專利名稱：：以離子液體作為綠色介質(zhì)制備生物傳感器的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種傳感器的制備方法，尤其是指一種以離子液體作為綠色介質(zhì)制備生物傳感器的方法。技術(shù)背景生物傳感器是以固定化的生物成分(酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等)或生物體本身(細(xì)胞、微生物、組織等)為敏感材料，與適當(dāng)化學(xué)換能器相結(jié)合產(chǎn)生一種快速檢測(cè)物理、化學(xué)和生物量的器件。生物傳感器誘人的應(yīng)用前景，使它迅速成為現(xiàn)代分析化學(xué)的研究熱點(diǎn)，并在環(huán)境、生物、醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域的快速檢測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。制作生物傳感器的核心工作是酶固定化，傳統(tǒng)的固定化方法有吸附法，包埋法、交聯(lián)法和共價(jià)結(jié)合法，它們最大的缺點(diǎn)是導(dǎo)致酶活性的大幅度下降。為了克服這一不足，近年來(lái)人們嘗試采用一些親生物材料作載體如聚L-酪氮酸(謝軼，袁若，柴雅琴，高鳳仙，唐明宇，分析試驗(yàn)室，2007，26(9):1)、過(guò)氧化聚吡咯膜(蔣曉華，劉偉強(qiáng)，陳建軍，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(3):450)和聚乙烯(JiangY,WangAY,KanJQ,SensorsandActuatorsB,2007,124:529)等。盡管，這些親生物材料對(duì)改善電極穩(wěn)定性和導(dǎo)電性起到了一定作用，但它們難以為酶的催化作用提供最佳微環(huán)境。近年來(lái)，一種新型綠色溶劑一室溫離子液體引起人們的極大興趣，已在分析化學(xué)獲得廣泛應(yīng)用(AndersonJL,ArmstrongDW，WeiGT,AnalyticalChemistry,2007,79(11):4247;RizviSAA，ShamsiSA，AnalyticalChemistry,2006，78(19):7061)。大量事實(shí)表明離子液體與酶、底物和其他親生物材料配伍性好，可顯著提高酶的活性和穩(wěn)定性，這些特性為離子液體替代傳統(tǒng)粘合劑或高分子村料作為生物傳感器介質(zhì)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)(LeeJK,KimMJ,JournalofOrganicChemistry,2002,67:6845;MaminskaR，DybkoA,WroblewskiW,SensorsandActuatorsB,2006,115:552;LesniewskiA,NiedziolkaJ,PalysB，RizziC,GaillonL,OpalloM,ElectrochemistryCommunication,2007，9:2580)。最近，中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所劉洋等公開了有關(guān)離子液體溶膠-凝膠復(fù)合膜包埋酶生物傳感器的方法(中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?00410011340.0和200610017201.8)。然而，傳統(tǒng)的1_烷基_3_甲基咪唑類離子液體咪唑環(huán)2_位氫原子較為活潑，易被氧化，導(dǎo)致電化學(xué)窗口變窄，限制了它們?cè)谏飩鞲衅骷捌湎嚓P(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種以離子液體作為綠色介質(zhì)制備生物傳感器的方法。所得到的生物傳感器所基體峰電流小，響應(yīng)快和穩(wěn)定性好。