專利名稱：：測定食品中蘇丹紅1號的單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種測定食品中蘇丹紅1號含量的單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)，屬于食品安全監(jiān)督或食品分析的研究領(lǐng)域。二
背景技術(shù)：
：蘇丹紅屬于一類人工合成的偶氮類化合物，為紅色油溶性染料，主要用于石油、機油和其他的一些工業(yè)溶劑中，目的是使其增色，也方用于鞋、地板等的增光。蘇丹紅染料包括蘇丹紅l-4號四種物質(zhì)，均含偶氮及萘的化合物結(jié)構(gòu)，對人體的肝腎器官有明顯的毒性作用，具有致癌性。由于蘇丹紅價格低廉且不容易褪色，因此被一些不法商家用于食品染色，對人體健康造成較大威脅。我國及其他許多國家都禁止將其用于食品生產(chǎn)。2007年初，國家質(zhì)檢總局公布了辣椒粉、辣椒醬、油辣椒、豆瓣醬等預包裝辣椒制品和散裝辣椒粉的產(chǎn)品質(zhì)量調(diào)査結(jié)果，結(jié)果顯示，不合格項目全部集中在蘇丹紅l-4號，尤其是蘇丹紅l號。檢測蘇丹紅的方法主要是高效液相色譜法(HPLC)，歐盟的標準方法(Eur叩eanCommission.NEWSnotification:03/99:CorrectedmethodforthedetectionofSudan.2005)是將檢測物經(jīng)過乙腈萃取，過濾，濾液用高效液相色譜法分析，以波長可變的紫外-可見光度檢測器定性與定量，確證蘇丹紅可以使用液相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。我國質(zhì)檢總局發(fā)布的國家標準(GB/T19681-2005)，采用正相吸附和固相萃取原理，對蘇丹紅染料用高效液相色譜進行了檢測。目前，還報道了一些與高效液相色譜聯(lián)用的技術(shù)，均可以用于蘇丹紅的檢測。但是色譜法儀器昂貴、樣品預處理復雜、費時、檢測成本高。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)具有靈敏度高、特異性強、分析快速的優(yōu)點，常被用于臨床、藥物、食品和環(huán)境等分析領(lǐng)域。本發(fā)明者以多克隆抗體為基礎的測定食品中蘇丹紅1號含量的酶聯(lián)免疫吸附分析法已申請中國專利，200710049361.5,但多克隆抗體存在一些不足，如與待測物的免疫親和力不一致，抗體的總量有限，不能源源不斷提供性能相同的抗體等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種測定食品中蘇丹紅1號含量的單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特點是以單克隆抗體和抗原與抗體之間特異性反應為基礎而建立的分析方法。本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說明外均為重量份數(shù)。測定食品中蘇丹紅1號含量的單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附分析方法(1)蘇丹紅l號修飾物的制備步驟1:將0.02~0.08mol丙二酸溶于20~80mL新蒸吡啶中，加入0.02-0.lmol對硝基肉桂酸和0.001~0.004mol醋酸胺，此混合物在溫度100150'C回流1~7小時，冷卻后，將反應物用醋酸重結(jié)晶，得到產(chǎn)物410g,熔程275~280°C;步驟2:將步驟1產(chǎn)物0.150.65g，5-35mg鈀碳，2~15mL甲醇加入反應釜中，通入氫氣，于溫度100120'C反應15小時，過濾反應物，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶液，用二氯甲垸甲醇=5:l的體積比過柱，收集TLC板實驗中Rf值為0.3的產(chǎn)物，旋干溶液，得到乳白色固體；步驟3:將步驟2產(chǎn)物0.lg溶解在1.52.5mL濃鹽酸中，在溫度51(TC加入含0.01~0.06g亞硝酸鈉的水溶液0.5mL，攪拌數(shù)分鐘，得到淡黃色重氮鹽溶液，將0.040.12g2-萘酚溶解于812n/。