環(huán)境微生物快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種環(huán)境微生物的檢測方法。１）微生物收集，微生物收集自空氣濾網，２）微生物基因組提取，３）細菌16SrDNA擴增，真菌18SrDNA擴增，４）rDNA測序，５）數據分析，包括去污染序列、低質量序列，歸并高相似度序列，序列注釋；６）建立該環(huán)境細菌數據庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息；和該環(huán)境真菌數據庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息。本發(fā)明尤其適于對潔凈區(qū)環(huán)境微生物進行普查，較常規(guī)基于培養(yǎng)的檢測技術更加快捷、準確、靈敏，檢測成本和時間大幅度降低，顯著提高微生物污染監(jiān)測和控制能力。另一方面，基因測序數據還提供了微生物分子水平的標記，對于追溯和判斷微生物來源，準確識別污染源具有重要價值。
【專利說明】環(huán)境微生物快速檢測方法
【技術領域】[0001 ] 本發(fā)明涉及一種環(huán)境微生物的檢測方法，可提高微生物的檢測范圍、節(jié)省檢測費用、大幅度縮短檢測時間。
【背景技術】
[0002]微生物是自然界分布最廣泛、數量最大的一類生物。它們個體微小、繁殖速度快、適應能力強。一些微生物經消化道入侵人體，比如說沙門氏菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌等，它們可造成胃腸道疾病，嚴重時會造成肝、腦、腎臟器損害，甚至死亡。而霉菌的危害在于它所產生的毒素，比如黃曲霉毒素、伏馬菌素等，它們的毒性很強，具有很強的致癌性。另外，微生物及熱原若通過粘膜或血管直接侵入人體，將對人體健康造成更嚴重、更直接的危害。因此，在食品及藥品制造過程中，防范微生物污染至關重要。
[0003]目前，食品和制藥工業(yè)普遍采用潔凈技術對生產環(huán)境中的懸浮微粒、微生物、有毒有害氣體進行控制。為同時確保潔凈區(qū)人員的正?；顒?，亦須使空氣溫度、濕度及壓力在適宜范圍內。潔凈廠房及設施的建造不但要采用不易產塵、便于清潔的建筑材料和結構，而且需對空氣進行調溫、調濕和凈化處理，以滿足規(guī)定凈化級別要求。在這種條件下，生產環(huán)境中最大的產塵源和微生物污染源通常是操作人員、設備和物料。因此必須使?jié)崈魠^(qū)空氣往復循環(huán)、動態(tài)更新。在潔凈區(qū)，凈化空氣一般來自房間頂部的送風口，流經操作區(qū)后，攜帶著人員、設備、設施和物料脫落的微粒(包括微生物)流向低壓區(qū)域，最后進入回風口，補充新空氣后，再次進入空調及過濾系統(tǒng)獲得再生。這種有組織的、無紊流的空氣流動方式被稱為“單向流”。在回風口設置的濾網，可以攔截室內“臟”空氣中懸浮的微生物，真實完整地反映潔凈區(qū)微生物生態(tài)特征。潔凈技術不但用于生產活動，在食品藥品的檢驗，醫(yī)療服務、科學研究領域都有廣泛應用。
[0004]潔凈技術雖然能極大地降低食品藥品受到微生物污染的風險，但并不是絕對的無菌環(huán)境，也不能杜絕外來微生物侵入被加工物料和產品。實際上，食品和口服藥品均允許一定數量的非致病微生物殘留。即便是無菌藥品，在包裝完成后，通常還要接受滅菌處理。只有非最終滅菌的無菌制品，才要求局部環(huán)境滿足“絕對無菌”的要求。對潔凈區(qū)或潔凈室環(huán)境微生物進行監(jiān)測不但是保證產品質量的要求，也是國家有關強制性法規(guī)的要求。潔凈區(qū)實際上是一個特殊的生態(tài)環(huán)境，由于人員、設備、物料和大環(huán)境相對固定，微生物種群分布相對穩(wěn)定，但也會隨季節(jié)、房間消毒措施有規(guī)律地變化。了解微生物的種類及數量分布信息，掌握其變化規(guī)律，對于針對性地防范微生物污染具有重要意義。如生產環(huán)境中是否存在病原微生物；又如在處理淀粉和蛋白質含量較高的物料時，需關注是否存在某些霉菌；又如在生產熱消毒產品時，需關注是否存在耐熱微生物。此外，當發(fā)現(xiàn)產品受到特定微生物污染時，生產環(huán)境微生物監(jiān)測數據將幫助技術人員找到潛在的污染源，進而采取有效的預防措施。另外在微生物檢驗時，環(huán)境而非樣品中的微生物會造成檢驗結果的失真，如果有檢驗環(huán)境背景微生物信息(且具有分子水平的特征信息)，就能對檢驗結果進行甄別。