電極中包埋的酶無(wú)流失，具有較長(zhǎng)使用壽命。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下(1)離子液體的純化，50~100g離子液體粗品溶于200~1000mL丙酮，過(guò)濾除去無(wú)機(jī)鹽；分別用50~250g超細(xì)活性炭和色譜級(jí)氧化鋁脫色處理，過(guò)濾得無(wú)色溶液；濾液經(jīng)減壓蒸餾除去丙酮、水和有機(jī)原料制備出無(wú)色、透明的油狀液體；(2)酶的包埋，在100~200mL磷酸緩沖溶液(0.1~0.5mol/L，pH7~7.5)中，加入3050mg酶，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?；向上述溶液中?015mL按(1)方法純化的離子液體，再劇烈攪拌2小時(shí)(2500轉(zhuǎn)/分)，然后靜置分層，棄去水相，收集下層的離子液體；(3)生物傳感器制備，將0.10.2mL按(2)方法制得的離子液體包埋液注入聚丙烯管(^25mm)中，管子下端用改性纖維素膜封住(孔徑0.1~0.15pm)，從上端插入一鉑絲(pl1.2mm)至離聚丙烯管底部0.2-0.5cm處，上端用導(dǎo)電膠封位制成生物傳感器。在包埋時(shí)，把酶先溶解在pH為7.0~7.5的磷酸緩沖溶液中，再通過(guò)萃取過(guò)程將其均勻包埋于離子液體之中。所述的酶是過(guò)氧化氫酶、辣根過(guò)氧化酶、葡萄糖氧化酶、脫氫酶或多酚氧化酶中的一種。所采用的離子液體是具有l(wèi)-烷基-2,3-甲基咪唑結(jié)構(gòu)的離子液體，其陽(yáng)離子中的烷基包括碳原子在212之間的各種烷基，陰離子包括PF6—和N(CF3)2—。對(duì)純化后的離子液體在400-800nm之間進(jìn)行光譜掃描時(shí)無(wú)明顯的吸收峰，表明離子液體中的有色化合物已除去；再將離子液體在25030(TC、低于0.01MPa的真空條件下加熱12小時(shí)，采取1200LGC/MS-MS氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析浮于離子液體上方的成分，結(jié)果沒(méi)有明顯低沸點(diǎn)化合物檢出。由于l-垸基-2，3-甲基咪唑結(jié)構(gòu)的離子液體中咪唑環(huán)2-位氫原子被惰性的甲基所取代，提高了離子液體的電化學(xué)穩(wěn)定性，使所制備的電極具有寬的電化學(xué)窗口，從而消除了在檢測(cè)過(guò)程中因電極材料本身的氧化-還原引起的干擾，擴(kuò)大了電極的應(yīng)用范圍。然而，電化學(xué)研究對(duì)所使用材料純度有嚴(yán)格要求，按現(xiàn)有方法合成的離子液體不能滿足需要。離子液體中主要的雜質(zhì)成分來(lái)自于原料不純和反應(yīng)過(guò)程中的氧化而產(chǎn)生有色化合物。前者可選用高純?cè)虾驮谑褂们爸卣艏右越鉀Q，后者因離子液體粘度大，采用常規(guī)的脫色方法難以去除，成為離子液體純化中的難點(diǎn)(EarleMJ,GordonCM,PlechkovaNV，SeddonKR,WeltonT，AnalyticalChemistry,2007,79(11):4247)，但在離子液體加入適當(dāng)稀釋劑大幅度降低其粘度，上述問(wèn)題就容易解決。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)是1、電化學(xué)窗口寬，所采用的l-烷基-2，3-甲基咪唑結(jié)構(gòu)的離子液體，其陽(yáng)離子咪唑環(huán)上2-位氫原子被甲基取代，從根本上消除了該氫原子的電離或氧化；陰離子部分采用電化學(xué)惰性的PF「和N(CF3)2'，此類離子液體具有非常理想的穩(wěn)定性，電化學(xué)窗口均大于4V。以上性質(zhì)不僅避免了在檢測(cè)過(guò)程中因介質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)導(dǎo)致的干擾，而且大大擴(kuò)展了生物傳感器的應(yīng)用范圍。