專利名稱：亞氨基二乙酸的液相分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及亞氨基二乙酸的液相分析方法。(二) 背景技術(shù)亞氨基二乙酸(IDA)是一種比較重要的化工原料，常用作絡(luò)合劑和 表面活性劑，常用于用于有機(jī)合成，也是草甘膦(Glyphosate)生產(chǎn)的重 要中間體。目前亞氨基二乙酸常用的分析方法有堿直接滴定法，離子交換樹脂 法，紫外分光光度法和色譜法。由于亞氨基二乙酸是有機(jī)二元酸，采用堿 直接滴定法測(cè)定的是樣品中所有酸(包括單酸)的含量，準(zhǔn)確度比較差； 離子交換樹脂法由于分離、洗脫程度難掌握，所以結(jié)果的重現(xiàn)性比較差； 紫外分光光度法需要鐵明礬與IDA先生成配合物再進(jìn)行檢測(cè)，方法比較 繁瑣；亞氨基二乙酸本身沒(méi)有紫外吸收基團(tuán)，常規(guī)的液相方法只能在 210nm下進(jìn)行檢測(cè)，受到的末端吸收的干擾比較大。(三) 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服常規(guī)液相末端吸收干擾的缺陷，提供一種吸收 干擾小、靈敏度高的亞氨基二乙酸液相分析方法。 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是亞氨基二乙酸的液相分析方法，所述方法包括(1)配制不同濃度 的亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各自加入足量2,4-二硝基氟苯于進(jìn)行反應(yīng)，反 應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行液相色譜分析，以DNB-亞氨基二乙酸峰面積對(duì)應(yīng) 二乙酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)取含有亞氨基二乙酸的待測(cè)溶液，加入
足量2,4-二硝基氟苯進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行液相色譜分析，根據(jù)DNB-亞氨基二乙酸的峰面積，對(duì)照步驟(1)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)溶液的亞氨基二乙酸濃度數(shù)據(jù)。本發(fā)明對(duì)亞氨基二乙酸進(jìn)行衍生化,在其氨基上引入二硝基苯基團(tuán)增加吸收波長(zhǎng)，其反應(yīng)原理如下式所示進(jìn)一步，所述方法如下(1) 配制不同濃度的亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各自加入足量2,4-二硝 基氟苯于40~70°C、避光條件下反應(yīng)20 40min,反應(yīng)結(jié)束后對(duì) 反應(yīng)液進(jìn)行液相色譜分析，以DNB-亞氨基二乙酸峰面積為縱坐 標(biāo)、亞氨基二乙酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2) 取含有亞氨基二乙酸的待測(cè)溶液，加入足量2,4-二硝基氟苯于 40 70°C、避光條件下反應(yīng)20 40min,反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行 液相色譜分析，根據(jù)待測(cè)DNB-亞氨基二乙酸的峰面積，對(duì)照步 驟(1)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)溶液的亞氨基二乙酸濃度數(shù) 據(jù)。優(yōu)選的，所述方法如下 (1)配制不同濃度的亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取l體積份的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 各自加入10體積份的0.1 ~ lmol/L的NaHC03溶液、4體積份的體 積濃度1~10%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液和10體積份的蒸餾水， 在40 70。C下避光反應(yīng)20~40min后，再加75體積份的0.1 ~ 0.5mol/L、 pH為6~8的磷酸鹽緩沖液，得到的混合液進(jìn)行液相色HOOCH CCH COOH
譜分析，以DNB-亞氨基二乙酸峰面積為縱坐標(biāo)、亞氨基二乙酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)取含有亞氨基二乙酸的待測(cè)溶液1體積份，加入10體積份的0.1 ~lmol/L的NaHC03溶液、4體積份的體積濃度1 10%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液和10體積份的蒸餾水，在40 ~ 70。C下避光反應(yīng)20 ~40min后，再加75體積份的0.1 ~ 0.5mol/L、 pH為6 ~ 8的磷酸鹽緩沖液，得到的混合液進(jìn)行液相色譜分析，根據(jù)待測(cè)DNB-亞氨基二乙酸的峰面積，對(duì)照步驟(1 )獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)溶液的亞氨基二乙酸濃度數(shù)據(jù)。 