專利名稱：抗a型流感病毒單克隆抗體及使用該抗體的免疫測(cè)定器具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗A型流感病毒單克隆抗體及使用該抗體的免疫測(cè)定器具。
背景技術(shù)：
流感以前就周期反復(fù)地在世界流行，每逢流感流行，就有很多死亡者，在1931年作為流感原因的病毒被檢測(cè)出，打開(kāi)了通向闡明流感原因的道路。流感病原體病毒，根據(jù)位于病毒內(nèi)部的可溶性核蛋白(nucleoprotein；NP)的抗原性被分類為A型、B型或C型3種類型。A型流感進(jìn)一步根據(jù)存在于病毒表面的紅血球凝聚素(hemagglutinin；HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase；NA)這2種包膜糖蛋白的抗原性分出亞型。
從1972年開(kāi)始為了預(yù)防流感，使用經(jīng)醚處理后用福爾馬林鈍化的疫苗。近年來(lái)，在用于預(yù)防的疫苗以外，作為治療藥還發(fā)現(xiàn)了抗流感藥，并被廣泛使用。作為這些治療藥，是適應(yīng)A型流感病毒的鹽酸金剛胺、和適應(yīng)A型流感病毒和B型流感病毒的扎那米韋、磷酸奧賽他米韋等。
在選擇這些治療藥時(shí)，重要的是檢測(cè)出樣品中的流感病毒，并確定感染是流感病毒所引起的、并確定病毒類型是A型或B型。另外，A型流感病毒與B型流感病毒比，感染力強(qiáng)，引起嚴(yán)重癥狀，因此在早期的治療中感染病毒的確定更為重要。
過(guò)去，利用抗流感病毒抗體檢測(cè)出流感病毒。迄今為止針對(duì)A型流感病毒的抗體，在判別預(yù)想流行的病毒的亞型以及制備疫苗中起作用，了解了特異地識(shí)別病毒的HA或NA、用于識(shí)別病毒的亞型的抗體(例如參照專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2)。另外，確定了A型流感病毒各亞型的核蛋白氨基酸序列，在National Library of Medicine；Entrez Nucleotides等中有報(bào)道。
而且，作為檢測(cè)流感病毒的裝置，例如知道準(zhǔn)備可結(jié)合流感病毒抗原的固相，使樣品中的流感病毒與之反應(yīng)后，進(jìn)而使結(jié)合著第一酶的A型流感病毒抗體和結(jié)合著第二酶的B型流感病毒抗體與上述固相反應(yīng)，加入基質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，目測(cè)觀察固相上的顯色的流通型(flow-through)裝置(參照專利文獻(xiàn)3)。此裝置，雖然試劑中的抗體使用針對(duì)流感病毒核蛋白的抗體，但是測(cè)定操作煩雜，不是簡(jiǎn)便的測(cè)定裝置。另外還知道使用了針對(duì)流感病毒核蛋白的單克隆抗體的免疫測(cè)定器具(以下叫做“免疫色譜器具”)(參照非專利文獻(xiàn)1)。
另一方面，開(kāi)發(fā)了使用可輸液的帶狀的基體的免疫色譜器具，只在所規(guī)定的部位上點(diǎn)滴樣品，不需要特別的檢測(cè)裝置、熟練的測(cè)定技術(shù)而能夠在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)便地測(cè)定樣品中的抗原或抗體。對(duì)于免疫色譜器具，根據(jù)其測(cè)定對(duì)象物質(zhì)開(kāi)發(fā)了例如能夠在檢測(cè)區(qū)結(jié)合多個(gè)梅毒螺旋體抗原(TP抗原)，并在各檢測(cè)區(qū)檢測(cè)出樣品中的多個(gè)抗TP抗體的免疫色譜器具(參照專利文獻(xiàn)4)。在該器具的檢測(cè)區(qū)中具有結(jié)合了不同的TP抗原的多個(gè)區(qū)，在1次的測(cè)定中就分別地檢測(cè)出不同的抗TP抗體，確定感染時(shí)期，用于治療藥的選擇等。
專利文獻(xiàn)1特開(kāi)平6-100594號(hào)專利文獻(xiàn)2特開(kāi)平7-304799號(hào)專利文獻(xiàn)3特開(kāi)2001-124775號(hào)專利文獻(xiàn)4特開(kāi)平9-229938號(hào)非專利文獻(xiàn)1感染癥志2001；75；792-799發(fā)明內(nèi)容以往的抗A型流感病毒單克隆抗體，雖然可以用作免疫色譜法等中針對(duì)核蛋白的抗體，但是由于對(duì)A型流感病毒的特異性和反應(yīng)性低，不能滿足高靈敏度的免疫測(cè)定。另外，為了選擇治流感藥，需求不與B型流感病毒反應(yīng)，但與包含流感病毒的HA和NA變異了的亞型的所有A型流感病毒反應(yīng)的抗體。
另外，需求在A型流感病毒或B型流感病毒的判別中不使用特別的診斷儀器設(shè)備和測(cè)定裝置，并在短時(shí)間內(nèi)得到測(cè)定結(jié)果，經(jīng)1次操作就能判別A型或B型的裝置。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種特異性高的抗A型流感病毒單克隆抗體。另外，本發(fā)明還提供一種能夠特異地檢測(cè)出A型流感病毒的免疫測(cè)定器具。
本發(fā)明人刻苦研究的結(jié)果，成功地制出以A型流感病毒的核蛋白為抗原，與A型流感病毒發(fā)生特異反應(yīng)的抗A型流感病毒單克隆抗體，從而完成了本發(fā)明。另外，通過(guò)利用這種A型流感病毒單克隆抗體，想到了可提供能夠與B型流感病毒區(qū)分開(kāi)地檢測(cè)出A型流感病毒的免疫測(cè)定器具。
即，本發(fā)明提供與A型流感病毒的分子量55-70kD的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，與B型流感病毒基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的抗A型流感病毒單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段。另外，本發(fā)明提供一種免疫測(cè)定器具，該器具是在基體上設(shè)置具有可移動(dòng)的標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體的標(biāo)記試劑區(qū)、樣品點(diǎn)滴區(qū)、展開(kāi)液供給區(qū)、展開(kāi)液吸收區(qū)及使抗A型流感病毒抗體固定在基體上的A型流感病毒檢測(cè)區(qū)的器具，上述標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體及固定在檢測(cè)區(qū)中的抗A型流感病毒抗體的至少一種抗體是上述本發(fā)明的單克隆抗體。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，提供了與A型流感病毒發(fā)生免疫反應(yīng)，但與B型流感病毒不發(fā)生反應(yīng)的抗A型流感病毒單克隆抗體。通過(guò)使用本發(fā)明的抗A型流感病毒單克隆抗體進(jìn)行免疫測(cè)定，能夠以與B型流感病毒區(qū)分開(kāi)地、檢測(cè)出A型流感病毒或?qū)⑵涠?。根?jù)本發(fā)明，還提供了使用了上述本發(fā)明的抗A型流感病毒單克隆抗體的免疫測(cè)定器具。通過(guò)使用本發(fā)明的免疫測(cè)定器具，能夠簡(jiǎn)便、且與B型流感病毒區(qū)分開(kāi)地、檢測(cè)出A型流感病毒。因此，期待著本發(fā)明在流感的診斷和治療上有大的貢獻(xiàn)。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是表示使本發(fā)明的單克隆抗體與采用Western印跡法分離的抗原反應(yīng)時(shí)的結(jié)果的圖。
圖2是表示在實(shí)施例4中使用的表達(dá)用質(zhì)粒(pW6A)的限制性酶切圖的圖。
圖3是表示將流感H1N1的A片段進(jìn)一步細(xì)分而得到的片段A1～A7的氨基酸的圖。
圖4是表示確認(rèn)與FVA2-11的反應(yīng)性的CBB染色圖案和Western印跡的圖。
圖5是表示A型流感病毒亞型的核蛋白氨基酸序列(80～140)的圖。
圖6是表示本發(fā)明的測(cè)定器具的一個(gè)實(shí)施方案的截面示意圖。
圖7是表示將本發(fā)明的測(cè)定器具安置在盒中的一個(gè)實(shí)例的俯視圖。
圖8是圖7的A-A’的截面圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方案如上所述，本發(fā)明的單克隆抗體與A型流感病毒的分子量55-70kD的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。與A型流感病毒的分子量55-70kD的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)可通過(guò)將A型流感病毒作為試樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)通過(guò)Western印跡法來(lái)證實(shí)。當(dāng)進(jìn)行Western印跡(參照下述實(shí)施例)時(shí)，本發(fā)明的單克隆抗體識(shí)別分子量55-70kD的核蛋白。
按照上述，本發(fā)明的單克隆抗體與B型流感病毒基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。在此，所謂“基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)”是指在能檢測(cè)出的水平下不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)或者即使引起抗原抗體反應(yīng)，其反應(yīng)的程度也明顯弱于與A型流感病毒的抗原抗體反應(yīng)，不與A型流感病毒發(fā)生抗原抗體反應(yīng)是指僅在本領(lǐng)域從業(yè)人員明了的程度反應(yīng)。另外，在此，所謂“與B型流感病毒基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)”是與包括B型流感病毒的核蛋白在內(nèi)的該病毒的各構(gòu)成要素的蛋白質(zhì)基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)之意。在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的單克隆抗體基本上也不與C型流感病毒反應(yīng)。
