專利名稱：環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種環(huán)保技術(shù)的方法，具體是一種環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法，即利用細(xì)胞色素P450作為生物標(biāo)記物來(lái)監(jiān)測(cè)養(yǎng)豬場(chǎng)周圍環(huán)境中和使用過(guò)豬糞肥的土壤環(huán)境中砷污染的方法。
背景技術(shù)：
砷是動(dòng)物體必需的一種微量元素，具有多種重要作用。近年來(lái)砷制劑已成為世界各國(guó)廣泛使用的飼料添加藥物，促進(jìn)了畜牧業(yè)的發(fā)展，取得了較好的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。但同時(shí)大量含砷的畜禽排泄物進(jìn)入環(huán)境，對(duì)環(huán)境造成了污染。其污染對(duì)象主要是養(yǎng)殖場(chǎng)周圍環(huán)境和使用過(guò)豬糞肥的土壤環(huán)境。對(duì)于環(huán)境砷污染的監(jiān)測(cè)，目前主要還是化學(xué)測(cè)定法，即通過(guò)檢測(cè)土壤中砷的含量來(lái)了解砷污染狀況。但是化學(xué)測(cè)定法有其缺陷性，僅憑含量無(wú)法反應(yīng)這些污染物的生物效應(yīng)。生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)法則可以彌補(bǔ)其不足，不僅可以反應(yīng)土壤污染狀況，還可以反應(yīng)生物的適應(yīng)性，以及污染物在分子水平上的毒性效應(yīng)；等等。
生物標(biāo)記物(也稱生物標(biāo)志物)是近年來(lái)興起的一種較新的環(huán)境監(jiān)測(cè)方法，細(xì)胞色素P450(CYP450)是其中應(yīng)用最廣泛的一種。細(xì)胞色素P450酶系是廣泛存在于各種動(dòng)物、植物、和微生物等不同生物體內(nèi)的一類代謝酶系，具有極其重要的生理功能。用P450酶系的誘導(dǎo)或抑制作用，可以作為分子水平上敏感的生物標(biāo)記物，來(lái)監(jiān)測(cè)污染物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響。目前有大量關(guān)于P450用作工業(yè)污染物如多氯聯(lián)苯，多環(huán)芳烴以及重金屬等環(huán)境污染的生物標(biāo)志物的研究報(bào)道，但尚未見(jiàn)其用于土壤砷污染的研究。7-甲氧基-3-異吩噁唑酮-O-脫芐基酶(MROD)是CYP450酶系中的一種，即CYP4501A2。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)該酶對(duì)土壤砷污染較敏感，而且在一定范圍內(nèi)該酶被抑制的程度與土壤砷含量具有相關(guān)性?？梢杂迷撁傅幕钚宰兓潭葋?lái)監(jiān)測(cè)土壤砷污染。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的查新，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法相同或者類似的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法，使其可以監(jiān)測(cè)含砷的豬排泄物進(jìn)入養(yǎng)豬場(chǎng)周圍環(huán)境，或者施用于農(nóng)田土壤而作為肥料后，引起的土壤砷污染。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明首先根據(jù)要監(jiān)測(cè)的地點(diǎn)，設(shè)計(jì)土壤采樣方案；然后在各個(gè)采樣點(diǎn)采集蚯蚓，將其裝入含有采樣地土壤的容器中；取采得的蚯蚓，先進(jìn)行清腸，然后勻漿，離心，得上清液即為所需的含P450的提取液；在熒光分光光度計(jì)中測(cè)定MROD的活性；根據(jù)MROD活性計(jì)算土壤總砷含量，從而監(jiān)測(cè)土壤的砷污染程度。
所述的首先根據(jù)要監(jiān)測(cè)的地點(diǎn)，設(shè)計(jì)土壤采樣方案，具體為首先要了解監(jiān)測(cè)地點(diǎn)的背景資料，確定污染來(lái)源與養(yǎng)殖場(chǎng)的液體排放或糞便施肥情況。前者可以先了解排出含砷制劑殘留的污染源距監(jiān)測(cè)點(diǎn)的距離，后者可以先了解監(jiān)測(cè)點(diǎn)施肥的方案。然后確定采樣的具體方法當(dāng)污染為點(diǎn)源污染時(shí)，可在沿污染方向的不同距離布置采樣點(diǎn)；當(dāng)污染為面源污染時(shí)，可均勻布置采樣點(diǎn)。
所述的采集蚯蚓，具體為先采集采樣點(diǎn)的土壤，裝入容器中；然后將采出的蚯蚓放入該容器中，帶回實(shí)驗(yàn)室，以保證蚯蚓的生活環(huán)境不發(fā)生變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可靠性。