為保證所測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在一個(gè)完整的從標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制到待測(cè)溶液濃度測(cè)定的過(guò)程中，對(duì)于不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液，其測(cè)定過(guò)程中 各步驟參數(shù)應(yīng)完全相同。所測(cè)待測(cè)溶液濃度需在所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)，測(cè)得數(shù)據(jù)才是準(zhǔn) 確的，若待測(cè)溶液濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度范圍，則有可能不符合其線性 關(guān)系，此時(shí)可將待測(cè)溶液稀釋或者濃縮之后進(jìn)行^r測(cè)，直至所測(cè)得濃度在 標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)為止。本發(fā)明采用的方案是1、 衍生化試劑的配置取1 ~ 10mL 2,4-二硝基氟苯溶于乙腈中配成100 mL溶液。2、 書f生化反應(yīng)取0.1 ~ 0.5 mL樣品，加0.5 ~ 2mL 0.1 ~ lmol/L的NaHC03溶液、 O.l-lmL配好的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液和0.5~2mL蒸餾水，在 40 ~ 70。C下避光反應(yīng)20 ~ 40min后，再加5 ~ 20mL 0.1 ~ 0.5mol/L pH 為6 — 8的碌酸緩沖液。3、 色譜條件色i普柱Elite C18色i普片主(250nm x 4.6 nm);流動(dòng)相甲醇乙酸-乙酸鈉水溶液(曱醇與乙酸-乙酸鈉水溶液 體積比為55: 45,乙酸、乙酸鈉物質(zhì)的量濃度均為0.05mol/L);流 速0.5 ~ 1.5mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為300 ~ 400nm;柱溫20~40°C;4、 本發(fā)明的儀器設(shè)備曰本島津公司10A vp液相色譜配置SPD-10A紫外檢測(cè)器以及 分析儀器配備的HPLC色譜工作站； 本發(fā)明原材料規(guī)格如下 曱醇、乙腈(色譜純) 2,4-二硝基氟苯、乙酸、乙酸鈉(分析純) 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度 高，可用于生物催化水解亞氨基二乙腈生產(chǎn)草甘膦中間體亞氨基二乙酸的 產(chǎn)物分析，也還可以用于其他亞氨基二乙酸生產(chǎn)過(guò)程的分析。(四)


圖1為亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2為衍生后得到的DNB-亞氨基二乙酸以及衍生化試劑的色譜峰。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不僅限于此實(shí)施例1:亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精確配制2、 4、 6、 8、 10mg/mL的亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)液O.lmL各自加入l.OmL lmol/L的NaHC03溶液、0.4mL配好的2，4-二 硝基氟苯乙腈溶液(體積濃度6% )和l.OmL蒸餾水，在60。C下避光反應(yīng) 30min后，再力口 7.5mL 0.2mol/L pH為7.0的磷酸鹽緩沖液，用針頭過(guò)濾 器過(guò)濾，取濾液按所選的色譜條件Elite Cl8色譜柱，流動(dòng)相曱醇 O.05mol/L乙酸-乙酸鈉溶液(曱醇與乙酸-乙酸鈉溶液體積比55: 45), 流速1.0mL/min,進(jìn)樣10 |i L進(jìn)行液相色譜分析。以DNB-亞氨基二乙 酸峰面積為自變量，亞氨基二乙酸濃度(mg/mL)為應(yīng)變量，得到標(biāo)準(zhǔn)曲 線形圖如圖1所示，其線形R"直為0.9990,色譜圖如圖2所示。實(shí)施例2:亞氨基二乙酸樣品濃度確定準(zhǔn)確稱取0.5008g亞氨基二乙酸樣品溶解于lOOmL水中，取該樣品 0.2mL采用2mL lmol/L的NaHC03溶液、0.8mL配好的2,4-二硝基氟苯 乙腈溶液(體積濃度1% )和2mL蒸餾水，在70°C下避光反應(yīng)40min后， 再加15mL 0.2mol/L pH為7.5的磷酸緩沖液。用針頭過(guò)濾器過(guò)濾。按所 選的色譜條件Elite C18色譜柱，流動(dòng)相曱醇0.05mol/L乙酸-乙酸 鈉溶液(曱醇與乙酸-乙酸鈉溶液體積比55: 45 )，流速0.8mL/min。 進(jìn)樣10pL進(jìn)行液相色譜分析，測(cè)得亞氨基二乙酸的濃度為0.5001%。實(shí)施例3:生物轉(zhuǎn)化6h后轉(zhuǎn)化液中亞氨基二乙酸樣品濃度確定配制種子培養(yǎng)基醋酸銨1%,酵母膏0.5%, K2HPO40.5%, MgS04 0.02%, FeS04 0.003%， NaCl 0.1%,用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH 調(diào)節(jié)到7.5。配制發(fā)酵培養(yǎng)基醋@吏銨1%,酵母膏0.5%, K2HPO40.5%， MgS04 0.02%, FeS04 0.003%, NaC10.1%，用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH
調(diào)節(jié)到7.5。上述培養(yǎng)基組成以質(zhì)量體積百分比表示，某物質(zhì)濃度1%表示100mL 培養(yǎng)基中含有l(wèi)g該物質(zhì)。在5L種子罐中裝入3L的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入糞產(chǎn)堿桿菌 (1咖證/臟幽)CCTCCNo: M 208168菌種菌液(該菌種已作為 新菌種另案申請(qǐng))，接種量5。/。(v/v)，在溫度30。C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm的 條件下培養(yǎng)24h,得到種子液；在50L的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基30L,實(shí)罐消毒后接入1.8L的種 子液，在通氣比0.3: 1 (每分鐘內(nèi)通過(guò)的空氣體積與培養(yǎng)液體積之比)， 攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,罐壓0.05Mpa,溫度30。C的條件下，在培養(yǎng)到lh時(shí)開 始時(shí)加入90g的正丁腈作為誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)到6h時(shí)，將轉(zhuǎn)化液離心取上清 液0.15mL采用1.5mL lmol/L的NaHC03溶液、0.6mL配好的2,4-二硝基 氟苯乙腈溶液(體積濃度2% )和1.5mL蒸餾水，在70。C下避光反應(yīng)40min 后，再加11.25mL0.2mol/LpH為7.5的磷酸緩沖液。用針頭過(guò)濾器過(guò)濾。 按所選的色譜條件Elite C18色譜柱，流動(dòng)相曱醇0.05mol/L乙酸-乙酸鈉溶液(曱醇與乙酸-乙酸鈉溶液體積比55: 45 ),流速1.2mL/min。 進(jìn)樣10fiL進(jìn)行液相色譜分析，測(cè)得亞氨基二乙酸的濃度為0.6845%。實(shí)施例4:生物轉(zhuǎn)化3h后轉(zhuǎn)化液中亞氨基二乙酸樣品濃度確定。配制種子培養(yǎng)基醋酸銨1%,酵母膏0.5%, K2HPO40.5%, MgS04 0.02%， FeS04 0.003%， NaCl 0.1%,用2M的鹽酸或2M的氪氧化鈉將pH 調(diào)節(jié)到7.5。配制發(fā)酵培養(yǎng)基醋酸4妄1%,酵母膏0.5%, K2HPO40.5%， MgS04 0.02%, FeS04 0.003%, NaC10.1%,用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH
調(diào)節(jié)到7.5。上述培養(yǎng)基組成以質(zhì)量體積百分比表示，某物質(zhì)濃度1%表示100mL 培養(yǎng)基中含有l(wèi)g該物質(zhì)。在5L種子罐中裝入3L的種子培養(yǎng)基，滅菌后接入糞產(chǎn)堿桿菌 U/ca//ge"^/aec"/z;y )CCTCC No: M 208168菌種菌液，接種量5%( v/v )， 在溫度30。C,攪拌轉(zhuǎn)速200rpm的條件下培養(yǎng)24h，得到種子液；在50L的發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基30L，實(shí)罐消毒后接入1.8L的種 子液，在通氣比0.3: 1，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm,罐壓0.05Mpa,溫度30。C的 條件下，在培養(yǎng)到lh時(shí)開始時(shí)加入90g的正丁腈作為誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)到3h 時(shí)，將轉(zhuǎn)化液離心取上清液O.lmL采用l.OmL lmol/L的NaHC03溶液、 0.4mL配好的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液(體積濃度3% )和l.OmL蒸餾水， 在60。C下避光反應(yīng)-30min后，再加7.5mL 0.2mol/L pH為7.0的磷酸緩沖 液。用針頭過(guò)濾器過(guò)濾。按所選的色譜條件Elite C18色譜柱，流動(dòng)相 曱醇0.05mol/L乙酸-乙酸鈉溶液(曱醇與乙酸-乙酸鈉溶液體積比55: 45),流速1.0mL/min。進(jìn)樣20pL進(jìn)行液相色譜分析，測(cè)得亞氨基二 乙酸的濃度為0.3775%。
權(quán)利要求