[0005]然而，我國絕大多數的食品、藥品生產企業(yè)的微生物檢驗能力還停留在細胞水平。這些檢驗方法是為適應產品放行檢驗而建立起來的，在開展微生物污染過程控制的檢驗方面普遍存在能力不足的情況。同時，傳統(tǒng)的微生物學方法只能培養(yǎng)環(huán)境中不超過10%的微生物，不僅檢測時間長，結果準確率差，而且效率低，工作量大。雖然業(yè)界已經開發(fā)了一些全自動微生物鑒定儀器，但是它們的鑒定范圍受限于已知的微生物數據庫。因此傳統(tǒng)方法不能真實揭示微生物群落的多樣性?？傮w上看，食品藥品工業(yè)對于微生物污染處于相對被動的地位，不但缺乏對微生物侵染模式(如微生物種類、數量和途徑)進行調查的手段，也缺乏量化的風險評價指標。實際生產中一味采用過度消毒(滅菌)措施，不但盲目低效，而且增加了環(huán)境污染和人員安全風險。對超標產品除了報廢銷毀，別無它途，也難以對后續(xù)生產起到指導作用。

【發(fā)明內容】

[0006]為監(jiān)測潔凈區(qū)微生物的種類和數量分布情況，提供背景環(huán)境的微生物信息，本發(fā)明提供了一種基于大規(guī)?；驕y序技術的環(huán)境微生物快速檢測方法。
[0007]環(huán)境微生物檢測方法，所述的環(huán)境為一個單向空氣流向的環(huán)境，步驟如下:
1)微生物收集，所述的微生物收集自空氣濾網，
2)微生物基因組提取，
3)細菌16S rDNA擴增，真菌18S rDNA擴增，
4) rDNA 測序，
5)數據分析,包括去污染序列、低質量序列，歸并高相似度序列,序列注釋；
6)建立該環(huán)境細菌數據庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息；和該環(huán)境真菌數據庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息。
[0008]優(yōu)選地，所述的環(huán)境為需控制空氣微粒和微生物污染的潔凈區(qū)。
[0009]優(yōu)選地，步驟I )微生物收集的方法如下:定期收取單向流空氣回風口的濾網，對在空氣濾網上的微生物進行洗脫后，洗脫液先經過紗布進行初級過濾，去除大顆粒干擾物，過濾液再通過0.22 μ m濾膜，最終收集濾膜及其攔截的微生物作為待檢測樣本。
[0010]優(yōu)選地，步驟2 )微生物基因組提取的方法如下:樣本按照下列方法提取微生物基因組，將收集的微生物離心沉淀后，重懸于無菌PBS中，加入50μ L溶菌酶(10 mg/mL),
6μ L 變溶菌素(25000 U/mL), 3 μ L 溶葡球菌酶(4000 U/mL),和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10 mMTris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0),37° C消化一小時；然后加入0.1-mm-直徑的石英砂，在振蕩儀上2100轉，振蕩5分鐘，振蕩后提取DNA。
[0011]優(yōu)選地，步驟3 )中，對于細菌擴增Vl到V3區(qū)域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO I)，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO2)，
對于真菌擴V4區(qū)域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO 3 )，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO 4 )。
[0012]優(yōu)選地，步驟4 )中，rDNA測序，測序儀優(yōu)先采用Roche454、Illumina的Miseq,Hiseq 二代測序儀。
[0013]優(yōu)選地，步驟5)中，對于拼接完的序列分別提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比對程序，和www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr庫比對，過濾掉比對污染序列，剩余的序列利用BLAST軟件和Greengenes數據庫中已知的16S/18S序列數據庫進行比對，一致性在95%以上的序列注釋為相應的系統(tǒng)群，不滿足的則為新的系統(tǒng)群；BLAST序列比對的具體判斷標準為(a)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 99%，未知菌株鑒定為該種；(b)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鑒定為該屬；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鑒定為該種或屬；(d)如存在兩個或兩個種系以上參照菌株與未知菌株序列相似性^ 99%，且兩者相似性相差< 0.5%，則暫將未知菌株歸為其中相似性較高種系，但不排除未知菌株為另一種的可能性。