所述的含P450的提取液，其具體制備為將容器中的蚯蚓取出，放在濕濾紙上，在室溫下放置1至2天，以排出腸內(nèi)容物；取清腸后的蚯蚓，用濾紙吸干水分，置于玻璃勻漿器中，倒入在4℃冰箱中預(yù)冷的蚯蚓勻漿緩沖液，勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，離心30min。棄去沉淀，上清液即為所需的含P450的提取液。
所述的測(cè)定MROD的活性，具體為在熒光比色杯中加入各反應(yīng)成分，濃度分別為三羥甲基氨基甲烷(Tris)100mmol/L，煙酰胺二核苷酸磷酸(NADPH)0.5mmol/L，7-甲氧基異吩噁唑酮約10μmol/L，約0.5mg蛋白的含P450的樣品提取液。反應(yīng)時(shí)NADPH最后加入，加入后反應(yīng)立即開(kāi)始。準(zhǔn)確進(jìn)行10min后，加入0.5ml甲醇中止反應(yīng)，將比色杯放入熒光比色池內(nèi)，在激發(fā)波長(zhǎng)Ex為581nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em為593nm條件下測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。
所述的根據(jù)MROD活性計(jì)算土壤總砷含量，具體為首先建立土壤砷含量與MROD活性的關(guān)系式，此后即可根據(jù)酶活性，計(jì)算土壤砷含量，從而監(jiān)測(cè)土壤的砷污染程度。
本發(fā)明通過(guò)蚯蚓體內(nèi)MROD活性的測(cè)定來(lái)監(jiān)測(cè)土壤砷污染狀況，既可了解土壤砷污染程度，又可以了解砷污染的生化效應(yīng)，以及生物體對(duì)砷污染的反應(yīng)。比直接測(cè)定土壤砷含量更具有實(shí)用價(jià)值，而且靈敏度高，適于長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。


圖1為本發(fā)明方法流程圖具體實(shí)施方式
如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施步驟如下1.首先了解監(jiān)測(cè)地點(diǎn)的背景資料，確定污染來(lái)源與養(yǎng)殖場(chǎng)的液體排放或糞便施肥情況。然后確定采樣的具體方法。
2.先采集采樣點(diǎn)的土壤，裝入容器中；然后將采出的蚯蚓放入該容器中，帶回實(shí)驗(yàn)室。
3.將容器中的蚯蚓取出，放在濕濾紙上，在室溫下放置1至2天，以排出腸內(nèi)容物；取清腸后的蚯蚓，用濾紙吸干水分，置于玻璃勻漿器中，倒入在4℃冰箱中預(yù)冷的蚯蚓勻漿緩沖液，勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，離心30min。棄去沉淀，上清液即為所需的含P450的提取液。
4.在熒光比色杯中加入各反應(yīng)成分，使各種反應(yīng)物的濃度分別達(dá)到Tris100mmol/L，NADPH 0.5mmol/L，7-甲氧基異吩噁唑酮約10μmol/L，約0.5mg蛋白的含P450的樣品提取液。反應(yīng)時(shí)NADPH最后加入，加入后反應(yīng)立即開(kāi)始。準(zhǔn)確進(jìn)行10min后，加入0.5ml甲醇中止反應(yīng)，將比色杯放入熒光比色池內(nèi)，在激發(fā)波長(zhǎng)Ex為581nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em為593nm條件下測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。
5.首先建立土壤砷含量與MROD活性的關(guān)系式，此后即可根據(jù)酶活性，計(jì)算土壤砷含量，從而監(jiān)測(cè)土壤的砷污染程度。
以下結(jié)合本發(fā)明內(nèi)容提供實(shí)施例，以某養(yǎng)豬場(chǎng)周圍長(zhǎng)期施用含砷制劑殘留的豬糞肥的菜地為例，監(jiān)測(cè)其中的砷污染狀況。
菜地常年種植蔬菜，供豬場(chǎng)員工食用。該豬場(chǎng)的飼料中含有砷添加劑，菜地以豬糞作肥料。根據(jù)菜地的大約為正方形的形狀，設(shè)計(jì)了中心1個(gè)點(diǎn)，周圍4個(gè)點(diǎn)共5個(gè)采樣點(diǎn)。采集其中的蚯蚓(為白頸環(huán)毛蚓)。帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定其體內(nèi)MROD的活性。此前在實(shí)驗(yàn)室以相同質(zhì)地未污染土壤，進(jìn)行人工污染實(shí)驗(yàn)，建立土壤總砷含量和蚯蚓體內(nèi)MROD活性的關(guān)系式A蚓＝-0.038C土+10.37其中C土為土壤總砷含量，A蚓為蚯蚓體內(nèi)MROD的活性，該式適用于C土在20mg/kg～200mg/kg的范圍內(nèi)。菜地樣品蚯蚓體內(nèi)此酶活性的平均值為9.24±0.85p mol/mgprotein.min(未受污染土壤中蚯蚓體內(nèi)該酶的活性為48.63±1.11p mol/mgprotein.min)，則土壤總砷含量為28.74mg/kg.而遠(yuǎn)離豬場(chǎng)的未受洛克沙胂污染的土壤中總砷含量為8.75mg/kg，說(shuō)明菜地土壤受到了高于原來(lái)自身含量3至4倍的砷污染。此結(jié)果同時(shí)表明，在砷污染的脅迫下，蚯蚓體內(nèi)的P450酶受到了抑制，抑制率達(dá)81％。這有可能導(dǎo)致蚯蚓對(duì)其他物質(zhì)代謝的改變。用該方法進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)比較靈敏。
