專利名稱：膠體金層析法半定量檢測2,4-d的試紙條及其制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于免疫化學檢測技術(shù)，具體來講，是一種借助膠體金顯色的免疫層析反應，用以快速檢測農(nóng) 產(chǎn)品、水、土壤中的2,4-D農(nóng)藥殘留。
技術(shù)背景2， 4-D是在生產(chǎn)上廣泛使用的除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑，其在農(nóng)產(chǎn)品、水和土壤中的殘留危害不容忽 視，如其在土壤、水中殘留超標，易引起棉花、某些蔬菜、林木的毒害，對人類的健康造成較大危害，據(jù) 報道，2, 4-D具潛在的致癌性、致突變性，是一種內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，對免疫系統(tǒng)和生育系統(tǒng)具不良影響， 人體攝入吸收后對眼睛、皮膚也有刺激作用，反復接觸后對肝、心臟有損害作用，能引起驚厥等。鑒于此， 有些國家和世界組織都在環(huán)境標準中對2， 4-D做出了嚴格的規(guī)定，世界衛(wèi)生組織2003年8月頒布《飲用 水水質(zhì)指南》，規(guī)定飲用水中2， 4-D的最大檢出濃度30ug/1，我國2001年頒布的《飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》 的非常規(guī)檢測項目中，將2, 4-D的限制規(guī)定為0.03mgZl。迄今為止，對其殘留量的常規(guī)檢測分析主要是利 用氣相色譜(GC)和髙效液相色譜(HPLC)等儀器在試驗室操作，方法繁瑣、分析速度慢、成本髙，耍 求儀器化程度髙等。隨著待檢樣品、特別是要求現(xiàn)場快速檢測樣品量的迅速增加，傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析手 段難以適應要求，因此，迫切需要開發(fā)和應用髙效率農(nóng)藥殘留分析技術(shù)。通過大量資料檢索，注意到2，4-二氯苯氧乙酸完全抗原和抗體的制備(中國環(huán)境科學，2005, 25 (3): 288~292)，所列文獻合成了 2， 4-D人工免疫抗原，并將該人工免疫抗原免疫家兔制備多克隆抗體，在此 基礎上建立了間接酶聯(lián)免疫吸附測定檢測2， 4-D農(nóng)藥殘留的技術(shù)。該技術(shù)較CG、 HPLC有較大革新，使 檢測時間縮短、成本大大降低，靈敏度提高，有利于在食品、土壤、水和環(huán)境中2, 4-D農(nóng)藥殘留的快速 檢測并推廣應用，但其方法還存在操作相對繁瑣、需重復多次洗錄，需借助酶標儀讀數(shù)等，不能實現(xiàn)真正 意義上的一步法快速澳!l定。還有Investigation of highly sensitive piezoelectric immunosensors for 2，4-dichorophe加野acetic acid. Bio郷.& Bioelectro. 2001,16:253-260. (2,4-D高靈敏度的壓電式免疫傳感器 的研究，生物傳感器與生物電學，2001,16,253-260)，生物傳感器是一種以生物活性單元為敏感元件,結(jié)合 化學、物理轉(zhuǎn)換元件，對被分析物具有髙度選擇性的儀器,農(nóng)藥殘留分析時靈敏度髙，該法在即時檢驗領域 可發(fā)揮很大作用，但因為該法仍需一定的儀器設備條件，不易進一步降低檢測成本。膠體金免疫層析技術(shù)是近些年來發(fā)展起來的一種簡單、快速免疫學檢測方法，具靈敏、簡便、快速、 無需設備和儀器、經(jīng)濟實用、具高度特異性和敏感性、結(jié)果直觀可靠、試劑和樣品用量極少、不需專業(yè)人 員操作，易于推廣使用，正可以滿足這種需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種2， 4-D農(nóng)藥免疫膠體金標記測定方法，改變2， 4-D