[0014]優(yōu)選地，相對于所述步驟I )搜集的微生物的對照樣本的收集方法，利用細菌、真菌培養(yǎng)基，收集了該環(huán)境各個角落的微生物，包括沉降菌和懸浮菌，將所有的培養(yǎng)基的微生物混合后作為對照樣本；同時,平板收集的微生物樣本既可以作為對濾網收集的微生物進行有效性評估，還可以增加微生物的檢測范圍；濾網收集可以在72小時內得到結果，包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物，平板收集晚于濾網收集但得到的菌種可以做進一步分析和保藏。
[0015]本發(fā)明的有益效果:在食品和藥品制造行業(yè)，目前仍采用傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的微生物監(jiān)測方法。菌物采集主要依靠定量空氣浮游菌采樣法、沉降菌法和表面取樣法，需要在潔凈區(qū)多個位點及多個時間采樣。然后分別用適于細菌和真菌生長的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，要經歷疒14天的時間，才能通過菌落數量評價環(huán)境質量。這樣的監(jiān)測方式不但繁瑣、復雜，而且對正常生產會產生影響，檢驗結果也顯著滯后，且不能精確提供微生物種類信息。
[0016]本發(fā)明提出的基于大規(guī)?；驕y序技術的環(huán)境微生物集群分析方法，尤其適于對潔凈區(qū)環(huán)境微生物進行普查，如用于藥品及食品生產和檢驗的潔凈廠房或潔凈室、或手術室。較常規(guī)基于培養(yǎng)的檢測技術更加快捷、準確、靈敏，檢測成本和時間大幅度降低，將幫助制藥企業(yè)占據微生物污染攻防斗爭的主動地位，顯著提高微生物污染監(jiān)測和控制能力。另一方面，基因測序數據還提供了微生物分子水平的標記，對于追溯和判斷微生物來源，準確識別污染源具有重要價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0018]圖1是:工作流程圖。
[0019]圖2是:濾網中微生物計數結果。將濾網中收集的微生物涂布在馬鈴薯平板，在48小時后觀察發(fā)現(xiàn)有較多酵母，未見霉菌。總菌數IO5 Cfu /ml。
[0020]圖3是:可培養(yǎng)微生物計數結果。將平板微生物挑取混勻后，涂布在馬鈴薯平板，在48小時后觀察發(fā)現(xiàn)有較多酵母，未見霉菌，基本與所挑菌落種類一致。
[0021]圖4是:真菌分析維恩圖。表示濾網中的真菌種類完全覆蓋培養(yǎng)皿中的真菌種類。
[0022]圖5是:細菌分析維恩圖。表示濾網中的細菌種類能覆蓋絕大多數完全覆蓋培養(yǎng)皿中的真菌種類。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。
[0024]如圖1所示，本發(fā)明的流程如下: (I)微生物收集
收取回風口的空氣濾網，利用無菌PBS對在濾網上的微生物進行洗脫后，洗脫液先經過紗布進行初級過濾，去除大顆粒的纖維等干擾物。過濾液再通過0.22 μ m濾膜，最終收集濾膜。作為待檢測樣本。
[0025](2)微生物基因組提取
兩組樣本，分別按照下列方法提取微生物基因組。將收集的微生物離心沉淀后，重懸于0.5mL無菌PBS中，加入50 μ L溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6yL變溶菌素(mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich), 3 μ L 溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000U/mL; Sigma- Aldrich),和41 μ L TE50溶液(10 mM Tris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37° C消化一小時。然后加入0.1-mm-直徑的石英砂，在振蕩儀上2100轉，振蕩5分鐘。振蕩后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提取DNA。
[0026](3)細菌16S rDNA擴增，真菌18S rDNA擴增，擴增得到不同來源的微生物群落16S/18S rRNA 序列
細菌檢測Vl到V3區(qū)域。正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC ；
真菌擴增引物X區(qū)域。正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG。
[0027]對于不同來源的樣本，我們用帶有不同Barcode的引物擴增，如，對于某一樣本，我們的擴增引物將為:Bact-8F ACAGACAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和 Bact_533RACAGACAGACGGGCGGTGTGTRCA, ACAGACA就為標記物，在最終得到的測序產物中，用于識別不同來源的樣本。
