滌工作。加入底物顯色液lOOnl,輕輕振蕩混勻，25'C恒溫箱避光顯色15min。每孔加入終止液2mol/L。硫酸50nl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值。3.檢測(cè)結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度平均值(B)，除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Bo)，再乘以100%，得到百分吸光度值。以三聚氰胺濃度的半對(duì)數(shù)為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，將樣品溶液的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液中三聚氰胺所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品溶液中三聚氰胺的實(shí)際濃度。本發(fā)明的檢測(cè)原理為當(dāng)包被原為三聚氰胺偶聯(lián)抗原時(shí)是將三聚氰胺半抗原與牛丙種球蛋白偶聯(lián)物(MAL-BGG)吸附于固相載體上，加入樣本或三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，然后加三聚氰胺特異性抗體，待測(cè)樣品中殘留的三聚氰胺和酶標(biāo)板上包被的三聚氰胺抗原競(jìng)爭(zhēng)三聚氰胺特異性抗體。再加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行酶活性的放大作用，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中三聚氰胺殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺的濃度。包被原為抗抗體時(shí)是將抗抗體吸附于固相載體上，加入三聚氰胺特異性抗體，再加入三聚氰胺酶標(biāo)記抗原和樣本或三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待測(cè)樣本中殘留的三聚氰胺和酶標(biāo)記三聚氰胺抗原競(jìng)爭(zhēng)三聚氰胺特異性抗體，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中三聚氰胺殘留量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出三聚氰胺的濃度，與標(biāo)準(zhǔn)溶液顏色比較則可判斷樣品中三聚氰胺的濃度范圍。本發(fā)明利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)研制的試劑盒可以快速檢測(cè)食品中的三聚氰胺，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高,樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)樣本量大等優(yōu)點(diǎn)。圖1為三聚氰胺的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施例方式以下描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但不能將其理解為對(duì)本發(fā)明的限定，用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段對(duì)其作出的替代、修改及改變均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1檢測(cè)三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒組分的制備1.抗原的合成a.包被原的合成將三聚氰胺采用衍生物法合成三聚氰胺半抗原，再將半抗原通過重氮化反應(yīng)和牛丙種球蛋白載體蛋白用活潑酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到。b.免疫原的合成將三聚氰胺半抗原通過重氮化反應(yīng)和鑰孔槭血藍(lán)蛋白載體蛋白用活潑酯法進(jìn)行偶聯(lián)得到。2.三聚氰胺鼠單克隆抗體的制備a.動(dòng)物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動(dòng)物，以三聚氰胺半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為300pg/只，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔2周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，四免后腹腔加強(qiáng)免疫一次，3天后取脾細(xì)胞。b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按5:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成540S個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37'C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化采用體內(nèi)誘生法，將8周齡的Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5><106個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，小瓶分裝，2(TC保存。3.三聚氰胺兔多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以三聚氰胺半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為3mg/kg，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫7天后采血，測(cè)定血清抗體效價(jià)，心臟采血，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。4.