農(nóng)藥殘留多步繁瑣檢測問題，實現(xiàn)廉價、 一步法快速檢測2,4-D農(nóng)藥殘留的方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決技術(shù)問題，以改良EDC法將2,4-D半抗原2,4-DB與BSA偶聯(lián)，即EDC 介導的縮合反應，在Sulf-NHS同時存在時，效率大大提髙；合成人工免疫抗原2,4-DB"BSA，免疫BALB/c 小鼠或新西蘭雄白兔，制備特異性髙效價抗2，4-D抗體，抗體經(jīng)分離純化后，將納米級的膠體金顆粒標記 于抗2， 4-D的特異性抗體上，并將此標記物、偶聯(lián)卵清蛋白的2,4-D包被原、以及羊抗鼠(兔)IgG分別 固化在同一載體上，根據(jù)競爭抑制免疫層析原理，進行2,4-D農(nóng)藥的半定量分析測定，建立的檢測體系對 2，4-D農(nóng)藥的最小檢測量為21ug/l,且在10分鐘內(nèi)完成，方法簡單、準確、穩(wěn)定，是真正意義上的一步 法農(nóng)藥殘留快速測定。以下是本發(fā)明的具體實施步驟(1) 半抗原的選擇制備2,4-D抗體可方便選擇2，4-D或2， 4-DB為半抗原，但通過比較，2,4-DB為半抗原較2， 4-D做半 抗原更具科學性，因2， 4-DB分子結(jié)構(gòu)與2， 4-D結(jié)構(gòu)類似，都具類似苯環(huán)的管能團和做為活性基團的羧基， 二者由一定碳鏈長度的間隔臂組成，2， 4-DB較2,4-D天然具有較K碳鏈間隔臂(增加2個碳的碳鏈長)， 更易使^抗原的分子獨特部位暴露(即突出抗原決定簇)而增強免疫性，因此本項選擇2,4-DB為合成人 工免疫抗原的半抗原，而為了提髙檢測靈敏度，人工包被抗原合成選擇的半抗原為2，4-D。(2) 人工抗原的合成選擇2,4-DB為2,4-D抗體制備的半抗原，牛血清白蛋白(BSA)為載體蛋白，然后通過改良EDC法合 成人工抗原2， 4-DB~BSA。稱取2,4-DB 60mg,加入0.05M PB(PH 11以上)，攪拌使其緩慢溶解，之后調(diào) 節(jié)PH值至7.2左右，加入60mg sulf-NHS，充分混合，再加入EDC，再加入90mgEDC,攪勻，靜置片刻，并將 此反應液1小時內(nèi)緩慢滴加到事先配好的60mg 9ml BSA溶液中，并4TC下攪拌反應過夜，0.15M NaCl液 透析3天，5-6次左右，紫外分光光度計測紫外法測定和計算偶聯(lián)物的結(jié)合比，得到適當結(jié)合比的 2，4-DB-BSA偶聯(lián)物，-201C下凍存。制備人工免疫抗原過程中，同時進行人工包被抗原的合成，以2，4-D 為半抗原，卵淸蛋白OVA為載體蛋白，改良EDC法合成包被抗原2，4-D-OVA。(3) 動物免疫試驗制備2，4-D的特異性抗體獲得的人工抗原(偶聯(lián)物)免疫BALB/c小鼠或新西蘭白雄兔。免疫BALB/c小鼠采用腹部皮下注射，初次免疫劑量300ug/鼠，與佛氏完全佐劑等量混合充分乳化，加強免疫時劑量為首免的1/4，與等量不完 全佐劑混合充分乳化后注射，上下2次免疫間隔2-3周。采用ELISA法檢測抗血清效價，待抗血清效價達 一定值后，再加強一次。通過外科手術(shù)取免疫鼠脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞系P3/X63-Ag8融合，HAT篩選 并克隆化，篩選出能穩(wěn)定分泌抗2,4-D單克隆抗體的細胞株，該細胞株注入小鼠腹腔，取腹水制備單抗。 分離純化抗體，然后用ELISA法做抗體效價和親合性、特異性的測定。若免疫新西蘭白兔，采用背部皮下多點法注射。初次免疫人工抗原與等量佛氏完全佐劑充分乳化，加 強免疫與等量不完全佐劑乳化，初次免疫的免疫劑量為0. 9mg/兔，加強免疫的免疫劑量為0.45mg/兔，每
