專利名稱：三聚氰胺快速檢測試劑的制作方法
三聚氰胺快速檢測試劑技術(shù)領(lǐng)域三聚氰胺快速檢測試劑，應(yīng)用免疫學(xué)原理，通過膠體金的免疫反應(yīng)再借助 免疫層析技術(shù)達(dá)到檢測三聚氰胺目的，應(yīng)用于快速檢測鮮乳、乳制品、大豆制 品、飼料、嬰兒食品、寵物食品中的三聚氰胺。
技術(shù)背景由于三聚氰胺是一種化工原料，毒性輕微，大鼠口服的半數(shù)致死量大于3 克/公斤體重。據(jù)1945年的一個實驗報道將大劑量的三聚氰胺飼喂給大鼠、兔 和狗后沒有觀察到明顯的中毒現(xiàn)象。動物長期攝入三聚氰胺會造成生殖、泌尿 系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。1994年國際化學(xué)品安 全規(guī)劃署和歐洲聯(lián)盟委員會合編的《國際化學(xué)品安全手冊》第三巻和國際化學(xué) 品安全卡片也只說明長期或反復(fù)大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產(chǎn)生影響， 導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)石。然而，2007年美國寵物食品污染事件的初步調(diào)查結(jié)果認(rèn)為摻 雜了《6.6%三聚氰胺的小麥蛋白粉導(dǎo)致寵物食品中毒。動物實驗結(jié)果表明，其 在動物體內(nèi)代謝很快且不會存留，主要影響泌尿系統(tǒng)。三聚氰胺量劑和臨床疾 病之間存在明顯的量效關(guān)系。三聚氰胺在嬰兒體內(nèi)最大耐受量為每公斤奶粉15 毫克。專家對受污染嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行的風(fēng)險評估顯示，以體重7公斤的嬰 兒為例，假設(shè)每日攝入奶粉150克，其安全預(yù)值即最大耐受量為15毫克/公斤奶 粉。根據(jù)美國食物及藥物管理局的標(biāo)準(zhǔn)，三聚氰胺每日可容忍攝入量為每日0.63 毫克/公斤體重。由于食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測試方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人 用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，因此三聚氰胺也被人 稱為"蛋白精"。蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成。蛋白質(zhì)平均含氮量為16%左右，而 三聚氰胺的含氮量為66%左右。通用的蛋白質(zhì)測試方法"凱氏定氮法"是通過 測出含氮量來估算蛋白質(zhì)含量，因此，添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質(zhì)測試 含量偏高，從而使劣質(zhì)食品通過食品檢驗機(jī)構(gòu)的測試。有人估算在植物蛋白粉 和飼料中使測試蛋白質(zhì)含量增加一個百分點，用三聚氰胺的花費只有真實蛋白 原料的20%。三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，所以摻 雜后不易被發(fā)現(xiàn)。三聚氰胺含氮量為66.6%，是牛奶的151倍，是奶粉的23倍。 每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理論上就能提高0.625%蛋白質(zhì)。檢測方案 在現(xiàn)有奶粉檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)中，主要進(jìn)行蛋白質(zhì)、脂肪、細(xì)菌等檢測。三聚氰 胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，所以現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)不會包含相應(yīng)內(nèi)容。 亦即三聚氰胺檢測目前并無國家標(biāo)準(zhǔn)。