[0028](4) rDNA測序:增產物純化，定量后，可采用454高通量測序儀或者其他類似的二代測序儀。
[0029](5)對于測序結果進行數據分析，包括去污染序列、低質量序列，歸并高相似度序列，序列注釋以及菌種鑒定。
[0030]測序所得到的結果將低質量的結果去除后，根據不同的Barcode對序列的來源進行分類，然后拼接。對于拼接完的序列分別提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比對程序，和www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr庫比對，過濾掉比對污染序列。剩余的序列利用BLAST軟件和Greengenes數據庫中已知的16S/18S序列數據庫進行比對，一致性在95%以上的序列注釋為相應的系統(tǒng)群，不滿足的則為新的系統(tǒng)群。BLAST序列比對的具體判斷標準為(a )與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性^ 99%，未知菌株鑒定為該種；(b)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鑒定為該屬；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鑒定為該種或屬；(d)如存在兩個或兩個種系以上參照菌株與未知菌株序列相似性^ 99%，且兩者相似性相差< 0.5%，則暫將未知菌株歸為其中相似性較高種系，但不排除未知菌株為另一種的可能性。(e)建立所測到的微生物的DNA指紋文庫，用于今后的溯源等分析。[0031]6 )建立該環(huán)境細菌數據庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息；和該環(huán)境真菌數據庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息。
[0032]實施例1用測序方法進行空氣濾網微生物鑒定
a、在生物安全柜內，用無菌剪刀把每塊濾膜剪成1.8—2.5X4.0-4.5cm，放入無菌大口玻璃瓶內，加入約500ml無菌的0.85%生理鹽水，收集洗滌濾膜的菌液。并先用濾布粗過濾，收集的粗濾液。
[0033]b、收集的粗濾液，用0.22Mm的細菌濾膜抽氣過濾，去濾液，收集濾膜(一旦濾液流出速度慢，就得換過濾膜)，到無菌試劑瓶內，加入約100ml無菌的0.85%生理鹽水，用力震蕩洗滌濾膜。
[0034]C、收集濾膜洗脫液，按常規(guī)方法取樣，10倍稀釋法進行細菌，真菌的培養(yǎng)計數，并進行培養(yǎng)。霉菌未檢出；酵母較多，未計數；總菌數IO5 Cfu /ml。培養(yǎng)結果如圖2所示:
d、其余的濾膜洗脫液經11000轉離心10分鐘，去掉上清液，用少量0.85%生理鹽水洗下沉淀的菌體，裝入1.5ml無菌的離心管內，貼上2013-05_q2，放入_20°C冰箱。
[0035]e、將收集的微生物離心沉淀后，重懸于0.5mL無菌PBS中，加入50 μ L溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6 μ L 變溶菌素(mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich),
3μ L溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000 U/mL; Sigma- Aldrich),和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10mM Tris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0),37° C消化一小時。然后加入0.1im-直徑的石英砂，在振蕩儀上2100轉，振蕩5分鐘。振蕩后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提取DNA。
[0036]f、擴增得到不同來源的微生物群落16S/18S rRNA序列，采用454高通量測序儀。
[0037]g、對于測序結果進行數據分析、菌種鑒定，結果如下表1 (真菌，由于18S rDNA鑒定除真菌外，還有動物、植物等，但在此不做表述)和表2 (細菌，主要鑒定到屬，但其序列特征可以保證其很好的溯源性)。
[0038]表1空氣濾網微生物鑒定真菌鑒定結果
【權利要求】
1.一種環(huán)境微生物檢測方法，其特征在于，所述的環(huán)境為一個單向空氣流向的環(huán)境，步驟如下: .1 )微生物收集，所述的微生物收集自空氣濾網， . 2)微生物基因組提取， 3)細菌16S rDNA擴增，真菌18S rDNA擴增， . 4) rDNA 測序， .5)數據分析,包括去污染序列、低質量序列，歸并高相似度序列,序列注釋； .6)建立該環(huán)境細菌數據庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息；和該環(huán)境真菌數據庫，包含種類信息、序列信息和豐度信息。