次免疫時間間隔為2周，共免疫6次，最后一次免疫后10天采血收集血清，以ELISA法測定抗血清的效 價，待抗血清達到一定效價后，采取兔心臟采血法獲取血液，析出抗血清加入0.01%硫柳汞，分裝后于-20 X:凍存，或獲得的抗血清立即分離純化抗體，然后用ELISA做抗體效價和親合性、特異性的測定。(4) 納米膠體金顆粒的制備純水溶解氯金酸使其終濃度為0.01*。煮沸后每100ml加入1%擰槺酸三鈉水溶液3ml，繼續(xù)煮沸3min。 待冷卻后用0. 2M的K2C03調(diào)至PH 8. 2。冷卻后41C保存?zhèn)溆?，取樣進行透射電鏡觀察粒子大小。(5) 免疫膠體金的制備在磁力攪拌下，將1.4mg純化的抗2,4-D特異性抗體IgG,快速攪拌下加入上述100ml膠體金溶液中， 室溫攪拌30rain后，加10%牛血清白蛋白4ml，再攪拌5rain,加l諷聚乙二醇(PEG2000)2ml (終濃度為0. 2%)， 室溫下攪拌5rain, 12000r諷離心50min，吸去上清后所得沉淀即為純化的金標記抗體，將其貯存于保存液 中，41C冰箱中保存。(6) 金標墊的制備由保存液稀釋金標抗體至工作濃度，按50ul/cn^的量均勻噴涂于玻璃纖維素膜上，并由此確定單位面 積上附著金標抗體的量，使其與下步處理硝酸纖維素膜上4條檢測條線包被原的量剛好完全中和，-201C 凍存，冷凍真空干燥后，密封保存。(7) 硝酸纖維素膜的處理硝酸纖維膜上用微量點膜頭將2，4-D^OVA包被原固相化噴涂檢測區(qū)內(nèi)4條檢測線，每條檢測線寬度 l-1.5mm，在0.5cm寬的試紙條上點樣量為25ul，各條帶間隔2mm,如圖所示自左至右依次為第1、 2、 3、 4線，4條線中2，4-DB~OVA偶聯(lián)物溶液濃度按照4、 3、 2、 1的次序依次遞增，點樣液濃度依次為60ng/ml、 600ng/ml、 6ug/ml、 60ug/ml。且1、 2、 3、 4檢測線上包被原的總量剛好可與金標墊上的金標抗體完全中 和。羊抗兔IgG (或羊抗鼠IgG) 1. Omg/ml噴涂于硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線。用含1%BSA、 0. 5%Tween-20 的PBS封閉30min,洗滌3次，自然風干。(8) 膠體金免疫層析試紙條的制備由底板、吸水濾紙、硝酸纖維膜、抗2，4-D抗體的金標墊、樣品吸收墊組成(如圖)。底板中部為作為 實驗反應區(qū)的硝酸纖維素膜，其上有含4條涂有2，4"D~OVA偶聯(lián)物線的檢測區(qū)和一條指示試紙條質(zhì)量的 質(zhì)控帶C,最左側(cè)為樣品區(qū)，底板另一端頭為吸水濾紙，硝酸纖維素膜二端分別與吸水濾紙和抗體金標墊 相互交疊連接，在抗體金標墊上壓有作為樣品吸收區(qū)的玻璃纖維膜，這4部分均貼附于白色雙面膠塑料底 板上。用切條機將已粘貼好的免疫層析試紙沿縱向切成5咖X60咖的試紙條。(9) 樣品測試和結(jié)果判讀將試紙條樣品吸收墊插入待測樣品中，停留5秒后取出平放，10分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷方法是 通過顯示于免疫層析膜上的條紋數(shù)量，來判定待檢樣品中2，4-D的含量。當樣品中不含2，4-D時，玻璃纖維膜上的膠體金-抗2，4-D抗體量剛可使硝酸纖維素膜上4條檢測線顯色，質(zhì)控線也顯色當樣品中2,4-D為低含量時(2I-100ng/hil),檢測線l、 2、 3和質(zhì)控線顯色、檢測線4不顯色樣品中2，4-D為中低含it 時(200"600ng/ml),檢測線1、 2和質(zhì)控線顯色，第3、 4條檢測線不顯色；樣品中2,4-D為中度含量時 (l-6mg/ml)，檢測線l和質(zhì)控線顯色，檢測線2、 3、 4不顯色；樣品中2,4-D為髙度含量時(W0mg/1)，檢 測線l、 2、 3、 4均不顯色，只質(zhì)控線顯色。