酶標(biāo)板的制備本發(fā)明所述試劑盒中包被三聚氰胺抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板的制備步驟為(1)用包被緩沖液將三聚氰胺半抗原與牛丙種球蛋白(BGG)偶聯(lián)物或抗抗體以0.02~0.08pg/ml濃度稀釋成抗原稀釋液或抗抗體稀釋液；(2)向酶聯(lián)板的每孔中加入10(^1己經(jīng)稀釋好的抗原稀釋液或抗抗體稀釋液，37"C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌1次，15~30s，拍干；(3)向酶聯(lián)板的每孔中加入150~200nl封閉液，37。C溫育l~2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。以上方法制備的酶聯(lián)板具有很好的穩(wěn)定性，經(jīng)過冷熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，酶聯(lián)板的相關(guān)技術(shù)參數(shù)均在正常范圍，且包被原有良好的特異性。實(shí)施例2檢測(cè)三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒的組建組建檢測(cè)三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分Cl)包被三聚氰胺抗原的酶聯(lián)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)三聚氰胺鼠單克隆抗體；(4)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為Opg/L、20pg/L、50pg/L、100ng/L、200pg/L、500fig/L;(5)底物顯色液為過氧化氫或過氧化脲與鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的混合液；(6)終止液為2mol/L的硫酸緩沖液；(7)濃縮洗滌液為磷酸鹽緩沖液；(8)抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3%馬血清和5%0明膠的磷酸鹽緩沖液。(9)濃縮復(fù)溶液為PBST緩沖液。實(shí)施例3檢測(cè)三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒的的組建組建檢測(cè)三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被羊抗兔抗抗體的酶聯(lián)板；(2)用過氧化物酶標(biāo)記的三聚氰胺抗原；。)三聚氰胺兔多克隆抗體；(4)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為Ong/L、20》g/L、50pg/L、100ng/L、200pg/L、500pg/L;(5)底物顯色液對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液；(6)終止液為2mol/L的氫氧化鈉緩沖液；(7)濃縮洗滌液磷酸鹽緩沖液；(8)濃縮復(fù)溶液為PBST緩沖液。實(shí)施例4樣品中三聚氰胺殘留的檢測(cè)(1)樣品前處理；(2)用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明中樣品前處理方法為樣本前處理需配制-配液l:將濃縮復(fù)溶液用去離子水按l:l稀釋配液2:20mMPBS:0.62gNaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl蒸餾水定容至1000ml液態(tài)奶和奶粉液態(tài)奶樣本處理方法1、取2ml去除脂肪奶樣至離心管中或取lg奶粉加入lml水中；2、加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振蕩10min，15°C4000r/min以上離心10min，取5ml上清液在6(TC氮?dú)饬飨峦耆稍铮?、用lml正己烷溶解干燥的殘留物后，再加入lml稀釋后的復(fù)溶液混合lmin，離心去除正己垸相；4、取下層相用稀釋好的復(fù)溶液按1稀釋；5、取50nl用于分析。樣本稀釋倍數(shù)1干貓糧的提取方法1、用攪拌機(jī)均質(zhì)干貓糧樣品。2、稱取lg均質(zhì)樣品，力卩10mL20mMPBS。3、劇烈渦旋振蕩后超聲裂解樣品lmin。再次振蕩lmin后靜置5min。10000rpm離心10min。4、用G6玻璃濾紙過濾清澈的上層相，然后用干凈的瓶子儲(chǔ)存提取液。5、提取液樣品可直接用于試驗(yàn)。備注如果沒有玻璃濾紙可以用一次性濾器和一次性針筒過濾。用本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)1、從4t冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫(20-25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8°C。3、配液將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用蒸餾水或去離子水稀釋至800ml備用(或按需要量稀釋)。4、編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、吸取50ul標(biāo)樣或稀釋的樣品提取液到相應(yīng)的微孔。每孔加50ul三聚氰胺抗體。25。C孵育30min.在吸水紙上拍打，去除孔中液體。加入250nl/孔洗滌液，15s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。7、每孔加100ul三聚氰胺酶標(biāo)記物。25。C孵育30min.8、倒出孔中液體，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，去除孔中液體。加入250^1/孔洗滌液，15s后倒出孔中液體，用吸水紙拍干，如此重復(fù)操作共洗板5次。9、顯色每孔加入底物液100ul，輕輕振蕩混勻，25。C環(huán)境中避光顯色15min。10、測(cè)定每孔加入終止液50nl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。七、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含三聚氰胺成負(fù)相關(guān)。1、粗略判定用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是Oppb為2.243;20ppb為1.816;50ppb為1.415;100ppb為0.74;200ppb為0.313;500ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是200ppb-500ppb;樣本2的濃度范圍是50ppb-100ppb，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。