在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的單克隆抗體，與A型流感病毒核蛋白的氨基酸序列的第59(以下記載成“59aa”)～130位氨基酸殘基區(qū)域內(nèi)的表位反應(yīng)。A型流感病毒核蛋白的氨基酸序列已經(jīng)公知，例如記載在GenBank Accession No.ITY238021等中。圖5表示出A型流感病毒的各亞型的核蛋白的59aa～140aa氨基酸序列。另外，在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的單克隆抗體，由于與各亞型的A型流感病毒的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，因此，將圖5所示的氨基酸序列中有共有序列、有親水性結(jié)構(gòu)的例如90aa～95aa、111aa～115aa或120aa～123aa等區(qū)域，或者包含這些區(qū)域、且具有共有序列的區(qū)域作為表位。
在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的單克隆抗體，與A型流感病毒的各亞型的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。即，A型流感病毒雖在其病毒粒子表面具有紅血球凝聚素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)，根據(jù)這些H和N的結(jié)構(gòu)不同被分類為種種的亞型。本發(fā)明的單克隆抗體，優(yōu)選至少與下列亞型的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，進(jìn)而優(yōu)選與公知的所有A型流感病毒的亞型的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。H1N1、H2N2、H3N2、H3N8、H4N6、H5N2、H6N2、H7N7、H8N4、H9N2、H10N7、H11N6、H12N5、H13N6、H14N5、H15N8、H5N1。
另外，在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的單克隆抗體，與癥狀至少部分地和流感類似的其他感染癥的病原體也基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。例如與腺病毒(1～7型)、柯薩奇病毒(A16、B1～B6型)、單純皰疹病毒1型、?？刹《?3型、4型、7型、22型、30型)、腸病毒(71型)、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒(1～3型)、RS病毒(亞群A、亞群B)、副流感病毒(1～3型)、大腸桿菌、肺炎桿菌、綠膿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、黃色葡萄球菌、棒桿菌、白喉棒桿菌、白色念珠菌(Candida albicans)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、鏈球菌屬的細(xì)菌(群B、C、G、F)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、肺炎支原體(Mycoplasmal pneumonia)、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumonia)基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
另外，眾所周知，通過(guò)用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分解抗體，可以得到Fab片段和F(ab’)2片段之類的具有與對(duì)應(yīng)抗原的結(jié)合性的抗體片段(在本說(shuō)明書(shū)中叫做“抗原結(jié)合性片段”)，但本發(fā)明的單克隆抗體的抗原結(jié)合性片段也能夠與本發(fā)明的單克隆抗體同樣地使用，包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的單克隆抗體，將A型流感病毒的核蛋白作為免疫原，采用常規(guī)雜交瘤法制備。作為免疫原使用的A型流感病毒的核蛋白，如果核蛋白大量存在，能發(fā)揮其免疫原作用，則培養(yǎng)病毒液、流感HA疫苗、HI用HA抗原、重組抗原均能使用。為了抑制抗原所含的免疫原性高的HA和NA的作用，也可通過(guò)超離心核蛋白純化(例如參照J(rèn).Biochem.；1021241-1249，1987)或蛋白酶處理(例如參照J(rèn).Immunol.Methods；180107-116，1995)的抗原。
上述單克隆抗體可通過(guò)下述方式產(chǎn)生，即，將包含上述A型流感病毒的核蛋白的抗原作為免疫原免疫動(dòng)物，將其產(chǎn)生A型流感病毒單克隆抗體的細(xì)胞和腫與瘤細(xì)胞融合，利用所得的雜交瘤產(chǎn)生上述單克隆抗體。
上述雜交瘤可采用以下的方法得到。即，將如上述那樣得到的上述抗原的A型流感病毒核蛋白與弗氏完全佐劑一起分成數(shù)次每隔2-3個(gè)星期通過(guò)腹腔內(nèi)或靜脈施予來(lái)對(duì)小鼠等動(dòng)物進(jìn)行免疫。接著，使來(lái)源于脾臟等的產(chǎn)生抗體細(xì)胞、和來(lái)自骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞(骨髓瘤細(xì)胞)等的在試驗(yàn)管內(nèi)能繁殖的腫瘤細(xì)胞融合。
作為上述融合方法，可按照Kohler和Milstein的常規(guī)方法(Nature，256卷，495頁(yè)，1975年)利用聚乙二醇來(lái)進(jìn)行，或者可采用仙臺(tái)病毒等來(lái)進(jìn)行。
作為從上述融合細(xì)胞選擇產(chǎn)生識(shí)別A型流感病毒核蛋白的抗體的雜交瘤的方法，例如可如下地進(jìn)行。即，由上述融合細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法選擇在HAT培養(yǎng)基和/或HT培養(yǎng)基中生存的細(xì)胞作為雜交瘤。接著，利用培養(yǎng)上述雜交瘤的培養(yǎng)液在固定了高純度純化的A型流感病毒核蛋白的檢測(cè)板上反應(yīng)之后，通過(guò)與抗小鼠免疫球蛋白(Ig)等進(jìn)一步反應(yīng)的EIA法等，能夠選擇產(chǎn)生特異地識(shí)別A型流感病毒核蛋白的單克隆抗體的雜交瘤。
在下述實(shí)施例中，得到了多種本發(fā)明優(yōu)選的單克隆抗體，將其中的3種分別命名為雜交瘤FVA2-3、雜交瘤FVA2-6及雜交瘤FVA2-11。這些雜交瘤分別根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(日本茨城縣筑波東1丁目1番地1、中央第6)，其中，雜交瘤FVA2-3鑒定表示FVA2-3，其保藏號(hào)是FERMBP-10066(保藏日2003年7月18日，在2004年7月14日從國(guó)內(nèi)保藏FERM P-19437轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏)；雜交瘤FVA2-6鑒定表示FVA2-6，其保藏號(hào)是FERM BP-10067(保藏日2003年7月18日，在2004年7月14日從國(guó)內(nèi)保藏FERM P-19438轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏)；雜交瘤FVA2-11鑒別表示FVA2-11，保藏號(hào)是FERM BP-10068(保藏日2003年7月18日，在2004年7月14日從國(guó)內(nèi)保藏FERM P-19439轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏)。
上述各個(gè)雜交瘤，通過(guò)在用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠從培養(yǎng)上清液回收單克隆抗體。另外，通過(guò)施予產(chǎn)生雜交瘤的動(dòng)物，還能貯存腹水，并從該腹水中回收。
作為上述單克隆抗體的回收方法，可使用通常進(jìn)行的純化方法，例如舉出凝膠過(guò)濾色譜法、離子交換色譜法、蛋白質(zhì)A的親和色譜法等。
按照上述方法制備的單克隆抗體，經(jīng)確認(rèn)可與A型流感病毒的核蛋白，以及A型流感病毒的各種亞型反應(yīng)?，F(xiàn)已保藏并能得到的人、馬、野鴨、火鳥(niǎo)、海豹、雞、海鷗、綠頭鴨等的A型流感病毒保藏株38種(參照以下的表3)也與之發(fā)生反應(yīng)，并且它們能用本發(fā)明的單克隆抗體檢測(cè)出。另一方面，作為考慮交叉反應(yīng)性的微生物，例如證實(shí)了與腺病毒(1～7型)、柯薩奇病毒(A16、B1～B6型)、單純皰疹病毒1型、?？刹《?3型、4型、7型、22型、30型)、腸病毒(71型)、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒(1～3型)、RS病毒(亞群A、亞群B)、副流感病毒(1～3型)、大腸桿菌、肺炎桿菌、綠膿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、黃色葡萄球菌、棒桿菌、白喉棒桿菌、白色念珠菌、釀膿鏈球菌、鏈球菌屬的細(xì)菌(群B、C、G、F)、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌、肺炎支原體、沙眼衣原體、肺炎衣原體等的反應(yīng)性，但反應(yīng)未發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明的單克隆抗體，能夠用于A型流感病毒的檢測(cè)或定量的免疫測(cè)定。免疫測(cè)定方法是眾所周知的，可以采用公知的任何免疫測(cè)定方法。即，按測(cè)定形式分類有夾層法、競(jìng)爭(zhēng)法、凝聚法、Western印跡法等，按使用的標(biāo)記分類，有熒光法、酶法、放射法、生物素法等，可使用這些方法中的任1種方法。而且，還能夠通過(guò)免疫組織染色來(lái)診斷。在免疫測(cè)定方法中使用標(biāo)記抗體時(shí)，抗體的標(biāo)記方法是眾所周知的，可采用已知的任何方法。另外眾所周知，將抗體用木瓜蛋白酶分解或用胃蛋白酶分解，可得到如Fab片段和F(ab’)2片段那樣的、具有與對(duì)應(yīng)抗原有結(jié)合性的抗體片段(在本說(shuō)明書(shū)中叫做“抗原結(jié)合性片段”)，本發(fā)明的單克隆抗體的抗原結(jié)合性片段也能夠與本發(fā)明的單克隆抗體同樣地使用。