2.根據權利要求1所述的方法，所述的環(huán)境為需控制空氣微粒和微生物污染的潔凈區(qū)。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)微生物收集的方法如下:定期收取單向流空氣回風口的濾網，對在空氣濾網上的微生物進行洗脫后，洗脫液先經過紗布進行初級過濾，去除大顆粒干擾物，過濾液再通過0.22 μ m濾膜，最終收集濾膜及其攔截的微生物作為待檢測樣本。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)微生物基因組提取的方法如下:樣本按照下列方法提取微生物基因組，將收集的微生物離心沉淀后，重懸于無菌PBS中，加入50μ L溶菌酶(10 mg/mL), 6 μ L變溶菌素(25000 U/mL)，3 μ L溶葡球菌酶(4000 U/mL)，和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10 mM Tris.HCL 和 50 mM EDTA, pH 8.0) ,37° C 消化一小時；然后加入0.1-mm-直徑的石英砂，在振蕩儀上2100轉，振蕩5分鐘，振蕩后提取DNA。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中，對于細菌擴增Vl到V3區(qū)域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO I)，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO 2)， 對于真菌擴增V4區(qū)域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO 3 )，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO 4 )。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中，rDNA測序，測序儀優(yōu)先采用Roche454、Illumina 的 Miseq, Hiseq 二代測序儀。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中，對于拼接完的序列分別提交到 greengenes.lbl.gov 上的 NAST 和 Bellerophon 3 比對程序，和 www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr庫比對,過濾掉比對污染序列，剩余的序列利用BLAST軟件和Greengenes數據庫中已知的16S/18S序列數據庫進行比對，一致性在95%以上的序列注釋為相應的系統(tǒng)群，不滿足的則為新的系統(tǒng)群；BLAST序列比對的具體判斷標準為(a)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 99%，未知菌株鑒定為該種；(b)與某種系的代表參照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鑒定為該屬；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鑒定為該種或屬；(d)如存在兩個或兩個種系以上參照菌株與未知菌株序列相似性> 99%，且兩者相似性相差< 0.5%，則暫將未知菌株歸為其中相似性較高種系，但不排除未知菌株為另一種的可能性。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，相對于所述步驟I)搜集的微生物的對照樣本的收集方法，利用細菌、真菌培養(yǎng)基，收集了該環(huán)境各個角落的微生物，包括沉降菌和懸浮菌，將所有的培養(yǎng)基的微生物混合后作為對照樣本；同時，平板收集的微生物樣本既可以作為對濾網收集的微生物進行有效性評估，還可以增加微生物的檢測范圍；濾網收集可以在72小時內得到結果，包括可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物，平板收集晚于濾網收集但得到的菌種可以做 進一步分析和保藏。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627800SQ201310564815
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權日:2013年11月14日
【發(fā)明者】陳歡, 劉靂, 郭紅櫻, 張遐耘, 張啟坤, 方序, 錢兵 申請人:浙江天科高新技術發(fā)展有限公司