本發(fā)明具有實質(zhì)性特點和顯著進步，主要表現(xiàn)為反應操作簡便，靈敏度髙而穩(wěn)定、產(chǎn)品易丁-保存，不 需繁煩的洗滌環(huán)節(jié)，檢測速度快，整個反應在10分鐘內(nèi)完成，真正達到一步法快速檢測樣品中待測農(nóng)藥 是否超標目的。
具體實施例方式
實施例l采用改良EDC法合成2,4-D免疫用人工抗原，以2,4-DB為半抗原，牛血清白蛋白(BSA)為載體蛋白， 稱取2， 4-DB 60mg，加入0.05M PB(HI 11以上)，攪拌使其緩慢溶解，之后調(diào)節(jié)冊值至7. 2左右，加入 60mg sulf-NHS,充分混合，靜置5min，再加入90邁g EDC，攪勻，靜置5min,該反應液1小時內(nèi)緩慢滴加到 60mg 9ml的BSA溶液中，并4X:下攪拌反應過夜，接著用0.15M NaCl液透析5-6次，8小時/次，之后采 用光譜測定法偶聯(lián)物的結(jié)合比，得到結(jié)合比為1: 24的2,4-DB"BSA偶聯(lián)物，分裝凍存于-201C冰箱中。 制備人工抗原過程中，同時進行包被抗原的合成，方法為以2，4-D60mg代替2，4-DB,按同樣方法與60mg 9ml的OVA溶液反應，合成包被抗原2， 4-D~0VA。獲得的人工抗原2,4-DB-BSA免疫10周齡的BALB/c小鼠，初次免疫用等量的佛氏完全佐劑乳化人工 抗原，進行腹部皮下注射，抗原劑量為300ug,然后以佛氏不完全佐劑乳化人工抗原，劑量約為首次劑量的 1/4,進行6次加強免疫，每次間隔2-3周，采用ELISA法檢測抗血清效價，待抗血淸效價達到一定的值 后，再加強一次，3天后外科手術(shù)取免疫鼠脾細胞，與小鼠骨髓瘤細胞系P3/X63-Ag8融合，HAT篩選并進 行克隆化，篩選出能穩(wěn)定分泌抗2,4-D單克隆抗體的細胞株，該細胞株注入小鼠腹腔，取腹水制備單抗， 分離純化，然后用ELISA法做抗體效價和抗體親合性、特異性的測定。取700ug純化單克隆抗體，邊攪拌邊注入預先制備的30咖大小的膠體金溶液100ml (PH8.2)中,室 溫瑰拌30min,力H 10%BSA攪5min，加10% PEG2000 2ml，攪拌5min, 12000rpm離心50min，吸去上淸，沉 淀即為純化的金標記抗體。由保存液稀釋金標抗體至工作濃度，按50ul/cn^的量均勻噴涂于玻璃纖維素膜 上，并由此確定單位面積上附著金標抗體的量，使其與處理過硝酸纖維素膜上4條檢測條線包被原的量剛 好完全中和。-20TC凍存，冷凍真空干燥后，密封保存。將2，4-DB~0VA偶聯(lián)物噴涂于硝酸纖維素膜檢測 區(qū)內(nèi)的4條檢測線上，每線寬0.5cm,點樣量25ul，各條帶間隔2咖，自左至右依次為第1、 2、 3、 4線， 2,4-D包被原溶液濃度按4、 3、 2、 1的次序遞增，點樣液濃度依次為60ng/ml、 600ng/ml、 6ug/ml、 60ug/ml, 且4條檢測線上包被原的總量剛好可與金標墊上的金標記抗體完全中和。羊抗鼠IgG l.Omg/ml噴涂于質(zhì)控線上。然后將玻璃纖維素膜、已固定金標記抗2,4-D抗體的玻璃纖維素膜、已平行包被2,4-1>~0￥&偶
