本發(fā)明屬于抗生素提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種阿維菌素B1a的提取方法。
背景技術(shù)：
阿維菌素是由日本北里大學(xué)大村智等和美國Merck公司首先開發(fā)的一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，由鏈霉菌中灰色鏈霉菌Streptomyces avermitilis發(fā)酵產(chǎn)生。阿維菌素具有農(nóng) 、牧、醫(yī)三用的特點(diǎn),有很強(qiáng)的驅(qū)蟲、殺蟲活性，是世界上目前最有效的殺寄生蟲劑、殺螨蟲劑和殺昆蟲劑。阿維菌素在自然條件下容易降解,對人畜安全,對天敵影響小,屬于綠色生物農(nóng)藥。阿維菌素同時(shí)也是一種酯溶性抗生素，主要存在菌體細(xì)胞內(nèi)，僅有少量分泌到細(xì)胞外。阿維菌素原料藥為白色或淺黃色晶體粉末，熔點(diǎn)為157-162℃。在丙酮、乙酸乙酯、氯仿中易溶；在乙醇、甲醇中略溶；在石油醚、正己烷中微溶；在水中幾乎不溶。
天然阿維菌素中含有8個(gè)組分，主要有4種即A1a、A2a、B1a和B2a，其總含量≥80%；對應(yīng)的4個(gè)比例較小的同系物是A1b、A2b、B1b和B2b，其總含量≤20%。其中B1a為主要?dú)⑾x成分，故而阿維菌素含量是以B1a的含量來標(biāo)定的。
現(xiàn)有技術(shù)中，對于阿維菌素的提取，主要是采取以下幾種方法：
1、乙醇浸提-大孔樹脂法，該方法是將阿維菌素發(fā)酵液經(jīng)過濾、閃蒸干燥得到阿維菌素菌絲粉,用乙醇熱回流浸提,浸提液經(jīng)過大孔樹脂（AmberliteXAD系列、DuoliteES系列）吸附后,經(jīng)丙酮解吸、減壓濃縮得到膏狀物,再經(jīng)多次乙醇（甲醇）結(jié)晶純化，得到阿維菌素B1a含量較高的成品。
2、甲苯浸提-硅膠柱法，該方法是將阿維菌素發(fā)酵液過濾得到菌絲濾餅后,用甲苯萃取過濾，然后經(jīng)減壓濃縮得到膏狀物,以硅膠柱為固定相，以V(石油醚):V(異丙醇)=7: 1的混合溶液為洗脫液,對阿維菌素粗品進(jìn)行分離，洗脫液經(jīng)減壓濃縮得到膏狀物,用乙酸乙酯結(jié)晶純化得到阿維菌素B1a含量較高的成品。
3、丙酮浸提-乙酸乙酯提取法，將阿維菌素發(fā)酵液過濾得到菌絲濾餅后，加丙酮萃取,減壓濃縮后,再依次經(jīng)乙酸乙酯、含正己烷的乙醇溶液、含正己烷的乙酸乙醋結(jié)晶純化，得到阿維菌素B1a含量較高的成品。
4、乙醇浸提-甲苯純化法，阿維菌素發(fā)酵液經(jīng)過濾、閃蒸干燥得到阿維菌素菌絲粉,用乙醇浸提，再加入甲苯除雜，減壓濃縮，用乙醇進(jìn)行多次結(jié)晶純化，得到阿維菌素B1a含量較高的成品。
以上工藝存在主要問題包括：
（1）阿維菌素菌絲進(jìn)行閃蒸干燥時(shí)，烘干溫度過高易使菌絲體表面的蛋白質(zhì)和脂類物變性,從而改變細(xì)胞的通透性,進(jìn)而影響了阿維菌素的浸出率。
（2）用單一乙醇浸提，需反復(fù)多次浸提，造成乙醇消耗量大,生產(chǎn)成本較高。
（3）大孔樹脂的選擇性不強(qiáng),它在阿維菌素Bl的純化過程中對各個(gè)組分的分離作用很小。
（4）采用石油醚/異丙醇進(jìn)行溶媒回收，較難分離，且溶媒損失大。
（5）為提高阿維菌素純度，需多次純化結(jié)晶，而且結(jié)晶時(shí)加熱的溫度高，時(shí)間長，影響阿維菌素產(chǎn)品質(zhì)量和收率。
（6）石油醚、甲苯、正已烷等溶劑屬易燃易爆溶媒，采用這類溶媒浸提，安全風(fēng)險(xiǎn)較大。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種有效提高阿維菌素收率及產(chǎn)品質(zhì)量，且工藝簡單，溶媒損耗少，易回收，安全性高，同時(shí)可降低環(huán)境污染的阿維菌素B1a的提取方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為：
一種阿維菌素B1a的提取方法，其特征在于其工藝步驟為：首先將阿維菌素發(fā)酵液采用微濾膜過濾，得到富含阿維菌素的膜漿，然后將該膜漿用復(fù)合溶媒浸提，所得浸提液濃縮后再經(jīng)氧化鋁層析柱吸附、丁醇解析，收集B1段解析液，經(jīng)脫色過濾、一次結(jié)晶，得到阿維菌素B1粗品，再經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶即可得到阿維菌素B1a含量較高成品；