2、定量分析1)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即B百分吸光度值(％)=-xl00%B0B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B(r~0|Lig/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Hg/L)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中三聚氰胺實(shí)際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。實(shí)驗(yàn)例1標(biāo)準(zhǔn)品精密度試驗(yàn)從每批按照實(shí)施例1(4)中的方法制備的酶聯(lián)板中，各抽出10個(gè)微孔，測(cè)定0.45pg/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值(OD值)，重復(fù)3次，計(jì)算變異系數(shù)CV。/。，結(jié)果見表l。表1標(biāo)準(zhǔn)可重復(fù)性試驗(yàn)(0/%)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>cv%03批8.96.34.59.87.010.38.28.96.09.2CV%06批7.510.26.010.56.811.27.18.95.68.9CV%結(jié)果表明變異系數(shù)范圍在4.5%11.2%之間，符合了變異系數(shù)小于20%的規(guī)定，說明本試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品精密度達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)例2樣本可重復(fù)性試驗(yàn)以100ng/L，濃度的三聚氰胺對(duì)液態(tài)奶、奶粉和貓糧，添加到樣品中，分別取三個(gè)不同批次的試劑盒各五個(gè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表2、表3。表2液態(tài)奶、奶粉樣品可重復(fù)性試驗(yàn)批號(hào)實(shí)測(cè)值^g/L變異系數(shù)CV%卯8394889615.20182818690,579,914.080.886.790788110.7768285798816.103778776928712.4868479777916.185.92.70.80.58916.106887985878911.9909289888219.9表3貓糧樣品可重復(fù)實(shí)驗(yàn)批號(hào)實(shí)測(cè)值^g/L變異系數(shù)CV%88<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>結(jié)果表明液態(tài)奶、奶粉樣本變異系數(shù)均低于20%，貓糧樣本的變異系數(shù)均低于20%，符合了變異系數(shù)小于25%的規(guī)定，說明本試劑盒測(cè)定樣本的精密度達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)例3抗體的特異性特異性是指抗體對(duì)待測(cè)物的識(shí)別能力，強(qiáng)調(diào)抗體與待測(cè)物間結(jié)合反應(yīng)的專一性和對(duì)結(jié)構(gòu)相近或相關(guān)物質(zhì)的區(qū)分能力。特異性取決于待測(cè)物與其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)。在競(jìng)爭(zhēng)分析中，不同物質(zhì)的交叉反應(yīng)率可用如下公式計(jì)算交叉反應(yīng)率(％)=IC50(競(jìng)爭(zhēng)物)/IC50(待測(cè)物)*100化合物交叉反應(yīng)率(％)三聚氰胺100三聚氰酸<60%三嗪<1%三嗪二銨<1%實(shí)驗(yàn)例4試劑盒的準(zhǔn)確度試驗(yàn)取兩個(gè)濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為50pg/kg(L)和100pg/kg(L)，分別對(duì)樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，分別計(jì)算回收率。表4試劑盒的準(zhǔn)確度樣本液態(tài)奶貓糧<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>結(jié)果表明在液態(tài)奶中添加的回收率在80%~110%之間，貓糧中添加回收率在75%~95%之間。實(shí)驗(yàn)例5試劑盒保存條件為28t，經(jīng)過12個(gè)月的測(cè)定，試劑盒的最大吸光度值(零標(biāo)準(zhǔn))、50%抑制濃度、三聚氰胺添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]在運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37"C保存的條件下放置6天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒在28。C可以保存12個(gè)月以上。實(shí)驗(yàn)例6取兩個(gè)濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別為5(Hig/kg(L)和100pg/kg(L)，分別對(duì)樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪出曲線分別計(jì)算其回收率。標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是0ppb為2.043;20ppb為1.716;50ppb為1.231;勤ppb為0.765;200ppb為0.380;500ppb為0.134;樣本液吸光度值液態(tài)奶空白管為2.013;50ppb為1.314;1.352;1,406;1.245;100ppb為0.769;0.831;0.846;0.862;貓糧空白管為1.993;50ppb為1.344;1.452;1.306;1.275;100ppb為0.760;0.837;0.816;0.762;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。