專利名稱：凈化阿維菌素類藥物的方法及其免疫親和色譜柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凈化阿維菌素類藥物(Aermectins，AVMs)，包括阿維菌素(Aermectin，AVM)，多拉菌素(Doramectin，DOR)，埃比菌素(Eprinomectin，EP)和伊維菌素(Ivermectin，IVM)的方法及其專用免疫親和色譜柱。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)的發(fā)展，人們對生物體內(nèi)的物質(zhì)及其變化產(chǎn)生了越來越濃厚的興趣，而生物樣本的分析就成為探索和發(fā)現(xiàn)生命奧秘的必要手段。由于生物樣本成分復(fù)雜，待測物濃度較低，而且大多數(shù)取樣量很少，這就對分析方法的選擇性和靈敏度提出了更高的要求。免疫親和色譜(IAC，immunoaffinity chromatography)是一種將免疫反應(yīng)與色譜分析方法相結(jié)合的分析方法。它的高度選擇性和高親和性無疑使分析過程簡化。在獸藥殘留分析中，IAC最簡單而且最有效的應(yīng)用方式是作為理化測定技術(shù)(如HPLC，GC)的樣品凈化手段，這種聯(lián)用方法可使免疫學(xué)技術(shù)和理化技術(shù)在選擇性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補(bǔ)，并避免了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接測定樣品的諸多不足。目前，該方法在抗體、激素、多肽、酶、重組蛋白、受體病毒及小分子化合物的分析中被廣泛應(yīng)用。
AVMs包括阿維菌素(Avermectin，AVM)、伊維菌素(Ivermectin，IVM)、多拉菌素(Doramectin，DOR)、埃普里諾菌素(埃比菌素、依普菌素，Eprinomectin，EP)、莫西菌素(Moxidectin，MOX)和塞拉菌素(Selamectin，SEL)等藥物，其中，AVMs的共有結(jié)構(gòu)如圖2所示。
阿維菌素(Avermectin，AVM)，多拉菌素，埃比菌素和伊維菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類廣譜抗寄生蟲抗生素類藥，對本類藥物的抗蟲譜包括牛羊的多種線蟲如哥倫比亞結(jié)節(jié)蟲、輻射結(jié)節(jié)蟲及其幼蟲、毛圓線蟲、血柔屬線蟲、牛副絲蟲、馬屬動物各類圓蟲、副蛔蟲、蟯蟲、血柔線蟲、蟠尾絲蚴，豬的食道口線蟲、肺絲蟲、旋毛蟲及其移行蚴、包囊蚴、腎蟲、犬的蛔蟲、蟯蟲、心絲蟲、鉤蟲及各種動物的體外寄生蟲如螨蟲、蜱、虱、蠅類及蠅類蚴、日癢恙蟲等本類藥物的抗蟲譜包括牛羊的多種線蟲如哥倫比亞結(jié)節(jié)蟲、輻射結(jié)節(jié)蟲及其幼蟲、毛圓線蟲、血柔屬線蟲、牛副絲蟲、馬屬動物各類圓蟲、副蛔蟲、蟯蟲、血柔線蟲、蟠尾絲蚴，豬的食道口線蟲、肺絲蟲、旋毛蟲及其移行蚴、包囊蚴、腎蟲、犬的蛔蟲、蟯蟲、心絲蟲、鉤蟲及各種動物的體外寄生蟲如螨蟲、蜱、虱、蠅類及蠅類蚴、日癢恙蟲等。許多國家建立了阿維菌素類藥物的殘留檢測方法并作出了殘留限量的規(guī)定。AVMs作為脂溶性化合物，在動物體內(nèi)殘效時間較長，因而WHO將其列為高毒化合物，其動物源食品中的殘留檢測工作引起各國的極大關(guān)注，并制定最高殘留限量。
目前檢測阿維菌素，多拉菌素，埃比菌素和伊維菌素的方法主要有高效液相色譜法-熒光(HPLC-FLD)、液-質(zhì)聯(lián)機(jī)(LC-MS-MS)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。這些方法的前處理利用液-液分配，常規(guī)的SPE柱凈化和分離，都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、凈化效果差、有機(jī)溶劑浪費(fèi)多、所需時間長等缺點(diǎn)。免疫親和技術(shù)是90年代在分析領(lǐng)域得到應(yīng)用的新技術(shù)，但用免疫親和柱凈化基質(zhì)中的阿維菌素，多拉菌素，埃比菌素和伊維菌素未見報道，更無商品化的IAC柱出售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種凈化阿維菌素和/或伊維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的方法及其專用免疫親和色譜柱。
本發(fā)明所提供的凈化阿維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素和/或伊維菌素的免疫親和吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的阿維菌素多克隆抗體或單克隆抗體組成；所述阿維菌素多克隆抗體或阿維菌素單克隆抗體是以阿維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述阿維菌素半抗原是在阿維菌素的C4″位置上連接琥珀酸酐得到的4″-羥-琥珀酸酐阿維菌素(4″-o-succinoyl AVM)即為阿維菌素半抗原。