聯(lián)物和羊抗兔lgG抗體的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼到50mmX240mm單面膠PVC板上。用切條機將其 沿縱向切成5mmX60mm的試紙條。測定樣品時，將試紙條樣品吸收墊插入待測樣品中，停留5秒后取出平放，5分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果 判斷方法是通過顯示于免疫層析膜上的條紋數(shù)量，來判定待檢樣品中2，4-D的含量。當樣品中不含2，4-D 時，玻璃纖維膜上的膠體金-抗2，4-D抗體量剛可使硝酸纖維素膜上4條檢測線顯色，質(zhì)控線也顯色當樣 品中2，4-D為低含量時(21-100ng/ml)，檢測線1、 2、 3和質(zhì)控線顯色、檢測線4不顯色樣品中2,4-D為 中低含量時(200"600ng/ml),檢測線1、 2和質(zhì)控線顯色，第3、 4條檢測線不顯色；樣品中2，4-D為中度 含量時(l-6mg/ml)，檢測線1和質(zhì)控線顯色，檢測線2、 3、 4不顯色樣品中2，4-D為髙度含量時(^0mg/1)， 檢測線l、 2、 3、 4均不顯色，只質(zhì)控線顯色。實施例2采用改良EDC法合成2,4-D免疫用人工抗原，以2，4-DB為半抗原，牛血清白蛋A (BSA)為載體蛋白， 稱取2,4-DB 60mg,加入0.05M PB(PH 11以上)，攪拌使其緩慢溶解，之后調(diào)節(jié)PH值至7. 2左右，加入 60mg sulf-NHS，充分混合，靜置5min，再加入90mg EDC，攪勻，靜置5min，該反應液1小時內(nèi)緩慢滴加到 60mg 9ml的BSA溶液中，并4"下攪拌反應過夜，接著用0.15M NaCl液透析5-6次，8小時/次，之后采 用紫外光譜吸收法定量測定偶聯(lián)物的結(jié)合比，得到結(jié)合比為1: 24的2，4-DB""BSA偶聯(lián)物，分裝凍存于-20 1C冰箱中。制備人工抗原過程中，同時進行包被抗原的合成，方法為以2，4-D 60mg代替2,4-DB，按同樣 方法與60mg 9ml的OVA溶液反應，合成包被抗原2， 4-D~0VA。獲得的人工抗原2， 4-DB-BSA免疫新西蘭白雄兔，選擇體重1. 0-2. Okg兔采用背部皮下多點注射法進行免疫。按0.9mg/兔計的2,4-DB-BSA人工抗原與等量佛氏完全佐劑充分乳化，加強免疫時用等量佛氏不 完全佐劑代替，每次免疫時間間隔為2周，共免疫6次，最后一次免疫后10天采血收集血清，以ELISA 法測定抗血清效價，待抗血清效價達到要求后，用心臟采血法獲取血液，析出抗血清加入0.01 柳汞， 分裝后于-20iC凍存。然后用ELISA法做抗體效價和抗體親合性、特異性的測定。取700ug純化的抗體，邊攪拌邊加入預先制備的30nm大小的膠體金溶液100ml (PH 8. 2)中，室溫攪拌 30min,力n 10%BSA攪5min，力H 10% PEG2000 2ml，攪拌5min, 12000rpm離心50min,吸去上清，沉淀即為 純化的金標記抗體。由保存液稀釋金標抗體至工作濃度，按50ul/cn^的量均勻噴涂于玻璃纖維素膜上，并 由此確定單位面積上附著金標抗體的量，使其與處理過硝酸纖維素膜上4條檢測條線包被原的量剛好完全 中和。-20"C凍存，冷凍真空干燥后，密封保存。將2，4-DB"0VA偶聯(lián)物噴涂于硝酸纖維素膜檢測區(qū)內(nèi)的4 條檢測線上，每線寬0.5cm，點樣量25ul，各條帶間隔2mm,自左至右依次為第1、 2、 3、 4線，2，4-D包 被原溶液濃度按4、 3、 2、 l的次序遞增，點樣液濃度依次為60ng/ml、 600ng/ml、 6ug/ml、 60ug/ml。羊抗 兔IgGl. Omg/ml噴涂于質(zhì)控線上。然后將玻璃纖維素膜、已固定金標記抗2，4-D抗體的玻璃纖維素膜、已 平行包被2,4-D~0VA偶聯(lián)物和羊抗兔IgG抗體的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼到雙面膠PVC板上。用