這些免疫測(cè)定方法自身是眾所周知的，不需要在本說(shuō)明書(shū)中說(shuō)明，簡(jiǎn)單描述如下，例如在夾層法中，將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合性片段作為第1抗體固定于固相，使之與樣品反應(yīng)，洗凈后，使之和與本發(fā)明的與酶發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的第2抗體反應(yīng)，洗凈后，測(cè)定結(jié)合于固相的第2抗體。通過(guò)用酶、熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、生物素等標(biāo)記第2抗體，能夠測(cè)定結(jié)合于固相的第2抗體。對(duì)濃度已知的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試樣利用上述方法測(cè)定，基于所測(cè)定的標(biāo)記量和標(biāo)準(zhǔn)試樣中的本發(fā)明的酶的關(guān)系制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)將未知濃度的被檢試樣的測(cè)定結(jié)果套用于該標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠?qū)⒈粰z試樣中的本發(fā)明的酶定量。也可以將第1抗體和第2抗體在上述說(shuō)明中相互替換。另外，在凝聚法中，在乳膠等的粒子上固定本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合性片段，使之與樣品反應(yīng)，測(cè)定吸光度。對(duì)濃度已知的多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)試樣利用上述方法測(cè)定，基于所測(cè)定的標(biāo)記量和標(biāo)準(zhǔn)試樣中的本發(fā)明的酶的關(guān)系制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)將未知濃度的被檢試樣的測(cè)定結(jié)果套用于該標(biāo)準(zhǔn)曲線，能夠?qū)⒈粰z試樣中的本發(fā)明的酶定量。
本發(fā)明還提供一種免疫測(cè)定器具，該器具利用上述本發(fā)明的單克隆抗體，能夠簡(jiǎn)便、且與B型流感病毒區(qū)分開(kāi)地、檢測(cè)出A型流感病毒。
本發(fā)明的免疫測(cè)定器具，是在基體上設(shè)置了具有可移動(dòng)的標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體的標(biāo)記試劑區(qū)、樣品點(diǎn)滴區(qū)、展開(kāi)液供給區(qū)、展開(kāi)液吸收區(qū)及使抗A型流感病毒抗體固定在基體上的A型流感病毒檢測(cè)區(qū)的器具，其中上述標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體及固定在檢測(cè)區(qū)中的抗A型流感病毒抗體中的至少一種是本發(fā)明的單克隆抗體。點(diǎn)滴在樣品點(diǎn)滴區(qū)中的樣品，與標(biāo)記試劑區(qū)所含有的標(biāo)記抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，形成被標(biāo)記了的抗原抗體復(fù)合物。該抗原抗體復(fù)合物隨由展開(kāi)液供給區(qū)供給的展開(kāi)液流動(dòng)，到達(dá)A型流感病毒檢測(cè)區(qū)。在這里，固定在基體上的抗A型流感病毒抗體和上述標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，上述標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物被固定在基體上。標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物是否被固定在A型流感病毒檢測(cè)區(qū)中通過(guò)有無(wú)標(biāo)記來(lái)判定。在A型流感病毒檢測(cè)區(qū)中通過(guò)的展開(kāi)液被展開(kāi)液吸收區(qū)吸收。樣品點(diǎn)滴區(qū)和標(biāo)記試劑區(qū)可以是同一個(gè)(此種情況下樣品被點(diǎn)滴在標(biāo)記試劑區(qū))。在本發(fā)明的免疫測(cè)定器具中，標(biāo)記抗體或固定在A型流感病毒檢測(cè)區(qū)中的抗體的至少任一種是本發(fā)明的單克隆抗體。另外，其中一種抗體也可以是多克隆抗體。A型流感病毒的核蛋白通常結(jié)合或附著著多個(gè)分子，因此標(biāo)記抗體或固定在A型流感病毒檢測(cè)區(qū)中的抗體這兩者即使是相同的單克隆抗體，也能夠檢測(cè)A型流感病毒。
以下分別說(shuō)明本發(fā)明的免疫測(cè)定器具的各構(gòu)成要件。
基體本發(fā)明的免疫測(cè)定器具中的帶狀基體，采用利用毛細(xì)管作用而能輸送液體的吸收性材料構(gòu)成。作為該吸收性材料，例如是單獨(dú)使用纖維素、硝基纖維素等的纖維素或其衍生物、玻璃纖維等制備的或?qū)⑺鼈兓旌鲜褂枚苽涞募?、膜、多孔性材料。該基體的大小沒(méi)有限制，但寬3mm-10mm左右、長(zhǎng)30mm-100mm左右的帶狀基體因操作容易故優(yōu)選?；w可使用厚度為100μm-1mm的。另外，基體為了防止在測(cè)定時(shí)來(lái)源于樣品的蛋白質(zhì)在基體上的非特異反應(yīng)所致的吸附，例如可用牛血清白蛋白(BSA)等的動(dòng)物血清、酪蛋白、蔗糖等將其一部分或全體封閉(blocking)而使用。
檢測(cè)區(qū)在檢測(cè)區(qū)能夠設(shè)置在上述基體上固定了抗A型流感病毒抗體的A型流感病毒檢測(cè)部。固定在該檢測(cè)部的抗A型流感病毒抗體和后述的標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體，至少一種是本發(fā)明的抗A型流感病毒單克隆抗體，優(yōu)選這兩種抗體是抗A型流感病毒單克隆抗體。檢測(cè)部的上述抗A型流感病毒抗體在基體上與在基體中展開(kāi)的液體的輸液方向(基體的縱向)正交的方向上，線條狀地設(shè)置時(shí)能提供靈敏度好地測(cè)定，故優(yōu)選。作為抗A型流感病毒多克隆抗體，可從市場(chǎng)銷售、并能容易得到的多克隆抗體中適宜選擇使用。
該檢測(cè)區(qū)的抗A型流感病毒抗體，是上述的抗體，還能將單克隆抗體單獨(dú)使用或混合而使用?？笰型流感病毒抗體，可以是IgG抗體、IgM抗體、還可以是這些抗體的抗原結(jié)合性片段F(ab)、F(ab’)2等。
被固定在檢測(cè)部的抗A型流感病毒抗體可以使之直接物理吸附在基體的檢測(cè)區(qū)上，也可以利用共價(jià)鍵等化學(xué)鍵進(jìn)行固定從而設(shè)置。另外，還可以使抗A型流感病毒抗體與水不溶性的載體結(jié)合，從而使基體內(nèi)含有該抗體。作為該不溶性的載體，可舉出將由明膠、阿拉伯膠及六偏磷酸鈉組成的混合物不溶化而得到的粒子(特公昭63-29223)、聚苯乙烯乳膠粒子、玻璃纖維等。在使不溶性載體和抗A型流感病毒單克隆抗體結(jié)合時(shí)，可通過(guò)上述化學(xué)鍵或物理吸附來(lái)進(jìn)行。
在檢測(cè)區(qū)中，除了采用抗A型流感病毒抗體的A型流感病毒檢測(cè)部以外，還可設(shè)置采用抗B型流感病毒抗體的B型流感病毒檢測(cè)部。該B型流感病毒檢測(cè)部，如果是上述A型流感病毒檢測(cè)部的近旁，則在展開(kāi)液的輸液方向可以是上述A型流感病毒檢測(cè)部上游側(cè)或下游側(cè)的任一側(cè)。在B型流感病毒檢測(cè)區(qū)固定的抗B型流感病毒抗體，也可以是多克隆抗體或單克隆抗體，與上述抗A型流感病毒抗體同樣，能通過(guò)化學(xué)鍵或物理吸附固定在基體上。
如上述，在基體上的檢測(cè)區(qū)至少設(shè)置采用抗A型流感病毒抗體的A型流感病毒檢測(cè)部，進(jìn)而設(shè)置B型流感病毒檢測(cè)部，在同時(shí)測(cè)定A型流感病毒和B型流感病毒上為優(yōu)選。這些檢測(cè)部在基體的輸液方向上是酶標(biāo)記試劑區(qū)、樣品點(diǎn)滴區(qū)及展開(kāi)液供給區(qū)的下游側(cè)，是添加液吸收區(qū)的上游側(cè)。檢測(cè)部在基體上接近于寬0.5mm～5mm左右的線條狀，可設(shè)置多條的線。如果是寬5mm左右的基體，則通常將上述抗體和抗原分別點(diǎn)滴0.1μg-10μg左右，使之干燥，從而能作成檢測(cè)部。
標(biāo)記試劑區(qū)標(biāo)記試劑區(qū)，向設(shè)置于基體上的區(qū)可移動(dòng)地點(diǎn)滴標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體從而進(jìn)行設(shè)置。該區(qū)在來(lái)自展開(kāi)液供給區(qū)的展開(kāi)液的輸液方向可設(shè)置在上述檢測(cè)區(qū)的上游側(cè)。該區(qū)利用下述方法構(gòu)成向基體點(diǎn)滴酶標(biāo)記試劑的方法；將含有酶標(biāo)記試劑的吸水性墊層疊在基體上的方法；或者使與墊粘合的基體部分的一部分或全部與墊一起含有酶標(biāo)記試劑的方法。作為吸水性墊，可使用后述的樣品點(diǎn)滴區(qū)的墊。