阿維菌素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明將阿維菌素用琥珀酸酐?；?，再與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原。半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對免疫不利，半抗原與卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的結(jié)合摩爾比分別為31.6∶1和23∶1。
所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠等，優(yōu)選為Sepharose 4B。
所述阿維菌素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述阿維菌素單克隆抗體優(yōu)選為阿維菌素鼠單克隆抗體，所述阿維菌素多克隆抗體為優(yōu)選阿維菌素兔多克隆抗體。
所述阿維菌素鼠單克隆抗體優(yōu)選為對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606。
所述對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用載體蛋白。
所述免疫親和吸附劑可裝載入柱中制成免疫親和色譜柱，該免疫親和色譜柱也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
含有上述免疫親和吸附劑或免疫親和色譜柱的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述試劑盒中還包括洗脫液，所述洗脫液可為甲醇。
所述試劑盒中還包括洗滌液I、洗滌液II、洗滌液III和保存液；所述保存液可為0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液，所述0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液可為1L中含有0.2g KH2PO4，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4.12H2O，8.8g NaCl，0.02gNaN3的溶液；所述洗滌液I可為1L中含有體積百分含量20％的甲醇，0.2gKH2PO4，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4.12H2O，和29.3g NaCl，pH7.4的溶液；所述洗滌液II為體積百分含量為20％的甲醇溶液；所述洗滌液III可為體積百分含量為50％的甲醇溶液。
該免疫親和吸附劑以及含有該免疫親和吸附劑的色譜柱基于免疫反應(yīng)和色譜反應(yīng)，適合從生物樣品(如肌肉、肝、肺、腎血漿)中凈化阿維菌素，多拉菌素，埃比菌素和伊維菌素，便于殘留分析。在該免疫親和吸附劑中，阿維菌素鼠單克隆抗體和阿維菌素兔多克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯(lián)率分別是99.7％，98.1％，偶聯(lián)有阿維菌素鼠單克隆抗體的免疫親和色譜柱對阿維菌素，伊維菌素，埃比菌素和多拉菌素動態(tài)柱容量分別為3884ng/mL、3896ng/mL、3612ng/mL、3897ng/mL，絕對柱容量分別為545ng/mg IgG、549ng/mg IgG、506ng/mg IgG、542ng/mgIgG；使用了15次后動態(tài)柱容量為1300-1500ng/mL。
本發(fā)明所提供的提純阿維菌素和/或伊維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理取動物組織勻漿物按5±0.01g的量加入15mL甲醇，充分混勻，然后在振蕩器上中速振蕩30min，3000rpm離心10分鐘，得到上清液即為樣品溶液；2)取3ml樣品溶液與20mL的上述保存液混合，過上述免疫親和色譜柱，然后先后用20mL洗滌液I、15mL洗滌液II和3mL洗滌液III洗滌，然后用4mL洗脫液洗脫，收集洗脫液，得到純化的阿維菌素和/或伊維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素溶液。