切條機將其沿縱向切成5mmX60mm的試紙條。測定樣品時，將試紙條樣品吸收墊插入待測樣品中，停留5秒后取出平放，5分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果 判斷方法是通過顯示于免疫層析膜上的條紋數(shù)量，來判定待檢樣品中2，4-D的含量。當樣品中不含2，4-D 時，玻璃纖維膜上的膠體金-抗2，4-D抗體量剛可使硝酸纖維素膜上4條檢測線顯色，質(zhì)控線也顯色；當樣 品中2，4-D為低含量時(21-100ng/ml)，檢測線l、 2、 3和質(zhì)控線顯色、檢測線4不顯色；樣品中2，4-D為 中低含量時(200-600ng/ml),檢測線1、 2和質(zhì)控線顯色，第3、 4條檢測線不顯色；樣品中2，4-D為中度 含量時(l"6mg/ml)，檢測線1和質(zhì)控線顯色，檢測線2、 3、 4不顯色；樣品中2，4-D為髙度含量時(W0mg/1)， 檢測線l、 2、 3、 4均不顯色，只質(zhì)控線顯色。


圖1半定量快速檢測2， 4-D膠體金試紙條結(jié)構(gòu)2半定量快速檢測2,4-D膠體金試紙條的主視結(jié)構(gòu)3檢測顯示2，4-D陰性結(jié)果圖4檢測顯示2，4-D低量時(>21,<200ng/m)圖5檢測顯示2，4-D中低含量時(>200，<1000ng/ml)圖6檢測顯示2，4-D中度含量時(>1000，<5mg/ml)圖7檢測顯示2，4-D高度含量時(>5mg/ml)閣中1樣品吸收區(qū)，2、玻璃纖維素膜，3、金標記抗體區(qū)塊，4、 PVC板，5 、 T測試區(qū)(4條 線)，6、 C質(zhì)控線，7、硝酸纖維素膜，8、吸水濾紙。
權(quán)利要求
1、一種2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其具體步驟為，①半抗原的選擇通過比較，選擇2，4-DB為合成人工免疫抗原的半抗原，2，4-D為合成人工包被抗原的半抗原；②人工抗原的合成以改良EDC法將2，4-D免疫半抗原2，4-DB與BSA偶聯(lián)，合成人工免疫抗原2，4-DB-BSA；③抗2，4-D特異性抗體的制備利用上述合成的偶聯(lián)物2，4-DB-BSA免疫動物制備效價高特異性強的抗2，4-D抗體；④納米膠體金顆粒的制備使用氯金酸和檸檬酸三鈉為反應試劑用煮沸法制備膠體金納米顆粒；⑤膠體金標記抗2，4-D特異性抗體抗2，4-D抗體經(jīng)分離純化后，將制備的膠體金顆粒標記于抗2，4-D的特異性抗體上；⑥金標墊的制備和硝酸纖維素膜的處理將膠體金標記的抗2，4-D抗體固定在玻璃纖維素膜上；2，4-D-OVA包被原固相化噴涂4條檢測線組成檢測區(qū)，羊抗兔IgG(或羊抗鼠IgG)1.0mg/ml噴涂于質(zhì)控線，硝酸纖維素膜上1、2、3、4檢測線上噴涂2，4-D-OVA量剛好與金標墊上標記抗體中和；⑦免疫層析試紙條的制備單面膠PVC板上，依次粘貼上玻璃纖維素膜、已固定金標記抗2，4-D抗體的玻璃纖維素膜、已平行包被2，4-D-OVA包被原檢測線和羊抗鼠(或羊抗兔)IgG抗體的硝酸纖維素膜、吸水墊。用切條機將已粘貼好的PVC板沿縱向切成5mm×60mm的試紙條；⑧樣品測試和結(jié)果判讀方法根據(jù)競爭抑制免疫層析原理，進行農(nóng)藥殘留的分析測定；建立的檢測體系對2，4-D農(nóng)藥的最小檢測量為21ug/ml，且可實現(xiàn)半定量顯示，在5分鐘內(nèi)完成快速檢測。