的氫氧化鈉水溶液35mL中，冷卻至5'C，再緩慢加入重氮鹽溶液，得到0.120.30g蘇丹紅l號-3-丙酸，簡寫為Sudanl-C3，其反應式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(E)-3-(4-nitrophenyl)acrylicacid3-(4-aminophenyl)propanoicacid(2)免疫原和包被抗原的制備將0.10~0.45mmol的Sudanl-C3，0.10-0.80mmol的二環(huán)己基碳二亞胺，0.10~0.80mmol的N-羥基琥珀酰亞胺，溶解于100~60(HiL的二甲基甲酰胺，室溫攪拌過夜，將混合物離心520分鐘，取上層清液，緩慢加入0.01~0.02%的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)，攪拌110小時，離心分離，取上層清液，透析數(shù)天，其中，Sudan1-C3-BSA為免疫原，Sudan1-C3-OVA為包被抗原；(3)蘇丹紅1號單克隆抗體的制備免疫將免疫原溶解于生理鹽水中，再與等體積的完全福氏佐劑混合，皮下多點免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原劑量在50-100嗎，第一次免疫后，每隔兩周再次免疫，將完全福氏佐劑換成不完全福氏佐劑，第三次免疫后一周，尾部取血測鼠的抗血清效價，最后一次腹腔加強免疫，不加佐劑；融合最后一次對小鼠加強免疫，三天后取脾細胞，將脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按5:110:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，雜交瘤細胞用HAT培養(yǎng)液混懸，加入預先含有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板，置于溫度37'C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；篩選融合后2周，用間接ELISA法篩選，將陰性孔無色或接近無色，而陽性孔明確顯色的細胞用有限稀釋法進行亞克隆2-3次，及時進行檢測；單克隆抗體的大量生產(chǎn)先腹腔注射液體石蠟于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接種雜交瘤細胞，觀察小鼠腹水情況，待腹水盡可能多，瀕于死亡之前，收集腹水，用硫酸銨沉淀法純化腹水中的單克隆抗體，純化抗體與等體積甘油1:1混合并置于溫度-20'C保存；(4)建立基于單克隆抗體測定蘇丹紅1號的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)對所得單克隆抗體性能進行表征，在最優(yōu)試驗條件下，建立測定食品中蘇丹紅l號含量的ELISA。本發(fā)明的優(yōu)點1.對蘇丹紅1號的分子結(jié)進行合理修飾。2.成功制備出抗蘇丹紅1號的單克隆抗體并建立測定食品中蘇丹紅1號含量的ELISA。3.靈敏度高、特異性強。4.樣品處理簡單、測試量大、測試費用低。5.對樣品的測定，ELISA與HPLC有很好的相關(guān)性。7四圖l.為免疫原的紫外-可見光譜圖a.BSA;b.Sudan1號；c.SudanI—C3—BSA由圖1得知，在280nm(BSA)，320nm和492nm處(Sudan1號)均有特征吸收，表明蘇丹紅l號已成功與蛋白交聯(lián)。圖2.為測定蘇丹紅1號的ELISA標準曲線由圖2得知，9次ELISA測定的平均標準曲線，IC5。值(標準曲線中吸光度降低50%所對應的蘇丹紅1號的濃度，IC5。值越小，靈敏度越高)為1.l~2.0ng/mL,檢出限(LOD)為0.07~0.14ng/mL.圖3.為有機溶劑甲醇和乙腈對ELISA靈敏度(ICs。)的影響由圖3得知，10%以下的乙腈和30%以下的甲醇對免疫測定影響較小，表明抗體對有機溶劑的耐受性較好。圖4.為ELISA和HPLC對9個加標樣品中蘇丹紅1號的檢測結(jié)果的相關(guān)曲線由圖4得知，兩種方法相關(guān)性較好，回歸方程為Y=0.8492X+0.3525(r=0.9840,n=9)，五具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述.，有必要在此指出的是本實施只用于對發(fā)明進行進一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。實施例1.