牛奶和奶粉添加三聚氰胺，主要是因為 它能冒充蛋白質(zhì)。食品都是要按規(guī)定檢測蛋白質(zhì)含量的。要是蛋白質(zhì)不夠多， 說明牛奶兌水兌得太多，說明奶粉中有太多別的東西的粉。但是，蛋白質(zhì)太不 容易檢測，生化學(xué)家們就想出個間接的辦法因為蛋白質(zhì)是含氮的，所以只要 測出食品中的含氮量，就可以推算出其中的蛋白質(zhì)含量。因此添加過三聚氰胺的奶粉就很難檢測出其蛋白質(zhì)不合格了這就是三聚氰胺的假蛋白。目前檢測三聚氰胺的方法主要有3種，高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜質(zhì) 譜聯(lián)用法(GC-MS)和酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。存在的主要問題是設(shè)備投入大， 操作時間長，專業(yè)要求高，不適合現(xiàn)場快速檢測的要求，不適合大批量樣品檢 測的要求。 發(fā)明內(nèi)容三聚氰胺快速檢測試劑，應(yīng)用免疫學(xué)原理，通過膠體金的免疫反應(yīng)再借助免 疫層析技術(shù)達(dá)到檢測三聚氰胺目的，具有檢測過程快速，操作方便，檢測成本 低等明顯優(yōu)點。本發(fā)明方法是通過以下技術(shù)方案和工作原理實現(xiàn)的。特異性抗體(三聚氰胺 抗體)標(biāo)記在指示劑顆粒上，標(biāo)記物附著在聚酯膜上；將相應(yīng)完全抗原(三聚 氰胺-BSA結(jié)合物)包被并固定層析膜的檢測區(qū)(T)上，層析膜粘貼在底板上， 始端有供加樣用的樣品處理部分，末端有供助層析用的濾紙組成試條，或?qū)⒃?條鑲嵌入塑卡中，組成試劑。檢測時，由于被測樣本中相應(yīng)抗原(三聚氰胺)和復(fù) 溶的金標(biāo)記抗體發(fā)生了免疫反應(yīng)，此時混合液層析到檢測區(qū)上時包被抗原無法 競爭到標(biāo)記抗體，檢測區(qū)內(nèi)沒有出現(xiàn)反應(yīng)線，即陽性，相反如被測樣本沒有被 測抗原(三聚氰胺)，則標(biāo)記的抗體層析到檢測區(qū)時和包被膜上的抗原結(jié)合形成 紫紅線，即陰性。為了證明試劑有效性和易判讀，分別在質(zhì)控區(qū)(C)包被羊抗 兔IgG為質(zhì)控線，所以不管結(jié)果怎樣質(zhì)控線C始終出現(xiàn)。三聚氰胺快速檢測試劑，由下列部分組成層析膜、含指示劑顆粒的聚酯膜、 樣品處理部分、濾紙和底板，檢測鮮乳、乳制品、大豆制品、飼料、嬰兒食品、 寵物食品中的三聚氰胺。


附圖1是本發(fā)明實施例的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1.硝酸纖維素膜、2.濾紙、3.樣品處理部分、4.底板、5.含膠體金顆 粒的聚酯膜、6.試劑外殼。附圖2是本發(fā)明實施例的陽性結(jié)果示意圖。附圖3是本發(fā)明實施例的陰性結(jié)果示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。 實施例，三聚氰胺快速檢測試劑盒。在圖1中，包被有三聚氰胺-BSA結(jié)合物的硝酸纖維素膜(1)粘貼在底板 (4)中間，其頂端粘貼有濾紙(2)，其底端粘貼樣品處理部分(3)。標(biāo)記的抗 三聚氰胺的抗體膠體金顆粒附著在聚酯膜上(5)。粘貼有硝酸纖維素膜(1)、 吸水紙(2)和濾樣墊玻纖(3)的底板(4)放置在試劑外殼(6)，試劑外殼(6) 蓋緊。1.將一定濃度的三聚氰胺-BSA結(jié)合物和羊抗兔IgG包被于硝酸纖維素膜上 的檢測線和控制線的位置。2. 將制得的硝酸纖維素膜與樣品處理部分、濾紙一起依次粘貼在底板上。3. 將此底板裝配在試劑外殼底內(nèi)，合上試劑外殼蓋組裝而成。4. 抗三聚氰胺抗體標(biāo)記膠體金制備用檸檬酸三鈉還原四氯化金制備粒徑 40 60nm膠體金，調(diào)節(jié)pH后每毫升膠體金和10-15 ug抗三聚氰胺抗體混合進(jìn) 行標(biāo)記并在450nm下測OD。5. 將10-20ul的2-3 OD抗三聚氰胺抗體標(biāo)記的膠體金加到聚酯膜上并烘 干，聚酯膜上即附著上經(jīng)標(biāo)記的膠體金顆粒。6. 檢測步驟a. 吸取一定量的牛奶7000rpm離心脫脂，即得待檢樣品。b. 