2、 根據(jù)權(quán)利耍求1所述的2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其特征是，所涉及步驟 ①的具體為制備2，4-D抗體可方便選擇2,4-D或2， 4-DB為半抗原，但通過比較，2,4-DB為半抗原較 2， 4-D做半抗原更具科學性，2,4-DB與2,4-D分子結(jié)構(gòu)類似，只是2,4-DB較2,4-D天然具有較長的碳鏈 間隔臂(增加2個碳的碳鏈長)，更易使半抗原的分子獨特部位暴露(即突出抗原決定簇)，而增強免疫性。 因此本項選擇2，4-DB為合成人工免疫抗原的半抗原，而為了提髙檢測靈敏度，人工包被抗原合成選擇的 半抗原為2,4-D。3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其特征是，所涉及的 步驟②的具體為選擇2,4-DB為2，4-D抗體制備的半抗原，牛血清白蛋白(BSA)為載體蛋白，然后通過 改良EDC法合成人工抗原2，4-DB"BSA。稱取2,4-DB 60mg,加入0. 05M PB(PH 11以上)，攪拌使其緩慢 溶解，之后調(diào)節(jié)PH值至7.2左右，加入60mg sulf-NHS,充分混合，再加入EDC，再加入90邁gEDC,攪勻，靜 置片刻，并將此反應液l小時內(nèi)緩慢滴加到事先配好的60mg9mlBSA溶液中，4XTF攪拌反應過夜，0.15M NaCl液透析3天，5-6次左右，紫外分光光度計測紫外法測定和計算偶聯(lián)物的結(jié)合比，得到適當結(jié)合比的 2，4-DB"BSA偶聯(lián)物，-20"下凍存。制備人工免疫抗原過程中，同時進行人工包被抗原的合成，以2，4-D 為半抗原，卵清蛋白OVA為載體蛋白，改良EDC法合成包被抗原2,4-D"OVA。4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其特征是，所涉及的步 驟③的具體為獲得的人工抗原(偶聯(lián)物)免疫BALB/c小鼠或新兩蘭白雄兔。免疫BALB/c小鼠采用腹部皮下注射，初次免疫劑量300ug/鼠，與佛氏完全佐劑等量混合充分乳化，加強免疫時劑量為首免的1/4, 與等量不完全佐劑混合充分乳化后注射，上下2次免疫間隔2-3周。采用ELISA法檢測抗血清效價，待抗 血消效價達一定值后，再加強一次。通過外科手術(shù)取免疫鼠脾細胞，與小鼠骨翻瘤細胞系P3/X63-Ag8融 合，HAT篩選并克隆化，篩選出能穩(wěn)定分泌抗2，4-D單克隆抗體的細胞株，該細胞株注入小鼠腹腔，取腹 水制備單抗。分離純化抗體，然后用ELISA法做抗體效價和親合性、特異性的測定。5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其特征是，所涉及的步 驟④的具體為純水溶解氯金酸使其終濃度為0. 01%。煮沸后每100ml加入l術(shù)橡酸三鈉水溶液3ml，繼續(xù) 煮沸3min。待冷卻后用0.2M的fcCO,調(diào)至PH 8. 2。冷卻后41C保存?zhèn)溆?，取樣進行透射電鏡觀察粒子大小。6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其特征是，所涉及的步 驟⑤的具體為在磁力攪拌下，將1.4mg純化的抗2，4-D特異性抗體IgG,快速攪拌下加入上述100ml膠 體金溶液中，室溫攪拌30min后，加10%牛血清白蛋白4ml，再攪拌5min，加l戰(zhàn)聚乙二醇(PEG2000)2ml(終 濃度為0.2%),室溫下攪拌5min, 12000rpm離心50邁in,吸去上清后所得沉淀即為純化的金標記抗體，將 其貯存f保存液中，4TC冰箱中保存。7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其特征是，所涉及的步 驟⑥的具體為稀釋金標抗體至工作濃度，按50ul/cm2的量均勻噴涂于玻璃纖維素膜上，-20"凍存，冷 凍真空干燥后，密封保存。硝酸纖維膜上將2，4-D"OVA包被原固相化噴涂4條檢測線組成檢測區(qū)，每條 檢測線寬度l-1.5mm,每條線在0.5cm寬的試紙條上點樣量25ul，條帶間隔2mm,如圖自左至右依次為第 1、 2、 3、 4線，2，4-DB"OVA包被原濃度按照4、 3、 2、 1的次序依次遞增，點樣液濃度依次為60ng/ml、 600ng/ml、 6ug/ml、 60ug/ml。