作為標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體的抗體，和上述設(shè)置在檢測(cè)區(qū)的抗體，至少一種是抗A型流感病毒單克隆抗體，優(yōu)選這兩種抗體是抗A型流感病毒單克隆抗體。作為標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體的抗體，與上述檢測(cè)區(qū)的抗體同樣地還能使用其片段。
上述標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體，使上述抗體和標(biāo)記物結(jié)合而制備。作為標(biāo)記物，可舉出酶、金屬膠體粒子、著色乳膠粒子、發(fā)光物質(zhì)、熒光物質(zhì)等。作為酶，是酶免疫測(cè)定法(EIA)所使用的各種酶，作為這種酶例如可舉出堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶等。另外，作為金屬膠體粒子例如可使用膠體金粒子、膠體硒粒子等。
另外，標(biāo)記物和抗A型流感病毒抗體的結(jié)合方法，可利用公知的形成共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的方法制備。結(jié)合的方法例如可舉出戊二醛(グタルアルデヒド)法、過(guò)碘酸法、馬來(lái)酰亞胺法、吡啶基二硫化物法、使用各種交聯(lián)劑的方法等(例如參照“蛋白質(zhì)核酸酶”增刊31號(hào)，37-45頁(yè)(1985))。在使用交聯(lián)劑的結(jié)合方法中，作為交聯(lián)劑例如可使用N-琥珀酰亞胺基(スクシンイミジル)-4-馬來(lái)酰亞胺基丁酸(GMBS)、N-琥珀酰亞胺基-6-馬來(lái)酰亞胺基己酸、N-琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸等。在共價(jià)結(jié)合的方法中，除了能使用在抗體中存在的官能團(tuán)以外，例如采用常規(guī)方法導(dǎo)入硫醇基、氨基、羧基、羥基等官能團(tuán)之后，利用上述結(jié)合法能夠制備標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體。另外，作為非共價(jià)結(jié)合的方法，可舉出物理吸附法等。
按照上述的那樣，除了檢測(cè)A型流感病毒以外，同時(shí)還檢測(cè)B型流感病毒時(shí)，在標(biāo)記試劑區(qū)添加標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體而制備器具。標(biāo)記試劑區(qū)中含有的標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體和標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體，在基體或吸水性墊的其中一種中含有，或者可使基體和吸水性墊這兩者中含有標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體和標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體。在進(jìn)行A型流感病毒和B型流感病毒的同時(shí)測(cè)定時(shí)，由于較多地使用標(biāo)記試劑，因此在基體和墊這兩者中單獨(dú)或混合地含有酶標(biāo)記試劑在進(jìn)行高靈敏度測(cè)定上是有利的。標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體和標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體量通常可相應(yīng)于檢查對(duì)象物的預(yù)測(cè)量適宜變更，但通常干燥重量是0.01μg-5μg左右。標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體和標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體在酶標(biāo)記區(qū)中含有時(shí)，能夠與試劑的穩(wěn)定劑、溶解調(diào)節(jié)劑等一起涂布。
樣品點(diǎn)滴區(qū)樣品點(diǎn)滴區(qū)，尤其可不含有試劑等而設(shè)置在展開(kāi)液供給區(qū)的展開(kāi)液的輸液方向的下游側(cè)、檢測(cè)區(qū)的上游側(cè)的基體上。而且，樣品點(diǎn)滴區(qū)能設(shè)置在1)展開(kāi)液區(qū)的展開(kāi)液輸液方向的下游側(cè)、酶標(biāo)記試劑區(qū)的上游側(cè)的所規(guī)定的部位；2)標(biāo)記試劑區(qū)的下游側(cè)、檢測(cè)區(qū)的上游側(cè)的所規(guī)定的部位；3)標(biāo)記試劑區(qū)上的所規(guī)定的部位等。另外，在上述酶標(biāo)記試劑區(qū)中設(shè)置樣品點(diǎn)滴區(qū)的裝置中，如上述，附設(shè)含有酶標(biāo)記的吸水性墊在高效率地進(jìn)行分析上為優(yōu)選。在附加了該墊的裝置中，能夠點(diǎn)滴大量的樣品液，因此能夠以好的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行樣品中微量成分的測(cè)定。作為該吸水性墊，從對(duì)標(biāo)記試劑和樣品中的流感病毒的吸附少的材料中選擇，例如可單獨(dú)地用由聚乙烯醇(PVA)、無(wú)紡布、纖維素等多孔的合成或天然的高分子化合物組成的材料構(gòu)成或?qū)⑦@些材料組合從而構(gòu)成。該墊的大小、厚度、密度等不限定，通常使用長(zhǎng)和寬為3mm-10mm左右、厚度為0.5mm-4mm左右的墊能高效率地進(jìn)行測(cè)定，故優(yōu)選。
展開(kāi)液供給區(qū)展開(kāi)液供給區(qū)是設(shè)置在基體的縱向的一端，供給展開(kāi)液的區(qū)。在開(kāi)始測(cè)定時(shí)可將該區(qū)浸漬在裝有至少到達(dá)展開(kāi)液吸收區(qū)的量的展開(kāi)液的容器中。而且，為了供給展開(kāi)液，在展開(kāi)液區(qū)附加裝有展開(kāi)液的液槽，通過(guò)破除該液槽的罩使展開(kāi)液和基體接觸，開(kāi)始測(cè)定?？稍谡归_(kāi)液中適宜含有表面活性劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、抗菌劑等。另外，作為標(biāo)記物也使用酶時(shí)，可以與后述的基質(zhì)試劑區(qū)一起向展開(kāi)液中添加基質(zhì)。作為含有緩沖劑的緩沖液，例如可舉出乙酸緩沖液、硼酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、二乙醇胺緩沖液等。另外，在展開(kāi)液供給區(qū)，為了穩(wěn)定并連續(xù)地實(shí)施向基體供給展開(kāi)液，可附設(shè)展開(kāi)液墊。作為展開(kāi)液墊例如可使用纖維素或纖維素衍生物等的濾紙。
展開(kāi)液吸收區(qū)展開(kāi)液吸收區(qū)，相對(duì)于設(shè)置在基體一端的上述展開(kāi)液區(qū)設(shè)置在基體另一端。該區(qū)為了吸收向基體供給的展開(kāi)液并順利進(jìn)行分析而設(shè)置。展開(kāi)液吸收區(qū)，可長(zhǎng)長(zhǎng)地形成基體以確保該區(qū)。另外，也能在基體上附設(shè)吸水性材料以促進(jìn)展開(kāi)。該吸水性材料可使用由天然高分子化合物、合成高分子化合物等構(gòu)成的保水性高的濾紙、海綿等。展開(kāi)液吸收區(qū)有具有完全吸收展開(kāi)液的容積的墊狀吸收性材料，通過(guò)將吸收性材料層疊在基體之上或之下就能夠制備小型化的免疫測(cè)定器具。
基質(zhì)試劑區(qū)而且，作為標(biāo)記試劑區(qū)的標(biāo)記物使用酶時(shí)，按照上述的那樣，能夠使展開(kāi)液中含有基質(zhì)、或?qū)⒒|(zhì)試劑區(qū)設(shè)置在基體的上述展開(kāi)液供給區(qū)近旁?；|(zhì)試劑區(qū)，包含、設(shè)置在附設(shè)于展開(kāi)液供給區(qū)的上述展開(kāi)液墊上時(shí)，在增多基質(zhì)量進(jìn)行高靈敏度測(cè)定時(shí)為優(yōu)選。
作為基質(zhì)，可與標(biāo)記試劑的酶對(duì)應(yīng)地使用以下所示的各種顯色基質(zhì)、熒光基質(zhì)、發(fā)光基質(zhì)等。
(a)顯色基質(zhì)過(guò)氧化物酶用與過(guò)氧化氫組合的2，2’-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)堿性磷酸酶用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)(b)熒光基質(zhì)堿性磷酸酶用4-甲基傘形苯基-磷酸酯(4MUP)β-D-半乳糖苷酶用4-甲基傘形苯基-β-D-半乳糖苷(4MUG)(c)發(fā)光基質(zhì)堿性磷酸酶用3-(2’-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷·二鈉鹽(AMPPD)β-D-半乳糖苷酶用3-(2’-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”-β-D-半乳糖吡喃糖基(ガラクトピラノシル))苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷(AMGPD)過(guò)氧化物酶用與過(guò)氧化氫組合的魯米諾、異魯米諾。
在將上述基質(zhì)設(shè)置成為基質(zhì)區(qū)時(shí)，通常將上述基質(zhì)溶解于水溶液中，在展開(kāi)液墊上線條狀地涂布之后，使之干燥由此能夠形成，還可根據(jù)需要添加基質(zhì)的信號(hào)增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑、溶解調(diào)節(jié)劑等?；|(zhì)區(qū)如果是附設(shè)在基體端部的展開(kāi)液墊內(nèi)，則不特別限定。展開(kāi)液及添加到展開(kāi)液墊上的基質(zhì)量可根據(jù)測(cè)定條件確定，但每1個(gè)器具，通?？墒褂?～500μg左右。