蘇丹紅l號修飾物的制備蘇丹紅1號是小分子化合物，沒有免疫原性，不能直接免疫動物產(chǎn)生抗體，必須對蘇丹紅1號的分子結(jié)構(gòu)進行合理、有效的化學修飾。一般要求盡量保持小分子化合物的原有結(jié)構(gòu)，但要在小分子化合物的某個位置上連上一個3-5個碳原子的手臂，且在手臂的終瑞帶有活性基團，使之與載體蛋白交聯(lián)，制得免疫原和包被抗原。本發(fā)明在蘇丹紅1號苯環(huán)上與偶氮基相對的位置連接上一個終端帶羧基3個碳原子的手臂。蘇丹紅1號修飾物的制備步驟1:將0.02-0.08mol丙二酸溶于20~80mL新蒸吡啶中，加入0.02~0.1mol對硝基肉桂酸和0.001~0.004mol醋酸胺，此混合物在溫度100150'C回流1~7小時，冷卻后，將反應物用醋酸重結(jié)晶，得到產(chǎn)物410g，熔程275~280°C;步驟2:將步驟1產(chǎn)物0.15~0.65g，5-35mg鈀碳，2~15mL甲醇加入反應釜中，通入氫氣，于溫度100120'C反應15小時，過濾反應物，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶液，用二氯甲烷甲醇=5:1的體積比過柱，收集TLC板實驗中Rf值為0.3的產(chǎn)物，旋干溶液，得到乳白色固體；步驟3:將步驟2產(chǎn)物0.lg溶解在1.5~2.5mL濃鹽酸中，在溫度51(TC加入含0.01-0.06g亞硝酸鈉的水溶液0.5mL，攪拌數(shù)分鐘，得到淡黃色重氮鹽溶液，將0.040.12g2-萘酚溶解于812。/。的氫氧化鈉溶液35mL中，冷卻至5'C，再緩慢加入重氮鹽溶液中，得到0.12~0.30gSudanl-C3。Sudanl-C3的表征^-NMR用BrukerAMX-300核磁共振儀測試SudanI-C3的核磁譜，以氘代氯仿溶液為溶劑，內(nèi)標為TMS。'H-畫R(200MHz,CDC13):S14.30(b，1H)，8.55(d,J=4.2Hz,1H)，7.73-7.50(m，4H),7.41-7.14(m，4H)，6.89(d,J=3.96,1H),3.45(b,1H)，3.05(t，J=7.50Hz，2H),2.76(t,J=7.46Hz，2H)。6.8~8.0之間的峰表明物質(zhì)結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)和萘環(huán)；3.0以下的峰表示有脂肪族烷烴結(jié)構(gòu)，有兩個峰，表明有兩種不同的氫，譜圖信息符合目標產(chǎn)物Sudanl-C3結(jié)構(gòu)；2.免疫原和包被抗原的制備帶有活性基團的蘇丹紅1號修飾物與載體蛋白交聯(lián)，形成蘇丹紅1號-載體蛋白結(jié)合物，用作免疫原和包被抗原稱取0.10-0.45mmo1的Sudanl-C3，0.10-0.80mmol的二環(huán)己基碳二亞胺，0.10-0.80mmol的N-羥基琥珀酰亞胺，溶于100-600^的二甲基甲酰胺，室溫下攪拌過夜，將混合物離心5-20分鐘，取上層清液，緩慢加入0.01-0.02%的牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA),攪拌1-10小時，離心分離，取上層清液，透析數(shù)天，其中，SudanI-C3-BSA為免疫原，SudanI-C3-0VA為包被抗原。圖1為BSA、Sudan1號和Sudanl-C3-BSA的紫外-可見光譜圖，a.BSA;b.Sudan1號；c.SudanI~C3-BSA;包被抗原Sudanl-C3-0VA的紫外-可見光譜圖與圖1相似。3.蘇丹紅1號單克隆抗體的制備免疫將免疫原溶于生理鹽水中，再與等體積的完全福氏佐劑混合，皮下多點免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原劑量在50100嗎，第一次免疫后，每隔兩周再次免疫，將完全福氏佐劑換成不完全福氏佐劑，第三次免疫后一周，尾部取血測鼠的抗血清效價，最后一次腹腔加強免疫，不加佐劑。融合最后一次對小鼠加強免疫，三天后取脾細胞，將脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)按5:110:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，雜交瘤細胞用HAT培養(yǎng)液混懸，加入預先含有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板，置于37'C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。