表5試劑盒的準(zhǔn)確度<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>結(jié)果表明在液態(tài)奶中添加的回收率在84%~100%之間，貓糧中添加回收率在78%96%之間。權(quán)利要求1.一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，它含有(1)包被三聚氰胺抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)三聚氰胺特異性抗體；(4)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液；試劑盒中三聚氰胺包被抗原是采用活潑酯法將三聚氰胺半抗原與牛丙種球蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的，抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，羊抗鼠抗抗體是以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫得到，羊抗兔抗抗體是以兔源抗體為免疫原對(duì)無病原體山羊進(jìn)行免疫得到。2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中酶標(biāo)記物為酶標(biāo)記抗抗體或酶標(biāo)記三聚氰胺抗原，所用酶為過氧化物酶或半乳糖甘酶；酶標(biāo)記物形式為凍干粉、濃縮液或工作液。3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，所用的酶為過氧化物酶。4.如權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中酶標(biāo)記三聚氰胺抗原是采用活性酯法將標(biāo)記酶與三聚氰胺半抗原進(jìn)行偶聯(lián)得到。5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中三聚氰胺特異性抗體為鼠源單克隆抗體或兔源多克隆抗體，免疫原是采用活潑酯法將三聚氰胺半抗原與鑰孔槭血藍(lán)蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到的；抗體形式為凍干粉、濃縮液或工作液；抗體稀釋液為pH值8.2、0.05mol/L、含有3體積％馬血清和5體積%。明膠的磷酸鹽緩沖液。6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中當(dāng)標(biāo)記酶為過氧化物酶時(shí)底物顯色液為過氧化氫、過氧化脲或四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽混合溶液、終止液為0.10.5mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為半乳糖甘酶時(shí)，底物顯色液為0.5mol/L磷酸鉀緩沖液，終止液為2mol/L的檸檬酸緩沖液；濃縮洗滌液為0.1體積％-0.5體積％吐溫80，0.5重量％疊氮化鈉防腐劑或磷酸緩沖液；濃縮復(fù)溶液為PBST緩沖液。7.如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，制備酶聯(lián)板過程中所用的包被緩沖液為pH值9.6、0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液；包被三聚氰胺抗原或抗抗體的載體物質(zhì)為聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯(lián)葡聚糖、玻璃、硅橡膠或瓊脂糖凝膠；載體的形式是試管、微量反應(yīng)板凹孔、小珠或小圓片；洗滌液為磷酸鹽緩沖液；封閉液是含有15體積％30體積％的馬血清和1體積％惰性蛋白的溶液。8.如權(quán)利要求1-3和5-7任一所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液為六個(gè)濃度梯度的三聚氰胺溶液，三聚氰胺濃縮復(fù)溶液為PBST緩沖液，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0pg/L、20嗎/L、50pg/L、100pg/L、200ng/L、500嗎/L，13ml/瓶。9.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是，試劑盒中三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液為六個(gè)濃度梯度的三聚氰胺溶液，三聚氰胺濃縮復(fù)溶液為PBST緩沖液，三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0pg/L、20pg/L、50pg/L、100|ig/L、200pg/L、500pg/L，13ml/瓶。10.—種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的方法，包括了以下步(1)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)三聚氰胺的酶聯(lián)免疫試劑及方法，酶聯(lián)免疫試劑含有(1)包被三聚氰胺抗原的酶聯(lián)板或包被抗抗體的酶聯(lián)板；(2)酶標(biāo)記物；(3)三聚氰胺特異性抗體；(4)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液；(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復(fù)溶液。利用酶聯(lián)免疫法(ELISA)研制的試劑盒可以快速檢測(cè)食品中的三聚氰胺，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)樣本量大等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/543GK101424685SQ20081020273公開日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日發(fā)明者俊唐,成李,宏楊,楊宗繁,溫俊梅,聶繼斌,譚彩蓮,欣齊申請(qǐng)人:深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司