2、基體電流小，由于離子液體本身是導(dǎo)電的，可以作為導(dǎo)電介質(zhì)。本發(fā)明采用的離子液體具有良好的穩(wěn)定性，其充電電流僅僅在數(shù)nA范圍內(nèi)(見圖l)，遠(yuǎn)小于現(xiàn)在普遍采用的炭糊電極(在mA級(jí))?；w電流小，有利于降低檢測(cè)過(guò)程中的基體干擾和檢出限。3、使用壽命長(zhǎng)，所采用的離子液體具有良好的親生物性，大大改善了酶的活性和穩(wěn)定性。本發(fā)明所制作的生物傳感器保持一年后測(cè)定其電化學(xué)性質(zhì)，其數(shù)據(jù)基本不變。圖1是l-戊基-2,3-二甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體膜空白電極循環(huán)伏安圖。具體實(shí)施方式(1)離子液體的純化50gl-戊基-2,3-甲基咪唑類離子液體粗品溶于200mL丙酮，過(guò)濾除去無(wú)機(jī)鹽。分別用50g超細(xì)活性炭和色譜級(jí)氧化鋁脫色處理4小時(shí)，過(guò)濾得無(wú)色溶液。濾液經(jīng)減壓蒸餾除去丙酮、水和有機(jī)原料制備出無(wú)色、透明的油狀液體。(2)過(guò)氧化氫酶的包埋在100mL磷酸緩沖溶液(0.1mol/L，pH7)中，加入30mg過(guò)氧化氫酶，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?。向上述溶液中?0mL純化的離子液體，再劇烈攪拌2小時(shí)(2500轉(zhuǎn)/分)，然后，靜置分層，棄去水相，收集下層的離子液體。(3)過(guò)氧化氫生物傳感器的制備將0.1mL離子液體包埋液注入聚丙烯管O2mm)中，管子下端用改性纖維素膜封住(孔徑0.1pm)，從上端抽入一鉑絲Olmm)至離底部0.5cm處，然后，上端用導(dǎo)電膠封位制成生物傳感器。(4)電化學(xué)檢測(cè)方法采用三電極體系(過(guò)氧化氫生物傳感器為工作電極，Pt絲電極為輔^電極和Ag/AgCl標(biāo)準(zhǔn)電極為參比電極)，以0.1mol/L的Na2HPO412H2O-KH2P04緩沖溶液(pH7)為測(cè)試底液，通入高純氮?dú)獬ト芙庋鯕?，在電化學(xué)工作站上測(cè)定體系的循環(huán)伏安圖(CV)。CV還原峰電流值隨過(guò)氧化氫濃度的增加而線性減少，以此進(jìn)行過(guò)氧化氫濃度的測(cè)定。(5)分析特性以l-戊基-2,3-二甲基咪唑六氟磷酸鹽/酶電極為工作電極，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行CV分析。從CV圖中我們可以清楚地看出還原峰電流隨底液中過(guò)氧化氫濃度的增加而增大，且當(dāng)過(guò)氧化氫濃度在3.1712.4^mol/L范圍呈線性關(guān)系，其線性方程為y=-1.6776x-1.5577，R2=0.9979。其中，y為電極還原峰電流值(pA)，x為底液中過(guò)氧化氫濃度(mol/L)，檢出限為l.lxlO—Vol/L。該酶電極測(cè)定過(guò)氧化氫的響應(yīng)電流在5s以內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定。在4"C酶電極保存30天后測(cè)定其電化學(xué)性能沒(méi)有明顯變化。此外，酶電極有較好的選擇性。在測(cè)定水中l(wèi)x10—Smol/L過(guò)氧化氫時(shí)，1000倍以上的C^+和Mg2、以及5倍濃度的抗壞血酸、葡萄糖、檸檬酸、乙醇、乙酸和多巴胺不產(chǎn)生干擾，這可能與離子液體的選擇性萃取有關(guān)。(6)環(huán)境水樣中痕量過(guò)氧化氫的測(cè)定過(guò)氧化氫生物傳感器己應(yīng)用于環(huán)境水樣中過(guò)氧化氫的測(cè)定，結(jié)果列于表l。過(guò)氧化氫的回收率在95.3-100.8%范圍內(nèi)，這顯示方法具有較好的準(zhǔn)確性。