篩選融合后2周左右，用間接ELISA法篩選，將陰性孔無色或接近無色，而陽性孔明確顯色的細胞用有限稀釋法進行亞克隆2-3次，及時進行檢測。單克隆抗體的大量生產(chǎn)先腹腔注射液體石蠟于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接種雜交瘤細胞，觀察小鼠腹水情況，待腹水盡可能多，瀕于死亡之前，收集腹水。用硫酸銨沉淀法純化腹水中的單克隆抗體，純化抗體與等體積甘油1:1混合并置于-2(TC保存。4.優(yōu)化實驗條件，建立測定蘇丹紅1號的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)對所得抗體性能進行表征，在最優(yōu)試驗條件下，建立測定食品中蘇丹紅1號含量的ELISA。(1)溶液配制(a)碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液稱取2.606gNa2CO310H20,3.434gNaHC03,用800mL超純水混勻溶解后，調(diào)節(jié)pH值，加水至1L，配成0.05mol/L，pH=9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液；(b)磷酸緩沖液(儲備液，PBSX10)稱取21.961gNa2HP0412H20，6.031gNaH2P042H20,87.666gNaCl,加800mL超純水混合，加熱溶解；用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH-7.4，加超純水至1L，配成含O.15mol/LNaCl，pH=7.4的0.1mol/L磷酸緩沖液(儲備液);(c)酪蛋白溶液稱取酪蛋白加熱溶解于0.01mol/L的PBS中，配成0.5-2%酪蛋白溶液；(d)磷酸緩沖液-吐溫儲備液(含l%Tween20的0.1mol/L磷酸緩沖儲備液，PBSTX10，pH=7.4);(e)甲醇溶液移取分析純甲醇溶液10mL于200mL容量瓶，加超純水定容，配成5%的甲醇溶液；(f)蘇丹紅l號儲備液稱取0.380g蘇丹紅1號標準品(sigma)，溶于3.80mL的二甲基甲酰胺中，配成0.lmg/mL的蘇丹紅1號儲備液；(g)底物溶液(20mL純水；lmL醋酸鈉緩沖液；200pL四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(1%);20pL過氧化氫(5%));①醋酸鈉緩沖液稱取3.450gCH3COONa3H20，用lOOmL超純水溶解，再用lmol/L擰檬酸(21.031gC6H807札0溶解于100mL水中)調(diào)節(jié)pb5.8后，再用水定容到250mL，配成0.lmol/L醋酸鈉緩沖液；②TMB:稱取0.0717gTMB，用7.17mL二甲基亞砜溶解，混勻，配成1%，w/v;③過氧化氫取20pL30。/。的過氧化氫加入100pL超純水中，混勻，配成5%;(h)H2SCV溶液移取25mL濃H2S04,溶解于475mL的超純水中，配成5%H2S04溶液。(i)RPMI-1640培養(yǎng)液RPMI-1640固體粉末10.4g溶于800ml超純水中，加入HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)4.67g，并按終體積1L計算加入200mmol/LL-谷氨酸、100mmol/L2-巰基乙醇及1mmol/L(艮卩0.1g/L)丙酮酸鈉，再加入10萬IU青霉素以及10"IU鏈霉素，補加超純水使終體積達1000mL，磁力攪拌34小時，充分溶解后再加入NaHC03約2g調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH至7.27.4，0.22pm濾器過濾除菌，無菌分裝，-2(TC密封保存。(2)主要儀器洗板機A5082，Tecan，Austria;酶標儀A2082,Tecan，Austria;高效液相色譜儀Alltech-001(3)間接ELISA篩選單克隆抗體(a)用包被抗原包板，每孔100nL，4'C過夜；(b)PBST緩沖液(PBST儲備液1:IO稀釋)滿孔洗滌三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔120pL，4'C過夜；(d)加入雜交瘤細胞上清，每孔50pL，37'C放置2小時；(e)PBST緩沖液洗板三次；(f)加入酶標二抗(羊抗鼠lgG-辣根過氧化物酶)，每孔100pL，37'C放置1小時；(g)PBST緩沖液洗板三次；(h)加入底物液顯色，每孔100pL，振搖15-20分鐘；(i)加入5。