本發(fā)明的免疫親和色譜柱具有高選擇性，使樣品前處理過程大大簡化，尤其適用于肌肉、肝和血漿中微量阿維菌素類藥物的前處理，分析質(zhì)量得到改善。免疫親和吸附劑的高選擇性使得阿維菌素，伊維菌素，埃比菌素和多拉菌素分析方法的檢測限將主要取決于取樣量，這是單純理化手段難以達(dá)到的；本發(fā)明的免疫親和色譜柱對待測組分有很強(qiáng)的保留和濃縮能力，只要加樣量不超過柱容量，在實(shí)測樣品條件下免疫親和吸附劑對組分的保留能力幾乎不受樣品體積或組分濃度的影響。本發(fā)明的方法對組分凈化的同時還可提供定性信息。本發(fā)明的方法水相操作，操作簡單，凈化效果好，免疫親和色譜柱能重復(fù)使用，能節(jié)省大量的有機(jī)溶劑，降低分析成本和環(huán)境污染。本發(fā)明的凈化方法結(jié)合色譜法高效檢測阿維菌素，伊維菌素，埃比菌素和多拉菌素的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測定技術(shù)直接測定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確差，或理化方法選擇性低等不足，體現(xiàn)了免疫學(xué)技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機(jī)制的互補(bǔ)性。


圖1為AVMs的標(biāo)準(zhǔn)品、空白肌肉組織和添加樣本的液相色譜2為AVMs的共有結(jié)構(gòu)圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、凈化阿維菌素和/或伊維菌素和/或埃比菌素和/或多拉菌素的免疫色譜柱的制備1、阿維菌素兔多克隆抗血清的制備阿維菌素半抗原的合成分三步(1)5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-OH的合成將1.0g阿維菌素置于25mL三口雞心瓶中，6mL N，N-二甲基酰胺(DMF)溶解，加0.47g咪唑，混合。機(jī)械攪拌下，將2mL DMF稀釋的0.52g t-BuMe2SiCl(tert-butyldimethylchlorosilane)逐滴加入，30℃反應(yīng)2h。向反應(yīng)液中加入100mL乙酸乙酯(EtoAc)混合?；旌弦河?0mL水洗滌3次。分離EtoAc層，MgSO4干燥，減壓濃縮得到微黃色粘稠物。將該微黃色粘稠物用CH2Cl2溶解，硅膠柱層析分離產(chǎn)物，干燥后得到5-o-t-BuMe2Si-AVM-4″-OH。
(2)5-o-t-BuM2Si-AVM-4″-o-succinoyl的合成取0.50g 5-o-t-BuM2Si-R-4″-OH置于50mL三口雞心瓶中，加12mLCH2Cl2使其溶解，依次加入0.28g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、0.45g三乙胺和0.92g琥珀酸酐，水浴中回流2.5小時，溶液由無色變?yōu)樽厣⒑谏?與反應(yīng)原料無關(guān))。減壓蒸干CH2Cl2后，加入100mL乙醚，過濾除去不溶物后轉(zhuǎn)至250mL分液漏斗中，乙醚層用100mL 3.6％(質(zhì)量百分含量)HCl洗滌2次，再用100mL水洗滌2次。MgSO4干燥，濃縮，得淡黃色粘稠物，用CH2Cl2溶解后，用薄層色譜(TLC)對產(chǎn)物進(jìn)行分離(展開劑各成分體積比為CH2Cl2∶四氫呋喃(THF)∶CH3OH＝95∶5∶5)。TLC出現(xiàn)三條區(qū)帶，將中間最大的區(qū)帶刮下，用CH2Cl2和CH3OH(體積比為1∶1)淋洗，減壓濃縮，真空干燥24h(避光)得到5-o-t-BuM2Si-AVM-4″-o-succinoyl。
(3)將步驟2)得到的產(chǎn)物脫去保護(hù)基5-o-t-BuM2Si-AVM，得到4″-o-succinoyl-AVM，該阿維菌素的琥珀酸衍生物即為阿維菌素半抗原。
免疫原的制備本試驗(yàn)采用N-羥基琥珀酰亞胺酯法(NHS)將阿維菌素半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，得到BSA-AVM偶聯(lián)物或OVA-AVM偶聯(lián)物即為免疫抗原。
免疫原合成的具體步驟如下1)取12mg阿維菌素半抗原置于5mL圓底燒瓶中，加0.4mL二甲基甲酰胺(DMF)使阿維菌素半抗原溶解，再加入2.7mg N-羥基琥珀酰亞胺酯和4.7mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)，混合后，室溫(18-20℃)避光攪拌10小時。
2)攪拌下，在1h內(nèi)將步驟1)得到的反應(yīng)液逐滴加到6mL含30mg BSA或OVA和0.6ml DMF的硼酸鹽緩沖液(0.2M，pH9.4)。溶液開始略顯混濁，最后有少量沉淀出現(xiàn)，繼續(xù)攪拌1小時，再轉(zhuǎn)至4℃下攪拌10-12小時，立即進(jìn)行下述透析純化。
3)將步驟2)得到的反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋(截止分子量10,000Da)4℃攪拌下，透析2d，其間換PBS三次。將透析物1000rpm離心5min，除去沉淀，得到的上清液即為免疫原BSA-AVM偶聯(lián)物或OVA-AVM偶聯(lián)物。
動物免疫采用新西蘭大白兔作為免疫動物，免疫劑量為1mg·ml-1BSA-AVM偶聯(lián)物或1mg·ml-1OVA-AVM偶聯(lián)物。將新西蘭兔子飼養(yǎng)數(shù)周后接種免疫，首次免疫用1ml完全弗氏佐劑乳化，加強(qiáng)免疫用1ml不完全弗氏佐劑乳化。每次免疫間隔3-4周，一共免疫5次，最后一次不加佐劑直接肌肉注射，最后一次免疫7-10d后采血檢測，測定血清效價和交叉反應(yīng)后，頸動脈放血，收集血清。