表l:環(huán)境水樣中過(guò)氧化氫的測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權(quán)利要求1、一種以離子液體作為綠色介質(zhì)制備生物傳感器的方法，其主要步驟為(1)離子液體的純化，50～100g離子液體粗品溶于200～1000mL丙酮，過(guò)濾除去無(wú)機(jī)鹽；分別用50～250g超細(xì)活性炭和色譜級(jí)氧化鋁脫色處理，過(guò)濾得無(wú)色溶液；濾液經(jīng)減壓蒸餾除去丙酮、水和有機(jī)原料制備出無(wú)色、透明的油狀液體；(2)酶的包埋，在100～200mL磷酸緩沖溶液(0.1～0.5mol/L，pH7～7.5)中，加入30～50mg酶，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?；向上述溶液中?0～15mL按(1)方法純化的離子液體，再劇烈攪拌2小時(shí)(2500轉(zhuǎn)/分)，然后靜置分層，棄去水相，收集下層的離子液體；(3)生物傳感器的制備，將0.1～0.2mL按(2)方法制得的離子液體包埋液注入聚丙烯管(2～5mm)中，管子下端用改性纖維素膜封住(孔徑0.1～0.15μm)，從上端插入一鉑絲(1～1.2mm)至離聚丙烯管底部0.2-0.5cm處，上端用導(dǎo)電膠封位制成生物傳感器。2、如權(quán)利1要求所述以離子液體作為綠色介質(zhì)制備生物傳感器的方法，其特征在于，在包埋時(shí)，把酶先溶解在pH為7.07.5的磷酸緩沖溶液中，再通過(guò)萃取過(guò)程將其均勻包埋于離子液體之中。3、如權(quán)利1要求所述以離子液體作為綠色介質(zhì)制備生物傳感器的方法，其特征在于，所述的酶是過(guò)氧化氫酶、辣根過(guò)氧化酶、葡萄糖氧化酶、脫氫酶或多酚氧化酶中的一種。4、如權(quán)利1要求所述以離子液體作為綠色介質(zhì)制備生物傳感器的方法，其特征在于，所采用的離子液體是具有l(wèi)-垸基-2,3-甲基咪唑結(jié)構(gòu)的離子液體，其陽(yáng)離子中的烷基包括碳原子在212之間的各種烷基，陰離子包括PF6—和N(CF3)2—。5、如權(quán)利1要求所述以離子液體作為綠色介質(zhì)制備生物傳感器的方法，其特征在于，對(duì)純化后的離子液體在400-800nm之間進(jìn)行光譜掃描時(shí)無(wú)明顯的吸收峰；再將離子液體在250~300°C、低于O.OlMPa的真空條件下加熱12小時(shí)，采取1200LGC/MS-MS氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析浮于離子液體上方的成分，結(jié)果沒(méi)有明顯低沸點(diǎn)化合物檢出<=全文摘要本發(fā)明公開一種以離子液體作為綠色介質(zhì)的生物傳感器制備方法，其主要步驟為(1)離子液體純化，將離子液體粗品溶于200mL丙酮中，過(guò)濾除去無(wú)機(jī)鹽。(2)酶的包埋。在100mL磷酸緩沖溶液中，加入30mg酶，充分?jǐn)嚢枋蛊渫耆芙?。向上述溶液中?0mL按(1)方法純化的離子液體，再劇烈攪拌2小時(shí)(2500轉(zhuǎn)/分)，靜置分層，棄去水相，收集下層的離子液體。(3)生物傳感器制備。將0.1mL按(2)方法制得的離子液體包埋液注入聚丙烯管中，管子下端用改性纖維素膜封住，從上端抽入一鉑絲至離底部0.5cm處，上端用導(dǎo)電膠封位制成生物傳感器。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，所得生物傳感器電化學(xué)窗口寬大于4V，基體峰電流僅數(shù)nA，電化學(xué)響應(yīng)快，且穩(wěn)定性好。文檔編號(hào)G01N27/327GK101231260SQ20081001849公開日2008年7月30日申請(qǐng)日期2008年2月15日優(yōu)先權(quán)日2008年2月15日發(fā)明者任國(guó)曉,孫秀蘭,彭齊萍,方銀軍,李在均,黃亞茹申請(qǐng)人:江南大學(xué);浙江贊宇科技股份有限公司