/。H2S04溶液，每孔50pL，終止反應；(j)用酶標儀測定吸光度值，做出標準曲線，進行結(jié)果分析與討論。(4)間接競爭ELISA步驟(a).用包被抗原包板，每孔200nL，4'C過夜；(b)PBST緩沖液(PBST儲備液1:IO稀釋)滿孔洗滌三次；(c)加入酪蛋白封阻，每孔280^L，室溫放置l小時；(d)PBST緩沖液洗板三次；(e)依次每孔加入100pL的標準溶液和100pL的一定稀釋度的單克隆抗體，室溫放置1小時；(f)PBST緩沖液洗板三次；(g)加入酶標二抗(羊抗鼠lgG-辣根過氧化物酶)，每孔200pL，室溫放置1小時；(h)PBST緩沖液洗板三次;(i)加入底物液顯色，每孔200pL，振搖15-20分鐘；(j)加入5。/。H2S04溶液，每孔80pL，終止反應；(k)用酶標儀測定吸光度值，做出標準曲線，進行結(jié)果分析與討論。(5)ELISA實驗條件的優(yōu)化本發(fā)明中的包被抗原為SudanI-C3-0VA,實驗中對包被抗原的濃度、抗體的稀釋度、酶標二抗的稀釋度等作了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為包被抗原的濃度為20ng/mL，單克隆抗體的稀釋度為l:50000，酶標二抗的稀釋度為l:20000，實驗溫度在室溫下進行。以后的實驗均在此條件下進行。(6)ELISA的標準曲線及靈敏度蘇丹紅1號標準溶液的濃度為0，0.1，0.3，1,0，3.0，10，30，100ng/mL，由蘇丹紅1號的儲備液(1.0mg/mL)經(jīng)過5%的甲醇稀釋而得。平行做9次，以蘇丹紅1號濃度的對數(shù)為橫坐標，以相對信號B/B。X100M為縱坐標做標準曲線(B。標液濃度為0ng/mL所對應的吸光度值；B:其他各濃度對應的吸光度值)。圖2為9次ELISA測定的平均標準曲線，ICso在1.1-2.0ng/mL之間。(7)溶劑效應選用常用的萃取溶劑甲醇和乙腈，測試了它們對ELISA的影響。用含O，1，2，5，10，20，30，40，50%的甲醇或乙腈水溶液，配置濃度為0.1-100ng/mL的蘇丹紅l號標準溶液，進行ELISA操作過程并作出標準曲線，如圖3所示，結(jié)果表明，1210%以下的乙腈和30%以下的甲醇對ELISA的靈敏度影響較小。由于甲醇較乙腈價廉且ELISA對甲醇的耐受性更高，本發(fā)明選用甲醇做樣品處理的萃取溶劑。(8)ELISA的特異性ELISA特異性可用交叉反應率來表示。交叉反應率(CR%)=(蘇丹紅1號的ICso/測試物質(zhì)的IC5Q)X100%。交叉反應率越小，ELISA的特異性越高。在本發(fā)明選擇蘇丹紅2-4號和其他6種食品常用色素(擰檬黃，日落黃，靛藍，亮蘭，莧菜紅，胭脂紅)進行交叉反應實驗，結(jié)果如表1所示。該單克隆抗體與蘇丹紅2-4號的交叉反應率為0.95~33.9%，與其他6種食用色素的交叉反應率均小于0.01%，說明所得抗體對蘇丹紅1號的特異性較高。5.ELISA對加標樣品中蘇丹紅1號含量的測定隨機選擇了10種食品辣椒面I，辣椒面II，辣椒醬I，辣椒醬II，番茄醬I，番茄醬n，火鍋料i，火鍋料n，香腸i，香腸n，經(jīng)elisa檢測，辣椒醬n為陽性樣品，蘇丹紅1號含量為1.03pg/g樣品；其余樣品中的蘇丹紅1號含量ELISA均無法檢出，為陰性樣品。最后選擇6種樣品即辣椒面i，辣椒醬i，辣椒醬n，番茄醬I，火鍋料I和香腸I做加標實驗。同一樣品取兩份，一份加入適量的蘇丹紅I的甲醇溶液，一份加入等體積的甲醇，靜置過夜，超聲30分鐘左右，渦旋混合l分鐘，靜置后，取上清離心20分鐘，上清用5%甲醇稀釋后用ELISA直接測定，結(jié)果如表2所示，回收率在88.2-110.5%，相對標準偏差為1.5-17.4%，說明該ELISA方法的準確性和精密度都較好。6.ELISA和HPLC的比較蘇丹紅1號的HPLC條件為色譜條件HypersilGold柱，柱溫為室溫，流動相為甲醇2%的乙酸水溶液=90:10，流量lmL/min，進樣20pL，紫外檢測波長480nm，標準溶液的濃度為0.01，0.05,0.1，0.5，1.0，2.0，5.0pg/mL，樣品萃取液用0.45pm的濾膜過濾后直接測定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC進行進一步驗證。