2、阿維菌素鼠單克隆抗體的制備動物免疫采用BALA/C小鼠作為免疫動物、以上述阿維菌素半抗原與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)物BSA-AVM偶聯(lián)物或OVA-AVM偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為50μg/只(體積為0.1ml)加等體積的完全弗氏佐劑乳化，進(jìn)行首次免疫。一個月后，取同樣量免疫抗原加不完全弗氏佐劑，乳化，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，再過一個月后同法再次進(jìn)行加強(qiáng)免疫，二免后10天采血，測定抗體效價和交叉反應(yīng)后，取脾細(xì)胞。
細(xì)胞融合脾細(xì)胞按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
雜交瘤細(xì)胞克隆化采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直到得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606，該單克隆雜交瘤細(xì)胞株對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)。對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCCNo.1606已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
單克隆抗體大量生長及提純采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.16065×105-106個/只，7-10天后采集腹水。
單克隆抗體的保存在液氮-20℃下保存，使用時37℃水浴快速解凍。
3、IgG的純化采用飽和硫酸胺鹽法(SAS)和DEME纖維素離子交換層析法純化抗血清或腹水，首先用飽和硫酸銨法將IgG進(jìn)行粗提和濃縮，再用DEAE52纖維素陰離子交換法將IgG進(jìn)一步純化。其具體步驟如下粗提取3mL阿維菌素多克隆抗體血清或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606腹水與3mLPBS(0.01M，pH7.0)，混勻，吸取飽和硫酸銨溶液6mL，邊緩慢滴加邊攪拌加入血清或腹水溶液中，使硫酸銨溶液的飽和度達(dá)到50％。4℃放置60min后，3000g離心15min。將所得沉淀再溶于3mL PBS(0.01M，pH7.0)中，緩慢滴加飽和硫酸銨溶液1.6mL，使硫酸銨溶液飽和度達(dá)35％。4℃放置20min后，以3000g離心15min。沉淀再用上述方法在飽和度為35％的硫酸銨溶液中沉淀一次。
脫鹽將沉淀溶于(0.0175M，pH6.7)PBS中，裝入透析袋，并將透析袋置于1000mL的PBS(0.0175M，pH6.7)溶液中于4℃下攪拌透析24小時，在此過程中置換緩沖液3次，得到粗提的IgG溶液。
純化稱取2g DE-52(DEAE-52)纖維素粉末，置于盛有重蒸餾水的燒杯中，充分?jǐn)嚢?，靜置后去掉多余溶液，然后加入0.5mol/L NaOH溶液，攪拌均勻，1h后布氏漏斗抽濾，接著用重蒸水充分洗滌至中性。再用0.5mol/L HCl溶液以同樣的方法處理。最后換用0.5mol/LNaOH溶液處理一次，充分水洗至中性，然后將處理的DEAE-52裝入層析柱中(2.0×20cm)，于0.0175M，pH6.7的PBS中平衡。將鹽析所得粗提的IgG溶液滴入層析柱，待全部樣本進(jìn)入柱后，關(guān)閉柱下口，并在柱上覆蓋3-5cm 0.0175M，pH6.7的PBS洗脫，連接洗脫瓶，控制流速為1.0mL/min，用紫外檢測器收集蛋白組分。將含有抗體蛋白的洗脫液用50％的飽和硫酸銨進(jìn)行沉淀，所得沉淀脫鹽后，得到對伊維菌素、埃比菌素和多拉菌素都有交叉反應(yīng)的阿維菌素兔多克隆抗體或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體，將抗體分裝并于-20℃保存。
4、免疫色譜柱(IAC)的制備基質(zhì)的準(zhǔn)備取溴化氰活化的Sepharose 4B干凍粉，在盛有1.0mmol l-1HCl的G3漏斗中膨脹。
偶聯(lián)反應(yīng)將凝膠用0.1mol/L NaHCO3溶液平衡后，與20mg的上述純化抗體(溶于5mL 0.1mol/L NaHCO3溶液)混合，在4℃攪拌20h。
反應(yīng)液轉(zhuǎn)入G3漏斗中，用100mL 0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)洗滌，收集洗滌液，紫外鑒定，計(jì)算偶聯(lián)率。偶聯(lián)率計(jì)算公式為 偶聯(lián)率的檢測結(jié)果表明，兔多克隆抗體和對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯(lián)率分別是99.7±1.5％、98.1±1.6％。