權(quán)利要求
1.一種環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法，其特征在于首先根據(jù)要監(jiān)測(cè)的地點(diǎn)，設(shè)計(jì)上壤采樣方案；然后在各個(gè)采樣點(diǎn)采集蚯蚓，將其裝入含有采樣地上壤的容器中；取采得的蚯蚓，先進(jìn)行清腸，然后勻漿，離心，得上清液即為所需的含P450的提取液；在熒光分光光度計(jì)中測(cè)定7-甲氧基-3-異吩噁唑酮-O-脫芐基酶的活性；根據(jù)其活性計(jì)算土壤總砷含量，從而監(jiān)測(cè)土壤的砷污染程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法，其特征是，所述的根據(jù)要監(jiān)測(cè)的地點(diǎn)，設(shè)計(jì)土壤采樣方案，具體為首先了解監(jiān)測(cè)地點(diǎn)的背景資料，確定污染來(lái)源與養(yǎng)殖場(chǎng)的液體排放或糞便施肥情況，然后確定采樣的具體方法當(dāng)污染為點(diǎn)源污染時(shí)，在沿污染方向的不同距離布置采樣點(diǎn)；當(dāng)污染為面源污染時(shí)，均勻布置采樣點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法，其特征是，所述的含P450的提取液，其制備為將容器中的蚯蚓取出，放在濕濾紙上，在室溫下放置1至2天，以排出腸內(nèi)容物；取清腸后的蚯蚓，用濾紙吸干水分，置于玻璃勻漿器中，倒入在4℃冰箱中預(yù)冷的蚯蚓勻漿緩沖液，勻漿；將勻漿液轉(zhuǎn)移入1.5ml離心管中，離心30min，棄去沉淀，上清液即含P450的提取液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法，其特征是，所述的測(cè)定MROD的活性，具體為在熒光比色杯中加入各反應(yīng)成分，濃度分別為Tris 100mmol/L，NADPH 0.5mmol/L，7-甲氧基異吩噁唑酮10μmol/L，0.5mg蛋白的含P450的樣品提取液，反應(yīng)時(shí)NADPH最后加入，加入后反應(yīng)立即開(kāi)始；準(zhǔn)確進(jìn)行10min后，加入0.5ml甲醇中止反應(yīng)，將比色杯放入熒光比色池內(nèi)，在激發(fā)波長(zhǎng)Ex為581nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em為593nm條件下測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法，其特征是，所述的根據(jù)MROD活性計(jì)算土壤總砷含量，具體為首先建立土壤砷含量與MROD活性的關(guān)系式，再根據(jù)酶活性計(jì)算土壤砷含量，從而監(jiān)測(cè)土壤的砷污染程度。
全文摘要
一種環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域的環(huán)境砷污染的生物標(biāo)記監(jiān)測(cè)方法。本發(fā)明首先根據(jù)要監(jiān)測(cè)的地點(diǎn)，設(shè)計(jì)土壤采樣方案；然后在各個(gè)采樣點(diǎn)采集蚯蚓，將其裝入含有采樣地土壤的容器中；取采得的蚯蚓，先進(jìn)行清腸，然后勻漿，離心，得上清液即為所需的含P450的提取液；在熒光分光光度計(jì)中測(cè)定7－甲氧基－3－異吩噁唑酮－O－脫芐基酶的活性；根據(jù)其活性計(jì)算土壤總砷含量，從而監(jiān)測(cè)土壤的砷污染程度。本發(fā)明既可了解土壤砷污染的程度，又可以了解砷污染的生化效應(yīng)，以及生物體對(duì)砷污染的反應(yīng)。比直接測(cè)定土壤砷含量更具有實(shí)用價(jià)值。而且靈敏度高，適于長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK1834645SQ20061002587
公開(kāi)日2006年9月20日 申請(qǐng)日期2006年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月20日
發(fā)明者李銀生, 邱江平, 陳曉斌, 曾振靈, 陳杖榴 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)