各區(qū)的配置圖6-圖8示意地表示出本發(fā)明的1例優(yōu)選的免疫測(cè)定器具。圖6中，編號(hào)2是基體，4是標(biāo)記試劑區(qū)，8是樣品點(diǎn)滴區(qū)，3是展開(kāi)液供給區(qū)，5是展開(kāi)液吸收區(qū)，6a是A型流感病毒檢測(cè)區(qū)，7是基質(zhì)試劑區(qū)，9是樣品。在該例子中，樣品點(diǎn)滴區(qū)8和標(biāo)記試劑區(qū)4為同一個(gè)。編號(hào)6b是B型流感病毒檢測(cè)區(qū)，10是展開(kāi)液確認(rèn)區(qū)，11是展開(kāi)液槽(參照下述實(shí)施例6)。
測(cè)定器具的使用方法可利用本發(fā)明的測(cè)定器具測(cè)定各種樣品試樣中的A型流感病毒。測(cè)定如下進(jìn)行，首先將樣品供給本發(fā)明的測(cè)定器具的樣品點(diǎn)滴區(qū)之后，向展開(kāi)液墊供給展開(kāi)液，在基體上展開(kāi)。作為樣品的稀釋液，作為試樣稀釋液可使用含有表面活性劑的緩沖液。展開(kāi)液通過(guò)毛細(xì)管作用在基體中移動(dòng)，到達(dá)展開(kāi)液吸收區(qū)，未與檢測(cè)區(qū)結(jié)合的樣品中的成分、酶標(biāo)記試劑等被吸收，完成了展開(kāi)。經(jīng)過(guò)規(guī)定的時(shí)間(通常為10分～20分)后，觀察檢測(cè)區(qū)，利用樣品液中的A型流感病毒測(cè)定固定在檢測(cè)部的標(biāo)記物，由此能夠進(jìn)行A型流感病毒的測(cè)定。該檢測(cè)可根據(jù)標(biāo)記物或和標(biāo)記物使用的酶分別對(duì)應(yīng)使用目測(cè)或比色計(jì)、熒光光度計(jì)、光子計(jì)數(shù)器、感光膜等的測(cè)定裝置來(lái)實(shí)施。在測(cè)定中，例如通過(guò)目測(cè)來(lái)測(cè)定檢測(cè)區(qū)的顯色的方法是簡(jiǎn)便的。另外，在該方法中，通過(guò)使用與A型流感病毒的濃度對(duì)應(yīng)的色標(biāo)(比色圖表)，能夠進(jìn)行半定量的分析。而且，還能夠利用比色計(jì)等將檢測(cè)區(qū)的顯色數(shù)值化，從而進(jìn)行定量。
以圖6-圖8所示的本發(fā)明的一例優(yōu)選的免疫測(cè)定器具為例，進(jìn)一步說(shuō)明測(cè)定原理。在將樣品9點(diǎn)滴在樣品點(diǎn)滴區(qū)8中的同時(shí)，將展開(kāi)液槽11中的展開(kāi)液向展開(kāi)液供給區(qū)3供給。展開(kāi)液利用毛細(xì)管現(xiàn)象在基體2中朝橫向的白箭頭方向移動(dòng)。基質(zhì)試劑區(qū)7中含有的基質(zhì)被溶解于展開(kāi)液中，隨展開(kāi)液移動(dòng)。另一方面，樣品9與標(biāo)記試劑區(qū)4中的標(biāo)記抗體反應(yīng)，形成標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物。展開(kāi)液達(dá)到這里時(shí)，標(biāo)記的抗原抗體復(fù)合物一邊與展開(kāi)液中的基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，一邊在基體2中移動(dòng)，當(dāng)?shù)竭_(dá)A型流感病毒檢測(cè)區(qū)6a時(shí)，與固定在A型流感病毒檢測(cè)區(qū)6a中的抗A型流感病毒抗體發(fā)生反應(yīng)，被固定在A型流感病毒檢測(cè)區(qū)6a中。在樣品中含有A型流感病毒時(shí)，通過(guò)標(biāo)記酶和基質(zhì)的反應(yīng)，引起顯色。另一方面，在樣品中不含有A型流感病毒時(shí)，標(biāo)記抗體不能發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，由于標(biāo)記未被固定在A型流感病毒檢測(cè)區(qū)6a中，故未引起顯色。因此，根據(jù)A型流感病毒檢測(cè)區(qū)6a顯色與否就能知道樣品中是否含有A型流感病毒。在展開(kāi)液確認(rèn)區(qū)10中，與展開(kāi)液中的試劑發(fā)生反應(yīng)而顯色的酶被固定，如果展開(kāi)液確認(rèn)區(qū)10顯色，則知道展開(kāi)液到達(dá)到那里?；蛘咭部梢栽谡归_(kāi)液確認(rèn)區(qū)10中固定針對(duì)標(biāo)記酶的抗體，到達(dá)展開(kāi)液確認(rèn)區(qū)10的標(biāo)記試劑被該抗體捕獲，進(jìn)而當(dāng)展開(kāi)液到達(dá)時(shí)，被捕獲的標(biāo)記和展開(kāi)液中的基質(zhì)發(fā)生反應(yīng)從而顯色(在下述實(shí)施例中，將抗堿性磷酸酶抗體固定)。另外，在標(biāo)記試劑區(qū)4中含有標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體，另一方面，如果設(shè)置固定了抗B型流感病毒抗體的B型流感病毒檢測(cè)區(qū)6b，則也能同時(shí)進(jìn)行B型流感病毒的檢測(cè)，能夠以單一的測(cè)定操作調(diào)查流感病毒是A型還是B型。
另外，上述基體還能夠?qū)盈B、固定在塑料、金屬、紙等的支撐構(gòu)件上而使用。上述基體通過(guò)固定在塑料等的殼中，在展開(kāi)液供給區(qū)附設(shè)含有展開(kāi)液的液槽，對(duì)上述各區(qū)部分用開(kāi)了孔的殼進(jìn)行保護(hù)，從而能夠構(gòu)成易于操作的器具。作為在本發(fā)明的免疫測(cè)定器具中使用的樣品，是從人、動(dòng)物等采集的、被認(rèn)為含有流感病毒的樣品，可舉出各種體液、例如鼻腔拭液、鼻腔吸液、咽拭液等體液提取液。
以下通過(guò)參考例、實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不被這些實(shí)施例實(shí)施例1抗A型流感病毒單克隆抗體的制備免疫原使用了含有流感核蛋白抗原的流感HA疫苗(化血研制A/New Caledonia/20/99(H1N1)(IVR-116)株、A/巴拿馬/2007/99(H3N2)NIB-41)株)。在免疫原中加入等量的弗氏完全佐劑(ヤトロン公司制)，完全混合后，對(duì)Balb/c小鼠以2星期間隔計(jì)4次進(jìn)行免疫。在細(xì)胞融合的3天前向小鼠腹腔內(nèi)注射免疫原，使用PEG融合了小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(P3U1)。培養(yǎng)液使用HAT選擇培養(yǎng)基，在約2星期后采集培養(yǎng)上清液供篩選用。在1次篩選時(shí)使用將含有流感核蛋白抗原的流感HA疫苗、A型流感重組核蛋白抗原(來(lái)源于A/New Caledonia/20/99的(r-NP/H1N1)、來(lái)源于A/北九州/159/93的(r-NP/H3N2)；DDBJ/GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù))固相化了的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA法)。即，流感HA疫苗用0.1M碳酸緩沖液pH9.6稀釋至x300倍，同樣A型重組核蛋白抗原稀釋至1μg/ml的濃度，在微型培養(yǎng)板模塊(Nunc公司制)的各孔中各加入100μl，在4℃孵育一晚，固相化。其次，用含有0.1％的Tween20(商品名)的PBS(PBS-Tween)洗各孔后，加入用PBS稀釋的1％的牛血清白蛋白(BSA)300μl，在4℃封閉過(guò)夜。去除封閉液之后，加入100μl培養(yǎng)上清液，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-Tween充分洗凈后，將用含有0.2％BSA、0.2％エマルゲン985、1％蔗糖、1％KCl的0.05M磷酸緩沖液pH7.5(反應(yīng)用液)稀釋2000倍的酶標(biāo)記抗鼠Igs抗體(DAKO公司制)每孔加入100μl，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，用用PBS-Tween充分洗凈，每孔加入100μl的2，2’-連氮基-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，在室溫反應(yīng)30分鐘后，每孔加入100μl的反應(yīng)終止液，在主波長(zhǎng)415nm副波長(zhǎng)490nm下測(cè)定了顯色水平。
對(duì)于判定為陽(yáng)性的培養(yǎng)上清液，采用以流感B型重組核蛋白(B/山梨/166/98(r-NP/B)DDBJ/GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù))為抗原的ELISA進(jìn)行2次篩選，最終得到了產(chǎn)生與A型流感病毒核蛋白抗原反應(yīng)，與流感B型核蛋白抗原不反應(yīng)的抗體的雜交瘤3株(雜交瘤FVA2-3、雜交瘤FVA2-6和雜交瘤FVA2-11)。這些雜交瘤于上述專利微生物保藏中心保藏。由該雜交瘤3株得到的單克隆抗體的亞類全部是IgGI。表1表示出雜交瘤的反應(yīng)性的結(jié)果。
表1單克隆抗體的反應(yīng)性

+++，涉及實(shí)施例2單克隆抗體在Western印跡法中的反應(yīng)性使用重組抗原、流感HA疫苗(含有核蛋白抗原)、病毒液利用Western印跡法確認(rèn)了反應(yīng)性。將各試樣溶解在含有0.001M EDTA、1％SDS、5％2ME(2-巰基乙醇)、10％丙三醇、0.005％BPB(溴酚藍(lán))的0.01M Tris-HCl(pH8.0)中，在100℃加熱處理后，供電泳用。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，使用e-PAGEL10％凝膠濃度(ATTO公司制)并遵循常規(guī)方法。電泳后轉(zhuǎn)印在PVDF膜(ATTO公司制)上，用Block Ace(大日本制藥公司制)在4℃進(jìn)行封閉過(guò)夜。除掉封閉液用PBS-Tween洗凈后，加入調(diào)整成10μg/ml的濃度的單克隆抗體，室溫下反應(yīng)45分。用PBS-Tween充分洗凈后，用反應(yīng)用液稀釋至4000倍的酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗體(Cappel公司制)在室溫下反應(yīng)45分。用PBS-Tween充分洗凈后，使用ECLWestern印跡檢測(cè)系統(tǒng)(アマシヤム生命科學(xué)公司制)用X射線膜(kodak公司制)曝光1～15分鐘，檢測(cè)信號(hào)。