活化位點(diǎn)的封閉將上述偶聯(lián)后的凝膠轉(zhuǎn)入盛有0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，混合，4℃下緩慢攪拌2hr，以封閉未偶聯(lián)的活化位點(diǎn)。
洗滌凝膠用5倍體積的0.1mol/L、pH4.0醋酸鹽緩沖液和0.1mol/L、pH8.0Tris-HCl緩沖液交替沖洗3次。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡后，抽干的凝膠轉(zhuǎn)入0.01mol/L、pH7.4的含0.1％NaN3磷酸鹽緩沖液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN31g)中，4℃下存放備用。
裝柱將偶聯(lián)有阿維菌素兔多克隆抗體或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體的免疫吸附劑轉(zhuǎn)入到含G3濾板的玻璃柱里，制成偶聯(lián)有兔多克隆抗體或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱(IAC柱)。
5、IAC柱容量的確定將步驟4制備的偶聯(lián)有兔多克隆抗體或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱，分別用保存液洗柱，平衡。輕輕上下晃動IAC柱，趕走柱里的氣泡。將2mL含有2000ng·ml-1阿維菌素(AVM)、2000ng·ml-1伊維菌素(IVM)、2000ng·ml-1埃比菌素(EP)和2000ng·ml-1多拉菌素4種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)品的保存液分別連續(xù)加到免疫親和色譜柱上，自然重力下流出。當(dāng)柱達(dá)到飽和后(流出液中樣品濃度和加樣液濃度相同)，先后用20mL洗滌液I(1L中含有體積百分含量20％的甲醇，0.2g KH2PO4，0.2g KCl，2.9g Na2HPO4.12H2O，和29.3g NaCl，pH7.4)，15mL洗滌液II(體積百分含量為20％的甲醇溶液)和3mL洗滌液III(體積百分含量為50％的甲醇溶液)洗滌免疫親和色譜柱，除去干擾雜質(zhì)。最后用4ml洗脫液(甲醇)將阿維菌素類藥物洗脫，自然重力下流出，收集，吹干，進(jìn)行HPLC測定。計(jì)算出動態(tài)柱容量和絕對柱容量。動態(tài)柱容量(dynamic column capacity)是指每毫升免疫吸附劑(或柱床體積)對待測物的最大吸收值。絕對柱容量(specificcolumn capacity)是指每毫克固定抗體對待測物的最大結(jié)合容量。結(jié)果表明偶聯(lián)有對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱的動態(tài)柱容量和絕對柱容量分別為3884ng/mL，545ng/mg IgG(阿維菌素)；3896ng/mL，549ng/mg IgG(伊維菌素)；3612ng/mL，506ng/mg IgG(埃比菌素)；3897ng/mL，542ng/mgIgG(多拉菌素)。
實(shí)施例2、含有偶聯(lián)有兔多克隆抗體或鼠單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒的制備及其對阿維菌素類藥物的提純凈化效果1、阿維菌素的試劑盒的制備該試劑盒主要由盒體，免疫色譜柱(IAC柱)，阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，埃比菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，洗滌液I，洗滌液II，洗滌液III，洗脫液，保存液，海綿托架所組成，海綿托架上設(shè)有孔和凹槽。海綿托架的凹槽內(nèi)有裝有阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，埃比菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，滌液I，洗滌液II，洗滌液III，洗脫液，保存液的試劑瓶，海綿托架的孔內(nèi)裝有IAC柱。其中免疫色譜柱為實(shí)施例1制備的偶聯(lián)有兔多克隆抗體或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCCNo.1606分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱。
洗脫液為甲醇。