且4條檢測線上包被原的總量剛好可與金標墊上的金標抗體完全中和。羊抗 兔IgG (或千.抗鼠IgG) 1.0mg/ml噴涂丁-硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控線，用含1%BSA、 0. 5% T冊en-20的PBS 封閉30min,洗滌3次，自然風干。8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其特征是，所涉及的步 驟⑦的具體為試紙結(jié)構(gòu)底板中部為作為實驗反應區(qū)的硝酸纖維素膜，其上有含4條涂有2，4-D"OVA偶 聯(lián)物線的檢測區(qū)和一條指示試紙條質(zhì)量的質(zhì)控帶C,最左側(cè)為樣品區(qū)，底板另一端頭為吸水濾紙，硝酸纖 維素膜二端分別與抗體金標墊和吸水濾紙相互交疊連接，在抗體金標墊上壓有作為樣品吸收區(qū)的玻璃纖維 膜，這4部分均貼附于白色雙面膠塑料底板上。組裝好后，用切條機將已粘貼好的免疫層析試紙沿縱向切 成5咖X60mm的試紙條。9、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2，4-D農(nóng)藥殘留的半定量納米膠體金層析測定方法，其特征是，所涉及的步 驟⑧的具體為將試紙條樣品吸收墊插入待測樣品中，停留5秒后取出平放，IO分鐘后觀察結(jié)果。結(jié)果判 斷方法是通過顯示于免疫層析膜上的條紋數(shù)量，來判定待檢樣品中2，4-D的含量。當樣品中不含2，4-D時，玻璃纖維膜上的膠體金抗2，4-D抗體量剛可使硝酸纖維素膜上4條檢測線顯色，質(zhì)控線也顯色；當樣品中2，4-D為低含量時(21-100ng/ml),檢測線1、 2、 3和質(zhì)控線顯色、檢測線4不顯色；樣品中2，4-D為中低 含量時(200"600ng/ml)，檢測線1、 2和質(zhì)控線顯色，第3、 4條檢測線不顯色；樣品中2，4-D為中度含量 時(l-6mg/ml),檢測線l和質(zhì)控線顯色，檢測線2、 3、 4不顯色；樣品中2，4-D為髙含量時(M0mg/1)，檢 測線l、 2、 3、 4均不顯色，只質(zhì)控線顯色。
全文摘要
本發(fā)明屬免疫化學檢測技術(shù)，是一種借助膠體金標記顯色的免疫層析反應，用以快速半定量檢測環(huán)境水樣中2，4-D殘留量的試紙及制備方法。本發(fā)明所依據(jù)的原理是通過待檢樣品中的2，4-D與精確定量金標抗體反應，然后與呈橫條狀分布于免疫層析膜上的2，4-D-OVA發(fā)生競爭性的結(jié)合，通過顯示于免疫層析膜上的條紋數(shù)量，來判定待檢樣品中2，4-D的含量，條紋數(shù)越多，待檢樣品中2，4-D的含量越高，對2，4-D的最小檢出量為21ug/l，可在10分鐘內(nèi)完成，具有實質(zhì)性特點和顯著進步，改變了傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留多步繁瑣檢測問題，實現(xiàn)一步法快速半定量檢測2，4-D殘留的方法。該試紙條由底板、吸水濾紙、硝酸纖維膜、抗2，4-D抗體的金標墊、樣品吸收墊組成，底板中部為作為實驗反應區(qū)的硝酸纖維素膜，其上有含4條檢測線和一條質(zhì)控線，最左側(cè)為樣品區(qū)，底板另一端頭為吸水濾紙。
文檔編號G01N33/558GK101158683SQ20071010559
公開日2008年4月9日 申請日期2007年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月16日
發(fā)明者孫紅煒, 尚佑芬, 崔漢青, 楊崇良, 王升吉, 袁雪英, 趙玖華, 路興波, 馬立平 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所