所述復(fù)合溶媒組成為：溶劑煤油：乙醇=2.2～3.0：5.5～7.5，以體積計(jì)。
所述微濾膜孔徑為0.1um～0.80 um。
所述微濾膜過濾是在一定壓差作用下，通過錯(cuò)流篩分過濾方式，進(jìn)行固液分離，膜運(yùn)行過程中，將阿維菌素發(fā)酵液中菌絲進(jìn)行流動(dòng)剪切、破碎，將胞內(nèi)產(chǎn)物阿維菌素釋放出來。膜運(yùn)行過程的透析水加量為進(jìn)料體積1.5～3.0倍，根據(jù)跨膜壓差壓力不超過0.3MPa，對料液（包括發(fā)酵液和透析水）進(jìn)行濃縮，控制濃縮倍數(shù)在5～7倍。
所述復(fù)合溶媒的用量為阿維菌素膜漿體積的5～7倍，浸提時(shí)間4～6h，浸提溫度20～25℃。
所述浸提液濃縮是指將浸提液減壓薄膜蒸發(fā)濃縮至油狀液體。
所述氧化鋁層析柱吸附、丁醇解析時(shí)，氮?dú)饧訅?.05～0.08MPa，控制流速0.35～0.65BA/h。
所述脫色過濾是將解析液升溫至50～55℃，然后加入其體積的0.5～0.7%活性碳，脫色20～30分鐘，之后趁熱過濾。
所述一次結(jié)晶過程為：在脫色過濾后的過濾液中加入去離子水，降溫至18～22℃，結(jié)晶析出，繼續(xù)攪拌3.0～3.5h，過濾，得到阿維菌素B1粗品；所述去離子水用量為丁醇脫色過濾液體積2.5～3.0倍。
所述乙酸乙酯重結(jié)晶是指將阿維菌素B1粗品,按照溶解液效價(jià)26000～28000u/ml，加入乙酸乙酯,升溫至45～50℃，加入0.3～0.5%活性碳，脫色20～30分鐘后，趁熱過濾，過濾液加去離子水，加水量為乙酸乙酯溶解液體積的1.5～2.0倍，降溫至18～22℃，結(jié)晶析出，攪拌3.5～4.0h，過濾，減壓干燥，得到阿維菌素B1a含量較高成品。
本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在：
1 本發(fā)明采用微濾膜+復(fù)合溶媒浸提的方式進(jìn)行阿維菌素提取，該方法首先通過膜過濾破壁效應(yīng)，將菌絲胞內(nèi)產(chǎn)物阿維菌素釋放，利用阿維菌素難溶于水的特性，將其富集在膜漿中，以利于溶媒浸提，改變了菌絲進(jìn)行閃蒸干燥再提取的傳統(tǒng)工藝，提高了阿維菌素的浸出率，減少溶媒損耗，節(jié)約能源。
2本發(fā)明用復(fù)合溶媒浸提，提高溶媒浸提能力，減少浸提次數(shù)，提高浸提收率。
3本發(fā)明將浸提產(chǎn)物用氧化鋁層析柱-丁醇解析工藝進(jìn)行阿維菌素組分的分離，分離效果好，可有效提高阿維菌素質(zhì)量。
4 本發(fā)明廢水量少，減輕環(huán)保處理強(qiáng)度。
5 本發(fā)明采用的溶媒，危險(xiǎn)性低，職業(yè)健康危害小。
通過本發(fā)明的方法可使阿維菌素B1a的含量達(dá)到88.0%以上，有利于產(chǎn)品質(zhì)量提高。
具體實(shí)施方法
下面用實(shí)例予以說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實(shí)例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。
下述實(shí)施例中的阿維菌素發(fā)酵液是依據(jù)以下工藝流程得到：
冷凍管斜面孢子種子液發(fā)酵液。
采用二級發(fā)酵模式生產(chǎn)阿維菌素，其生產(chǎn)菌種為活躍鏈霉菌，培養(yǎng)基中的碳源主要是淀粉和葡萄糖，氮源是豆餅粉、玉米漿、酵母膏，經(jīng)240h的發(fā)酵培養(yǎng)，其效價(jià)一般在1500ug/ml左右。
準(zhǔn)備阿維菌素發(fā)酵液500L，效價(jià)1360u/ml，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
下述實(shí)施例中，微孔濾膜孔徑為0.1um～0.80 um。
實(shí)施例1
取阿維菌素發(fā)酵液100L（效價(jià)1360 u/ml，總億1.36×108u），進(jìn)微孔濾膜，透析水加量按1.5倍，濃縮倍數(shù)按5倍，收集濃縮液50L（效價(jià)2660 u/ml，總億1.33×108u），收率97.79%。