1. 亞氨基二乙酸的液相分析方法，所述方法包括(1)配制不同濃度的亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各自加入足量2，4-二硝基氟苯于進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行液相色譜分析，以DNB-亞氨基二乙酸峰面積對(duì)應(yīng)亞氨基二乙酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)取含有亞氨基二乙酸的待測(cè)溶液，加入足量2，4-二硝基氟苯進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行液相色譜分析，根據(jù)DNB-亞氨基二乙酸的峰面積，對(duì)照步驟(1)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)溶液的亞氨基二乙酸濃度數(shù)據(jù)。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 配制不同濃度的亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，各自加入足量2,4-二硝 基氟苯于40 70。C、避光條件下反應(yīng)20 40min,反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反 應(yīng)液進(jìn)行液相色譜分析，以DNB-亞氨基二乙酸峰面積為縱坐標(biāo)、 亞氨基二乙酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2) 取含有亞氨基二乙酸的待測(cè)溶液，加入足量2,4-二硝基氟苯于 40 70°C、避光條件下反應(yīng)20 40min,反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行 液相色譜分析，根據(jù)待測(cè)DNB-亞氨基二乙酸的峰面積，對(duì)照步 驟(1)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得待測(cè)溶液的亞氨基二乙酸濃度數(shù) 據(jù)。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下(1 )配制不同濃度的亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1體積份的標(biāo)準(zhǔn)溶液， 各自加入10體積份的0.1 ~ lmol/L的NaHC03溶液、4體積份的 體積濃度1 10%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液和10體積份的蒸餾 水，在40 ~ 70。C下避光反應(yīng)20 ~ 40min后，再加75體積份的0.1 ~ 0.5mol/L、 pH為6-8的磷酸鹽緩沖液，得到的混合液進(jìn)行液相色譜分析，以DNB-亞氨基二乙酸峰面積為縱坐標(biāo)、亞氨基二乙 酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2)取含有亞氨基二乙酸的待測(cè)溶液1體積份，加入10體積份的0.1 ~ lmol/L的NaHC03溶液、4體積份的體積濃度1 10%的2,4-二硝 基氟苯乙腈溶液和10體積份的蒸餾水，在40 ~ 70°C下避光反應(yīng) 20 ~ 40min后，再加75體積份的0.1 ~ 0.5mol/L、 pH為6 ~ 8的 磷酸鹽緩沖液，得到的混合液進(jìn)行液相色譜分析，根據(jù)待測(cè)DNB-亞氨基二乙酸的峰面積，對(duì)照步驟(1)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得 待測(cè)溶液的亞氨基二乙酸濃度數(shù)據(jù)。 4.如權(quán)利要求1 3之一所述的方法，其特征在于所述液相色譜條件如下色i普柱Elite Cl8色譜柱；流動(dòng)相曱醇乙酸-乙酸鈉i^液；流速0.5 ~ 1.5mL/min; 4企測(cè)波長(zhǎng)為300 ~ 400nm;柱溫20~40°C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種亞氨基二乙酸的液相分析方法，所述方法包括(1)配制不同濃度的亞氨基二乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入足量2，4-二硝基氟苯于進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行液相色譜分析，以DNB-亞氨基二乙酸峰面積對(duì)應(yīng)亞氨基二乙酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)取含有亞氨基二乙酸的待測(cè)溶液，加入足量2，4-二硝基氟苯進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行液相色譜分析，根據(jù)DNB-亞氨基二乙酸的峰面積，對(duì)照步驟(1)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)溶液的亞氨基二乙酸濃度數(shù)據(jù)。本發(fā)明方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高，可用于生物催化水解亞氨基二乙腈生產(chǎn)草甘膦中間體亞氨基二乙酸的產(chǎn)物分析，也還可以用于其他亞氨基二乙酸生產(chǎn)過(guò)程的分析。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101398413SQ200810122190
公開日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月10日
發(fā)明者徐建妙, 柳志強(qiáng), 沈寅初, 鄭裕國(guó) 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)