9種加標樣品即辣椒面I，加標濃度5Mg/g和20Mg/g;辣椒醬I，加標濃度2^g/g和10pg/g;辣椒醬II,加標濃度0呢/g和2^g/g;番茄醬I，加標濃度5pg/g;火鍋料I，加標濃度10Mg/g;香腸I，加標濃度5Mg/g用甲醇萃取并用ELISA和HPLC測定，測定結(jié)果以ELISA為橫坐標，HPLC為縱坐標作圖得兩者的相關(guān)曲線，如如圖4所示，回歸方程為Y-0.8492X+0.3525(r=0.9840，n=9),說明二者的相關(guān)性很好。表i抗體與蘇丹紅n,m，iv及其他6種食品常用色素的交叉反應率化合物化學結(jié)構(gòu)式IC50CR(%)蘇丹紅I蘇丹紅II蘇丹紅ni蘇丹紅iv靛藍胭脂紅莧菜紅日落黃,OH,OH>—N—N"^^^~CH3.0HQH3gH3^3，Na03S~、^~N=N~,N、^~S,0Na03Na03S03Na1.9100209.5;633.92000.95>10000<0.01>10000<0.01>10000<0.01>10000<0.01>10000<0.01>10000<0.01,03Na表2加標實驗的回收結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a辣椒醬II的未加標樣品中蘇丹紅1號的測定值為1.03pg/g，加標后回收率(11°/。)=(加標后測定濃度-1.03)/加標濃度X100%。權(quán)利要求1.測定食品中蘇丹紅1號含量的單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)蘇丹紅1號修飾物的制備步驟1將0.02～0.08mol丙二酸溶于20～80mL新蒸吡啶中，加入0.02～0.1mol對硝基肉桂酸和0.001～0.004mol醋酸胺，此混合物在溫度100～150℃回流1～7小時，冷卻后，將反應物用醋酸重結(jié)晶，得到步驟1產(chǎn)物4～10g，熔程275～280℃；步驟2將步驟1產(chǎn)物0.15～0.65g，5～35mg鈀碳，2～15mL甲醇加入反應釜中，通入氫氣，于溫度100～120℃反應1～5小時，過濾反應物，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干溶液，用二氯甲烷∶甲醇＝5∶1的體積比過柱，收集TLC板實驗中Rf值為0.3的產(chǎn)物，旋干溶液，得到乳白色固體；步驟3將步驟2產(chǎn)物0.1g溶解在1.5～2.5mL濃鹽酸中，在溫度5～10℃加入含0.01～0.06g亞硝酸鈉的水溶液0.5mL，攪拌數(shù)分鐘，得到淡黃色重氮鹽溶液，將0.04～0.12g2-萘酚溶解于8～12％的氫氧化鈉水溶液3～5mL中，冷卻至5℃，再緩慢加入重氮鹽溶液中，得到0.12～0.30g蘇丹紅1號-3-丙酸，簡寫為Sudan1-C3，其反應式如下(2)免疫原和包被抗原的制備將0.10～0.45mmol的Sudan1-C3，0.10～0.80mmol的二環(huán)己基碳二亞胺，0.10～0.80mmol的N-羥基琥珀酰亞胺，溶解于100～600μL的二甲基甲酰胺，室溫攪拌過夜，將混合物離心5～20分鐘，取上層清液，緩慢加入0.01～0.02％的牛血清白蛋白或卵清蛋白，攪拌1～10小時，離心分離，取上層清液，透析數(shù)天，其中，Sudan1-C3-牛血清白蛋白為免疫原，Sudan1-C3-卵清蛋白為包被抗原；(3)蘇丹紅1號單克隆抗體的制備免疫將免疫原溶解于生理鹽水中，再與等體積的完全福氏佐劑混合，皮下多點免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原劑量在50～100μg，第一次免疫后，每隔兩周再次免疫，將完全福氏佐劑換成不完全福氏佐劑，第三次免疫后一周，尾部取血測鼠的抗血清效價，最后一次腹腔加強免疫，不加佐劑；融合最后一次對小鼠加強免疫，三天后取脾細胞，將脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按5∶1～10∶1的比例混合，在50％聚乙二醇4000的作用下融合，雜交瘤細胞用HAT培養(yǎng)液混懸，加入預先含有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板，置于溫度37