取出試劑盒，平放在桌面上。c. 用吸管吸取混合均勻的樣品，滴加2-3滴于加樣孔中，并開始計時。d. 在5分鐘內(nèi)讀取結(jié)果。e. 結(jié)果判定圖2為陽性結(jié)果(控制線C位置出現(xiàn)紅色線條，而檢測線T 位置不顯示紅色線條時，判為陽性)；圖3為陰性結(jié)果(檢測線T位置出現(xiàn)紅色 線條，控制線C位置也出現(xiàn)紅色線條，判為陰性)。7. 性能指標(biāo)靈敏度應(yīng)用本實施例，三聚氰胺濃度在1000ng/ml以上為陽性。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員無須過多實驗即可對本發(fā) 明所要求保護(hù)的內(nèi)容進(jìn)行實施，并達(dá)到預(yù)期效果。本發(fā)明公開的實施例僅是對 本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但并不是構(gòu)成對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員 用相似替代物或改造，或用某些在化學(xué)相似的試劑替代在此描述的試劑，如用 彩色乳膠代替膠體金，或?qū)Ρ景l(fā)明的有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行變動，但不超出本發(fā)明的精 神、范圍和思想，均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.三聚氰胺快速檢測試劑，其特征是，采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析技術(shù)，通過抗體競爭結(jié)合三聚氰胺-BSA偶聯(lián)物和樣品中可能含有的三聚氰胺的原理，達(dá)到快速檢測樣品中的三聚氰胺。
2. 三聚氰胺快速檢測試劑，其特征是，檢測試劑由下列部分組成層析膜、含 指示劑顆粒的聚酯膜、樣品處理部分、濾紙和底板。
3. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑，其特征是，層析膜是硝酸纖維素膜、醋酸纖維 素膜中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑，其特征是，指示劑顆粒是膠體金顆粒、膠體銀 顆粒、熒光顆粒、磁性顆粒中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑，其特征是，樣品處理部分是玻璃纖維、聚酯膜、 玻璃纖維加聚酯膜、玻璃纖維加濾紙、聚酯膜加濾紙、玻璃纖維加聚酯膜加 濾紙中的——禾中。
6. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑，其特征是將羊抗兔和兔抗包被并固定層析膜上。
7. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑，其特征是，含指示劑顆粒的聚酯膜是將抗三聚 氰胺抗體標(biāo)記的膠體金顆粒均勻分布后的聚酯膜。
8. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑，其特征是樣品處理部分用緩沖液處理過用于調(diào) 整樣品pH值。
9. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑，其特征是，檢測的樣品是鮮乳、乳制品、大豆 制品、飼料、嬰兒食品、寵物食品中的一種。
全文摘要
三聚氰胺快速檢測試劑采用高度特異性的抗體抗原反應(yīng)及免疫層析技術(shù)，達(dá)到快速檢測樣品中的三聚氰胺之目的。本試劑具有操作簡便和快速等優(yōu)點，應(yīng)用于養(yǎng)殖、飼養(yǎng)、牧業(yè)、食品加工等生產(chǎn)領(lǐng)域現(xiàn)場快速檢測食品和飼料中的三聚氰胺，也為家庭食品安檢提供了簡便手段。
文檔編號G01N33/544GK101403756SQ20081020260
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日
發(fā)明者吉 馮, 杜森垚, 王學(xué)生, 琳 顧 申請人:上海快靈生物科技有限公司