保存液為0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液，即1L中含有0.2gKH2PO4，0.2g KCl，2.9gNa2HPO4.12H2O，8.8gNaCl，0.02g NaN3的溶液；洗滌液I為1L中含有體積百分含量20％的甲醇，0.2gKH2PO4，0.2gKCl，2.9gNa2HPO4.12H2O，和29.3gNaCl，pH7.4的溶液；洗滌液II為體積百分含量為20％的甲醇溶液；洗滌液III為體積百分含量為50％的甲醇溶液。
將含有偶聯(lián)有兔多克隆抗體或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒分別放在4℃。
2、阿維菌素類藥物的提純凈化效果實(shí)驗(yàn)IAC提取原理是，將特異性抗體阿維菌素兔多克隆抗體或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體和惰性基質(zhì)偶聯(lián)，制備免疫吸附劑，裝柱。當(dāng)含阿維菌素和/或伊維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的混合物流過IAC柱時，固定抗體選擇性地結(jié)合阿維菌素和/或伊維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素，其它不被識別的樣品雜質(zhì)則不受阻礙地流出IAC柱，經(jīng)洗滌后，將抗原-抗體復(fù)合物解離洗脫，阿維菌素和/或伊維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素得到凈化。IAC柱經(jīng)再生處理后可重復(fù)使用。
檢測樣品的處理動物組織樣品分別取豬肌肉，牛的肝、肺、肌肉、心、腎各組織樣品勻漿物5.0±0.01g，于50ml塑料離心管中，每個樣本按10ng/g濃度分別添加阿維菌素，伊維菌素，多拉菌素和埃比菌素標(biāo)準(zhǔn)品，靜置15min后，加入甲醇15mL，充分混勻，在振蕩器上振蕩30min，3000rpm離心10min，取上清液3mL，與20mL的保存液混合，作為樣品溶液。
分別將偶聯(lián)有兔多克隆抗體IgG或?qū)Π⒕S菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體的免疫親和色譜柱平衡到室溫，然后將上述的樣品溶液過柱，自然重力下流出，先后用20mL洗滌液I，15mL洗滌液II和3mL洗滌液III洗滌免疫親和色譜柱，最后用4mL洗脫液洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈伞?br> 加入100μL衍生化試劑A液(由體積比為3∶4的1-甲基咪唑和乙腈組成)，渦動0.5分鐘，再加入100μL衍生化試劑B液(由體積比為2∶5的醋酸酐和乙腈組成)，渦動0.5min，密閉，于96℃衍生化反應(yīng)100分鐘，用乙腈定容至2.5mL，過0.45μm針筒濾膜，進(jìn)HPLC分析(色譜條件C18反相色譜柱，Inertsil ODS-3(4.6mm×250mm，粒徑5μm)；流動相為體積百分含量為97％的甲醇溶液；流速為1mL/min；進(jìn)樣量為20μL；激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長475nm)。IAC柱用20ml的保存液平衡保存在4℃冰箱里備用。結(jié)果表明，用IAC進(jìn)行樣品凈化，不干擾藥物色譜峰，能夠完全分離，說明本發(fā)明制備的IAC非特異性吸附極小，其中豬肌肉中的阿維菌素，伊維菌素，多拉菌素和埃比菌素凈化效果如圖1所示，圖1中，A為含有阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素各10ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；B為添加10ng/g阿維菌素、10ng/g伊維菌素、10ng/g多拉菌素和10ng/g埃比菌素標(biāo)準(zhǔn)品的豬肌肉樣本濃度；C為未添加阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素的豬肌肉組織；圖1中，1為埃比菌素B1a，2為阿維菌素B1a，3為多拉菌素，4為伊維菌素B1a。
權(quán)利要求
1.一種凈化阿維菌素和/或伊維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的免疫親和吸附劑，是由固相載體和與其偶聯(lián)的阿維菌素多克隆抗體或單克隆抗體組成；所述阿維菌素多克隆抗體或阿維菌素單克隆抗體是以阿維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述阿維菌素半抗原是在阿維菌素的C4″位置上連接琥珀酸酐制備得到的4″羥-琥珀酸酐阿維菌素即為阿維菌素半抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠，優(yōu)選為Sepharose 4B；所述阿維菌素單克隆抗體為阿維菌素鼠單克隆抗體；所述阿維菌素多克隆抗體為多拉菌素兔多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的吸附劑，其特征在于所述阿維菌素鼠單克隆抗體為對阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和埃比菌素都具有交叉反應(yīng)的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-4 CGMCC No.1606分泌的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5.