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；篩選融合后2周，用間接ELISA法篩選，將陰性孔無色或接近無色，而陽性孔明確顯色的細胞用有限稀釋法進行亞克隆2-3次，及時進行檢測；單克隆抗體的大量生產(chǎn)先腹腔注射液體石蠟于BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接種雜交瘤細胞，觀察小鼠腹水情況，待腹水盡可能多，瀕于死亡之前，收集腹水，用硫酸銨沉淀法純化腹水中的單克隆抗體，純化抗體與等體積甘油1∶1混合并置于溫度-20℃保存；(4)建立測定蘇丹紅1號含量的單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附分析方法對所得抗體性能進行表征，在最優(yōu)試驗條件下，建立測定食品中蘇丹紅1號含量的ELISA；(5)溶劑效應選用常用的萃取溶劑甲醇和乙腈，測試了它們對ELISA的影響；用含0，1，2，5，10，20，30，40，50％的甲醇或乙腈水溶液，配置濃度為0.1～100ng/mL的蘇丹紅1號的標準溶液，進行ELISA操作過程并作出標準曲線；結(jié)果表明，10％以下的甲醇和30％以下的乙腈對ELISA的靈敏度影響較??；(6)ELISA對加標樣品中蘇丹紅1號含量的測定隨機選擇了10種食品辣椒面I，辣椒面II，辣椒醬I，辣椒醬II，番茄醬I，番茄醬II，火鍋料I，火鍋料II，香腸I，香腸II，經(jīng)ELISA檢測，辣椒醬II為陽性樣品，蘇丹紅1號含量為1.03μg/g樣品，其余樣品中的蘇丹紅1號含量ELISA均無法測出，為陰性樣品，最后選擇6種樣品即辣椒面I，辣椒醬I，辣椒醬II，番茄醬I，火鍋料I和香腸I做加標實驗，同一樣品取兩份，一份加入適量的蘇丹紅1號的甲醇溶液，一份加入等體積的甲醇，靜置過夜，超聲震蕩30分鐘，渦旋混合1分鐘，靜置后，取上層清液離心20分鐘，上層清液用5％甲醇稀釋后用ELISA直接測定，回收率在88.2-110.5％，相對標準偏差為1.5-17.4％，說明該方法的準確性和精密度都較好；(7)ELISA和HPLC的比較蘇丹紅1號的HPLC條件為色譜條件HypersilGold柱，柱溫為室溫，流動相為甲醇∶2％的乙酸水溶液＝90∶10，流量1mL/min，進樣20μL，紫外檢測波長480nm，標準溶液的濃度為0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0μg/mL，樣品萃取液用0.45μm的濾膜過濾后直接測定；所建立的ELISA的可靠性用HPLC進行進一步驗證，9種加標樣品，即辣椒面I，加標濃度5μg/g和20μg/g；辣椒醬I，加標濃度2μg/g，10μg/g；辣椒醬II，加標濃度0μg/g，2μg/g；番茄醬I，加標濃度5μg/g；火鍋料I，加標濃度10μg/g和香腸I，加標濃度5μg/g；加標樣品用甲醇萃取并用ELISA和HPLC測定，測定結(jié)果以ELISA為橫坐標，HPLC為縱坐標作圖得兩者的相關(guān)曲線，回歸方程為Y＝0.8492X+0.3525，相關(guān)系數(shù)為0.9840，n＝9，說明二者的相關(guān)性很好。全文摘要本發(fā)明公開了測定食品中蘇丹紅1號含量的單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)，其特點是合成蘇丹紅1號的修飾物并將其與蛋白聯(lián)接，制得免疫原及包被抗原。通過雜交瘤技術(shù)包括免疫、融合、篩選等步驟獲得抗蘇丹紅1號的單克隆抗體。該抗體用于蘇丹紅1號的免疫分析，標準曲線的濃度范圍為0.1～100ng/mL，IC₅₀為1.1～2.0ng/mL；抗體與蘇丹紅2-4號的交叉反應率為0.95～33.9％，與其他6種食品可添加色素幾乎沒有交叉反應；說明所建立的ELISA不僅靈敏度高而且特異性強。6種市售食品加標后用甲醇萃取，萃取液經(jīng)適當稀釋用ELISA測定，蘇丹紅1號的加標回收率為88.2～110.5％，相對標準偏差為1.5～17.4％。用HPLC和ELISA對9種加標樣品進行分析，兩種方法相關(guān)性較好(r＝0.9840，n＝9)。文檔編號G01N33/535GK101358978SQ200810046008公開日2009年2月4日申請日期2008年9月9日優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日發(fā)明者紅楊,王玉珍,鄧安平申請人:四川大學