單克隆抗體FVA2-3、FVA2-6、FVA2-11，對(duì)于所有抗原，以55-70kD附近為中心看到了譜帶。圖1表示出此結(jié)果。
實(shí)施例3在使用單克隆抗體的ELISA抗原測(cè)定將3種純化單克隆抗體采用0.1M磷酸緩沖液pH7.5以2μg/ml的濃度向微型培養(yǎng)板模塊(Nunc公司制)的各孔中各加入100μl，在4℃孵育過(guò)夜，固相化。然后用含有0.1％Tween20(商品名)的PBS(PBS-Tween)洗凈各孔，加入300μl用PBS稀釋的1％的牛血清白蛋白(BSA)，在4℃封閉過(guò)夜。將用反應(yīng)用液稀釋的A型流感病毒液向各孔中各加入100μl，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-Tween充分洗凈后，將用反應(yīng)用液調(diào)整的3種堿性磷酸酶標(biāo)記單克隆抗體向各孔中各加入100μl，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，用PBS-Tween充分洗凈，每孔加入100μl的4-硝基苯基磷酸酯(4-NPP)，在室溫反應(yīng)30分鐘后，每孔加入100μl的反應(yīng)終止液，在主波長(zhǎng)415nm副波長(zhǎng)490nm下測(cè)定了顯色水平。陽(yáng)性定為緩沖液空白(buffer blank)的顯色水平的2.1倍以上，用變成陽(yáng)性的最終稀釋倍率表示反應(yīng)性的強(qiáng)弱。
用所得的3種單克隆抗體組合形成的全部9組中均顯示出比市場(chǎng)銷售的抗A型流感病毒單克隆抗體高2～8倍的反應(yīng)性。表2表示出此結(jié)果。
表2表2抗原測(cè)定ELISA

*市售的單克隆抗體實(shí)施例4抗A型流感病毒單克隆抗體的反應(yīng)部位的測(cè)定4-1質(zhì)粒的制備為了確定單克隆抗體FVA2-11的識(shí)別部位，將由498個(gè)氨基酸構(gòu)成的流感H1N1株(New Caledonia/20/99)用PCR法擴(kuò)增出1-159氨基酸(A片段)、162-327氨基酸(B片段)及327-498氨基酸(C片段)的3個(gè)片段。在引物上預(yù)先添加了EcoRI、BamHI位點(diǎn)。用QIAGEN公司的PCR純化試劑盒純化擴(kuò)增片段，并插入到圖2所示的表達(dá)用質(zhì)粒pW6A的NdeI-EcoRI位點(diǎn)整合了GST形成的表達(dá)用質(zhì)粒pWG6A的EcoRI-BamHI位點(diǎn)上，制備質(zhì)粒pWGInf.H1N1-A、pWGInf.H1N1-B和pWGInf.H1N1-C。用它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(獲自Brookhaven National Laboratory)，得到氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A、BL21(DE3)pWGInf.H1N1-B和BL21(DE3)pWGInf.H1N1-C。
4-2重組蛋白質(zhì)(GST+H1N1-A、GST+H1N1-B和GST+H1N1-C)的表達(dá)在2ml含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)4-1中制備的轉(zhuǎn)化體。預(yù)培養(yǎng)使600nm下的OD達(dá)到0.6-0.8之后，添加0.4mM IPTG，進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)，再培養(yǎng)3小時(shí)。將1.5ml的菌體培養(yǎng)液在5000rpm下離心分離2分鐘，收集菌體，懸浮在100μl的緩沖液(10mM Tris-鹽酸、pH8.0、0.1M氯化鈉、1mM EDTA)中，經(jīng)15分鐘的超聲波破碎，完全地破碎菌體。將其作為菌體試樣。
向8μl菌體試樣中加入3倍濃度的SDS聚丙烯酰胺緩沖液(0.15MTris-鹽酸、pH6.8、6％SDS、24％丙三醇、6mM EDTA、2％2-巰基乙醇、0.03％溴酚藍(lán))4μl，充分?jǐn)嚢韬?，進(jìn)行了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。Western印跡轉(zhuǎn)印至硝基纖維素濾膜上，利用1％BSA封閉，使采用磷酸緩沖液(10mM磷酸、pH7.4、0.15M氯化鈉)稀釋至1000倍的單克隆抗體FVA2-11反應(yīng)。再使過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白兔多克隆抗體(ダコ公司制)反應(yīng)，洗凈后添加10ml的基質(zhì)顯色液(0.01％過(guò)氧化氫水、0.6mg/ml 4-氯-1-萘酚)使之顯色。其結(jié)果確定，單克隆抗體FVA2-11只與GST+H1N1-A發(fā)生反應(yīng)。
4-3質(zhì)粒的制備其次，將流感H1N1的A片段進(jìn)一步細(xì)分，將所得到的片段A1(1～90氨基酸)、A2(85～159氨基酸)、A3(44～130氨基酸)、A4(59～103氨基酸)、A5(44～103氨基酸)、A6(59～130氨基酸)及A7(1～130氨基酸)(圖3)用PCR法擴(kuò)增。用QIAGEN公司的PCR純化試劑盒純化擴(kuò)增片段，并插入到上述表達(dá)用質(zhì)粒pWG6A的EcoRI-BamHI位點(diǎn)上，制備質(zhì)粒pWGInf.H1N1-A1、pWGInf.H1N1-A2、pWGInf.H1N1-A3、pWGInf.H1N1-A4、pWGInf.H1N1-A5、pWGInf.H1N1-A6。A7片段插入圖2所示的pW6A的EcoRI-BamHI位點(diǎn)，制備質(zhì)粒pWInf.H1N1-A7。用它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(從Brookhaven National Laboratory得到)，得到氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A1、BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A2、BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A3、BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A4、BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A5、BL21(DE3)pWGInf.H1N1-A6和BL21(DE3)pWInf.H1N1-A7。
4-4重組蛋白質(zhì)(GST+H1N1-A1、GST+H1N1-A2、GST+H1N1-A3、GST+H1N1-A4、GST+H1N1-A5、GST+H1N1-A6和H1N1-A7)的表達(dá)在2ml含有50μg/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)4-3中制備的轉(zhuǎn)化體。在預(yù)培養(yǎng)至600nm下OD為0.6-0.8之后，添加0.4mMIPTG，進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)，再培養(yǎng)3小時(shí)。將1.5ml的菌體培養(yǎng)液在5000rpm下離心分離2分鐘，收集菌體，懸浮在100μl的緩沖液(10mMTris-鹽酸、pH8.0、0.1M氯化鈉、1mM EDTA)中，經(jīng)15分鐘的超聲波破碎，完全地破碎菌體。將其作為菌體試樣。
向8μl菌體試樣中加入3倍濃度的SDS聚丙烯酰胺緩沖液(0.15MTris-鹽酸、pH6.8、6％SDS、24％丙三醇、6mM EDTA、2％2-巰基乙醇、0.03％溴酚藍(lán)、分子量標(biāo)記(117.6、113.9、81.2、60.7、47.4、36.1、25.3、19.0、14.7、6.1KD))4μl，充分?jǐn)嚢韬?，進(jìn)行了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將Western印跡轉(zhuǎn)印到硝基纖維素濾膜上，利用1％BSA封閉后，使采用磷酸緩沖液(10mM磷酸、pH7.4、0.15M氯化鈉)稀釋至1000倍的單克隆抗體FVA2-11反應(yīng)。再使過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白兔多克隆抗體(ダコ公司制)反應(yīng)，洗凈后添加10ml的基質(zhì)顯色液(0.01％過(guò)氧化氫水、0.6mg/ml 4-氯-1-萘酚)使之顯色。圖3表示出各片段。圖4表示出電泳后的CBB染色圖樣和Western印跡的結(jié)果。由以上結(jié)果知道，抗A型流感病毒單克隆抗體(FVA2-11)的識(shí)別部位是流感H1N1的氨基酸59～130區(qū)。另外，進(jìn)一步從圖5所示的A型流感亞型的核蛋白氨基酸序列預(yù)想到在氨基酸編號(hào)59-130的反應(yīng)部位具有共有序列，具有親水性結(jié)構(gòu)的例如第90-95、第111-115或第120-123等的氨基酸序列是抗原表位。
參考例1堿性磷酸酶標(biāo)記抗A型流感病毒單克隆抗體的制備將抗A型流感病毒單克隆抗體(FVA2-11)進(jìn)行胃蛋白酶處理，切斷Fc區(qū)得到F(ab’)2，其次，使用2ME(2-巰基乙醇、ナカライテスク公司制)，切斷二硫鍵，得到游離的露出了硫醇基的F(ab’)。然后偶聯(lián)引入馬來(lái)酰亞胺基的堿性磷酸酶和F(ab’)，通過(guò)凝膠過(guò)濾純化，得到堿性磷酸酶標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體。
參考例2抗B型流感病毒單克隆抗體的制備免疫原使用含有流感核蛋白抗原的流感HA疫苗(B/山梨/166/98株)或者A型流感重組核蛋白抗原(來(lái)源于A/New Caledonia/20/99的(r-NP/H1N1)、來(lái)源于A/北九州/159/93的(r-NP/H3N2)。