以權(quán)利要求1-4任一所述的免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱。
6.含有權(quán)利要求1-4任一所述的免疫親和吸附色譜柱的試劑盒或含有權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜吸附劑的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗脫液，所述洗脫液為甲醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗滌液I、洗滌液II、洗滌液III和保存液；所述保存液為0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液，所述0.01M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液為1L中含有0.2g KH2PO4，0.2g KCl，2.9gNa2HP04.12H20，8.8gNaCl，0.02g NaN3的溶液；所述洗滌液I為1L中含有體積百分含量20％的甲醇，0.2gKH2P04，0.2gKCl，2.9gNa2HP04.12H20和29.3gNaCl，pH7.4的溶液；所述洗滌液II為體積百分含量為20％的甲醇溶液；所述洗滌液III為體積百分含量為50％的甲醇溶液。
9.一種凈化阿維菌素和/或伊維菌素和/或多拉菌素和/或埃比菌素的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理取動物組織勻漿物按5±0.01g的量加入15mL甲醇，充分混勻，然后在振蕩器上中速振蕩30min，3000rpm離心10分鐘，得到上清液即為樣品溶液；2)取3ml樣品溶液與20mL的權(quán)利要求8所述的保存液混合，過權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜柱，然后先后用20mL權(quán)利要求8所述的洗滌液I、15mL權(quán)利要求8所述的洗滌液II和3mL權(quán)利要求8所述的洗滌液III洗滌，然后用4mL權(quán)利要求7所述的洗脫液洗脫，收集洗脫液，得到純化的阿維菌素和/或多拉菌素和/或伊維菌素和/或埃比菌素溶液。2)將步驟1)得到的樣品溶液過權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜柱，然后用權(quán)利要求8所述的洗滌液洗滌，再用權(quán)利要求7所述的洗脫液洗脫，得到純化的阿維菌素溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述動物組織樣品包括肌肉、肝、肺、心、腎和血漿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凈化阿維菌素類藥物的方法及其免疫親和色譜柱。該凈化阿維菌素的免疫親和色譜柱裝載有免疫親和吸附劑，該吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的阿維菌素多克隆抗體或單克隆抗體組成；所述阿維菌素多克隆抗體或阿維菌素單克隆抗體是以阿維菌素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述阿維菌素半抗原是將阿維菌素－4″－OH與琥珀酸酐酯化得到阿維菌素的琥珀酸衍生物即為阿維菌素半抗原。本發(fā)明的提純方法結(jié)合色譜法高效檢測阿維菌素的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測定技術(shù)直接測定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確差，或理化方法選擇性低等不足，體現(xiàn)了免疫學(xué)技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機(jī)制的互補(bǔ)性。
文檔編號G01N30/00GK1830547SQ200610007260
公開日2006年9月13日 申請日期2006年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月16日
發(fā)明者沈建忠, 史為民, 何繼紅, 何方洋, 侯曉林, 吳聰明 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)