在免疫原中加入等量的弗氏完全佐劑(ヤトロン公司制)，完全混合后，對(duì)Balb/c小鼠以2星期間隔計(jì)4次進(jìn)行免疫。在細(xì)胞融合的3天前向小鼠腹腔內(nèi)注射免疫原，使用PEG融合小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(P3U1)。培養(yǎng)液使用HAT選擇培養(yǎng)基，在約2星期后采集培養(yǎng)上清液供篩選用。在1次篩選時(shí)使用將流感HA疫苗、流感B型重組核蛋白(r-NP/B)固相化了的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA法)。即，流感HA疫苗用0.1M碳酸緩沖液pH9.6稀釋至x300倍，同樣B型重組核蛋白抗原稀釋至1μg/ml的濃度，在微型培養(yǎng)板模塊(Nunc公司制)的各孔中各加入100μl，在4℃孵育過(guò)夜，固相化。然后用含有0.1％的Tween20(商品名)的PBS(PBS-Tween)洗凈各孔，加入300μl用PBS稀釋的1％的BSA，在4℃進(jìn)行封閉過(guò)夜。去除封閉液之后，加入100μl培養(yǎng)上清液，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-Tween充分洗凈后，將用含有0.2％BSA、0.2％エマルゲン985、1％蔗糖、1％KCl的0.05M磷酸緩沖液pH7.5(反應(yīng)用液)稀釋2000倍的酶標(biāo)記抗鼠Igs抗體(DAKO公司制)每孔加入100μl，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)后，用PBS-Tween充分洗凈，每孔加入100μl的2，2’-連氮基-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，在室溫反應(yīng)30分鐘后，每孔加入100μl的反應(yīng)終止液，在主波長(zhǎng)415nm副波長(zhǎng)490nm下測(cè)定了顯色水平。
關(guān)于判定為陽(yáng)性的培養(yǎng)上清液，采用以A型流感重組核蛋白抗原(來(lái)源于A/New Caledonia/20/99的(r-NP/H1N1)、來(lái)源于A/北九州/159/93的(r-NP/H3N2))為抗原的ELISA進(jìn)行2次篩選，最終得到產(chǎn)生與B型流感病毒核蛋白抗原反應(yīng)，與A型流感核蛋白抗原不反應(yīng)的抗體的雜交瘤3株(FrB1-03、FrB1-07、FVB2-16)。上述各個(gè)雜交瘤根據(jù)布達(dá)佩斯條約在產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心進(jìn)行了保藏，雜交瘤FrB1-03的保藏號(hào)是FERM BP-10070，雜交瘤FrB1-07的保藏號(hào)是FERM BP-10071，雜交瘤FVB2-16的保藏號(hào)是FERM BP-10069。由該雜交瘤3株得到的單克隆抗體的亞類全部是IgGI。
(單克隆抗體在Western印跡法中的反應(yīng)性)使用重組抗原、流感HA疫苗(含有核蛋白抗原)，利用Western印跡法確認(rèn)了反應(yīng)性。SDS-PAGE使用e-PAGE10％凝膠濃度(ATTO-公司制)并遵循常規(guī)方法。電泳后轉(zhuǎn)印在PVDF膜(ATTO-公司制)上，用Block Ace(大日本制藥公司制)在4℃封閉過(guò)夜。除掉封閉液用PBS-Tween洗凈后，加入調(diào)整成10μg/ml的濃度的單克隆抗體，室溫下反應(yīng)45分。用PBS-Tween充分洗凈后，用反應(yīng)用液稀釋至4000倍的酶標(biāo)記抗鼠IgG抗體(Cappel公司制)在室溫下反應(yīng)45分。用PBS-Tween充分洗凈后，使用ECLWestern印跡檢測(cè)系統(tǒng)(アマシヤム生命科學(xué)公司制)對(duì)X射線膜(kodak公司制)曝光1分鐘，檢測(cè)信號(hào)。
單克隆抗體FrB1-03、FrB1-07，在60-75kD附近看到了強(qiáng)的譜帶。
參考例3堿性磷酸酶標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體的制備使用在上述參考例3中制備的抗B型流感病毒單克隆抗體(FrB1-03)，重復(fù)進(jìn)行與上述實(shí)施例參考例1相同的處理，由此得到堿性磷酸酶標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體。
實(shí)施例5同時(shí)免疫測(cè)定A型流感病毒和B型流感病毒的器具如圖6所示，在距離寬5mm、長(zhǎng)50mm的硝基纖維素膜(ミリポア公司制)基體2的展開(kāi)液吸收區(qū)5側(cè)的末端16mm和13.5mm的位置上，分別點(diǎn)滴0.7μl含有在實(shí)施例2中制備的抗A型流感病毒抗體(FVA2-11)和在參考例2中制備的抗B型流感病毒抗體(FrB1-3)的水溶液在硝基纖維素膜上并使之干燥，作成了檢測(cè)區(qū)6a和6b。進(jìn)而，在距離基體2的展開(kāi)液吸收區(qū)5側(cè)的末端11mm的位置上點(diǎn)滴抗堿性磷酸酶抗體(ダコ公司制)并使之干燥，作成了展開(kāi)液確認(rèn)部10。接著，向基體上點(diǎn)滴5μl在參考例1中制備的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體(5μg/ml)與在參考例3中制備的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體(5μg/ml)的混合水溶液，使之干燥，作成了由酶標(biāo)記試劑墊4構(gòu)成的標(biāo)記試劑區(qū)。
在寬5mm、長(zhǎng)20mm的濾紙(ミリポア公司制)上將100μg作為基質(zhì)的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)點(diǎn)滴成寬6.1mm的線條狀，并使之干燥制展開(kāi)液墊3。將上述基體2、展開(kāi)液墊3、酶標(biāo)記試劑墊4及展開(kāi)液吸收墊5(寬10mm、長(zhǎng)20mm、厚1mm的濾紙(ミリポア公司制))固定在具有展開(kāi)液槽11的塑料殼中，制備圖7和圖8所示的同時(shí)免疫測(cè)定A型流感病毒和B型流感病毒的器具1。
參考例4同時(shí)免疫測(cè)定A型流感病毒和B型流感病毒的器具(以往方法的器具)使用在實(shí)施例3中制成的同時(shí)免疫測(cè)定A型流感病毒和B型流感病毒的器具1的檢測(cè)區(qū)6a和6b，關(guān)于堿性磷酸酶標(biāo)記抗流感病毒抗體，分別使用購(gòu)買(mǎi)的抗A型流感病毒單克隆抗體和抗B型流感病毒單克隆抗體作成，從而作成了同時(shí)免疫測(cè)定A型流感病毒和B型流感病毒的器具(エスプライン病毒A&B(富士レビオ公司制)；以往的測(cè)定器具)。
實(shí)施例6A型流感病毒和B型流感病毒的測(cè)定向在上述實(shí)施例5中制備的同時(shí)免疫測(cè)定A型流感病毒和B型流感病毒的器具1(本發(fā)明的測(cè)定器具)的樣品點(diǎn)滴區(qū)8中點(diǎn)滴表3所記載的A型流感病毒的亞型試樣(作為試樣稀釋液，使用含有表面活性劑的緩沖液(pH8.0))各30μl之后，將設(shè)置在變形構(gòu)件上的按壓部12向下方加壓使之變形，通過(guò)附設(shè)在變形構(gòu)件上的突起部13將展開(kāi)液墊3插入展開(kāi)液槽11中，向展開(kāi)液墊3供給展開(kāi)液，開(kāi)始測(cè)定。測(cè)定開(kāi)始15分鐘后，根據(jù)對(duì)象試劑區(qū)10的顯色確認(rèn)了展開(kāi)液展開(kāi)之后，通過(guò)目測(cè)測(cè)定檢測(cè)區(qū)6a和6b的顯色。表3表示出其結(jié)果。
另外，作為對(duì)照，利用在參考例4中作成的以往的測(cè)定器具對(duì)表3記載的上述試樣30μl同樣地進(jìn)行了病毒檢測(cè)。表3表示出其測(cè)定結(jié)果。
表3A型流感病毒亞型株的測(cè)定結(jié)果

*由于雞蛋未馴化，故為采用MDCK培養(yǎng)上清液得到的測(cè)定結(jié)果從結(jié)果看，關(guān)于以往的測(cè)定器具不能檢測(cè)的A型流感病毒的亞型樣品，本發(fā)明的測(cè)定器具能夠全部檢測(cè)。
實(shí)施例7使用在上述實(shí)施例5中制備的同時(shí)測(cè)定A型流感病毒和B型流感病毒的器具1(本發(fā)明的測(cè)定器具)，與實(shí)施例6同樣地調(diào)查了與腺病毒(1～7型)、柯薩奇病毒(A16、B1～B6型)、單純皰疹病毒1型、埃可病毒(3型、4型、7型、22型、30型)、腸病毒(71型)、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒(1～3型)、RS病毒(亞群A、亞群B)、副流感病毒(1～3型)、大腸桿菌、肺炎桿菌、綠膿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、表皮葡萄球菌、變形桿菌、黃色葡萄球菌、棒桿菌、白喉棒桿菌、白色念珠菌、釀膿鏈球菌、鏈球菌屬的細(xì)菌(群B、C、G、F)、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌、肺炎支原體、沙眼衣原體、肺炎衣原體的交叉反應(yīng)性。其結(jié)果，與其中的任何病毒或菌都不反應(yīng)。
序列表<110>FUJIREBIO INC.
<120>抗A型流感病毒單克隆抗體及使用該抗體的免疫測(cè)定器具<130>04PF0292-PCT<150>JP2003-278527<151>2003-07-23<150>JP2003-364316<151>2003-10-24<150>JP2004-109763<151>2004-04-02<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>82<212>PRT<213>A型流感病毒H10N7<400>1Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg1 5 10 15Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys20 25 30Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Met Arg35 40 45Glu Leu Thr Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Glu50 55 60
Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile65 70 75 80Trp His<210>2<211>82<212>PRT<213>A型流感病毒H11N6<400>2Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg1 5 10 15Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys20 25 30Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg35 40 45Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln50 55 60Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile65 70 75 80Trp His<210>3<211>82<212>PRT<213>A型流感病毒H13N6
<400>3Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg1 5 10 15Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Thr Gly Arg Asp Pro Lys20 25 30Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg35 40 45Glu Leu Val Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Glu50 55 60Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile65 70 75 80Trp His<210>4<211>82<212>PRT<213>A型流感病毒H14N5<400>4Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg1 5 10 15Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys20 25 30Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Met Arg35 40 45
Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln50 55 60Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile65 70 75 80Trp His<210>5<211>82<212>PRT<213>A型流感病毒H1N1<400>5Asn Ser Leu Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg1 5 10 15Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys20 25 30Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg35 40 45Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Glu50 55 60Ala Asn Asn Gly Asp Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile65 70 75 80Trp His
<210>6<211>82<212>PRT<213>A型流感病毒H2N2<400>6Asn Ser Leu Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg1 5 10 15Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys20 25 30Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Lys Arg Val Asn Gly Lys Trp Met Arg35 40 45Glu Leu Val Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln50 55 60Ala Asn Asn Gly Asp Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile65 70 75 80Trp His<210>7<211>82<212>PRT<213>A型流感病毒H4N6<400>7Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Leu Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg1 5 10 15Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys20 25 30
Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Val Arg35 40 45Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln50 55 60Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile65 70 75 80Trp His<210>8<211>82<212>PRT<213>A型流感病毒H7N7<400>8Asn Ser Ile Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg1 5 10 15Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys20 25 30Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr Arg Arg Arg Asp Gly Lys Trp Met Arg35 40 45Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln50 55 60Ala Asn Asn Gly Glu Asp Ala Thr Ala Gly Leu Thr His Leu Met Ile65 70 75 80
Trp His
權(quán)利要求
1.一種抗A型流感病毒單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，其與A型流感病毒的分子量55-70kD的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，與B型流感病毒基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，其與A型流感病毒核蛋白的氨基酸序列59～130位的氨基酸區(qū)域的抗原表位發(fā)生反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，其與A型流感病毒的各亞型病毒發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或其抗原結(jié)合性片段，其由根據(jù)布達(dá)佩斯條約以保藏號(hào)為FERM BP-10066的進(jìn)行了國(guó)際保藏的雜交瘤FVA2-3、以保藏號(hào)為FERM BP-10067的進(jìn)行了國(guó)際保藏的雜交瘤FVA2-6或者以保藏號(hào)為FERM BP-10068的進(jìn)行了國(guó)際保藏的雜交瘤FVA2-11產(chǎn)生。
5.一種免疫測(cè)定器具，該器具是在基體上設(shè)置了具有可移動(dòng)的標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體的標(biāo)記試劑區(qū)、樣品點(diǎn)滴區(qū)、展開(kāi)液供給區(qū)、展開(kāi)液吸收區(qū)及將抗A型流感病毒抗體固定在基體上的A型流感病毒檢測(cè)區(qū)的器具，上述標(biāo)記的抗A型流感病毒抗體及固定在檢測(cè)區(qū)中的抗A型流感病毒抗體的至少一種抗體是權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫測(cè)定器具，其中，在標(biāo)記試劑區(qū)中還進(jìn)一步含有標(biāo)記的抗B型流感病毒抗體，且在固定了A型流感病毒單克隆抗體的A型流感病毒檢測(cè)區(qū)的近旁還進(jìn)一步具有固定了B型流感病毒單克隆抗體的B型流感病毒檢測(cè)區(qū)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的免疫測(cè)定器具，其中，標(biāo)記物是酶，在展開(kāi)液中和/或展開(kāi)液供給區(qū)的近旁含有針對(duì)酶的基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了特異性高的抗A型流感病毒單克隆抗體及使用了該抗體的、能特異地檢測(cè)出A型流感病毒的免疫測(cè)定器具。本發(fā)明的抗A型流感病毒單克隆抗體，與A型流感病毒的分子量55－70kD的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，與B型流感病毒基本上不發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1934133SQ20048002117
公開(kāi)日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2004年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月23日
發(fā)明者安住純一, 山田崇, 本多智惠, 藤井信之 申請(qǐng)人:富士瑞必歐株式會(huì)社