將以上濃縮液，轉(zhuǎn)移到浸提罐中，控制溫度20℃，加入復(fù)合溶媒（溶劑煤油：乙醇=2.2：5.5）250L，浸提4hr后，收集浸提液，尾液用氮?dú)鈮撼?，匯總浸提液，減壓薄膜蒸發(fā)濃縮至油狀液體，體積2.2L（效價(jià)59500 u/ml，總億1.31×108u），收率98.49%。
將準(zhǔn)備好的氧化鋁層析柱，加入以上油狀濃縮液，氮?dú)饧訅?.05MPa，用丁醇作流動(dòng)相，流速以0.35BV/h,解析阿維菌素濃縮液，收集阿維菌素B1段組份，減壓濃縮體積5.5L（效價(jià)20600u/ml，總億1.13×108u），收率86.26%。
將以上丁醇解析液轉(zhuǎn)移到20L反應(yīng)釜中，升溫至50℃，加入0.5%（W/V）活性碳28g，脫色20分鐘后，趁熱過濾，加入14L去離子水,降溫至18℃，結(jié)晶析出，攪拌3.0h，過濾，得到阿維菌素B1粗品，濕重1657g（水份29.8%，總億0.933×108u），收率82.56%。
將以上阿維菌素B1粗品溶于3600ml乙酸乙酯（溶解液效價(jià)26100u/ml），升溫45℃，加入0.3%（W/V）活性碳11g，脫色20分鐘后，趁熱過濾，過濾液加5400ml去離子水，降溫至18℃，結(jié)晶析出，攪拌3.5h，過濾，減壓干燥，得到阿維菌素B1成品, 重量1008g，收率91.65%,阿維菌素B1a含量88.9%。
實(shí)施例2
取阿維菌素發(fā)酵液100L（效價(jià)1360 u/ml，總億1.36×108u），進(jìn)微孔濾膜，透析水加量按2.0倍，濃縮倍數(shù)按5.5倍，收集濃縮液54.5L（效價(jià)2440 u/ml，總億1.33×108u），收率97.82%。
將以上濃縮液，轉(zhuǎn)移到浸提罐中，控制溫度22℃，加入復(fù)合溶媒（溶劑煤油：乙醇=2.4：6.0）300L，浸提4.5hr后，收集浸提液，尾液用氮?dú)鈮撼?，匯總浸提液，減壓薄膜蒸發(fā)濃縮至油狀液體，體積2.6L（效價(jià)50200 u/ml，總億1.30×108u），收率97.74%。
將準(zhǔn)備好的氧化鋁層析柱，加入以上油狀濃縮液，氮?dú)饧訅?.06MPa，用丁醇作流動(dòng)相，流速以0.40BV/h,解析阿維菌素濃縮液，收集阿維菌素B1段組份，減壓濃縮體積6.3L（效價(jià)18100u/ml，總億1.14×108u），收率87.69%。
將以上丁醇解析液轉(zhuǎn)移到20L反應(yīng)釜中，升溫至52℃，加入0.55%（W/V）活性碳35g，脫色22分鐘后，趁熱過濾，加入16L去離子水,降溫至19℃，結(jié)晶析出，攪拌3.1h，過濾，得到阿維菌素B1粗品，濕重1712g（水份31.5%，總億0.952×108u），收率83.51%。
將以上阿維菌素B1粗品溶于3590ml乙酸乙酯（溶解液效價(jià)26590u/ml），升溫47℃，加入0.4%（W/V）活性碳14g，脫色22分鐘后，趁熱過濾，過濾液加5750ml去離子水，降溫至19℃，結(jié)晶析出，攪拌3.6h，過濾，減壓干燥，得到阿維菌素B1成品, 重量1030g，收率91.96%,阿維菌素B1a含量89.4%。
實(shí)施例3
取阿維菌素發(fā)酵液100L（效價(jià)1360 u/ml，總億1.36×108u），進(jìn)微孔濾膜，透析水加量按2.5倍，濃縮倍數(shù)按6倍，收集濃縮液58L（效價(jià)2290 u/ml，總億1.33×108u），收率98.10%。
將以上濃縮液，轉(zhuǎn)移到浸提罐中，控制溫度23℃，加入復(fù)合溶媒（溶劑煤油：乙醇=2.6：6.5）100L，浸提5hr后，收集浸提液，尾液用氮?dú)鈮撼?，匯總浸提液，減壓薄膜蒸發(fā)濃縮至油狀液體，體積2.9L（效價(jià)45210 u/ml，總億1.31×108u），收率98.49%。
將準(zhǔn)備好的氧化鋁層析柱，加入以上油狀濃縮液，氮?dú)饧訅?.07MPa，用丁醇作流動(dòng)相，流速以0.50BV/h,解析阿維菌素濃縮液，收集阿維菌素B1段組份，減壓濃縮體積5.7L（效價(jià)20200u/ml，總億1.15×108u），收率87.78%。
將以上丁醇解析液轉(zhuǎn)移到20L反應(yīng)釜中，升溫至53℃，加入0.6%（W/V）活性碳34g，脫色25分鐘后，趁熱過濾，加入15L去離子水,降溫至20℃，結(jié)晶析出，攪拌3.3h，過濾，得到阿維菌素B1粗品，濕重1759g（水份32.2%，總億0.954×108u），收率82.93%。
將以上阿維菌素B1粗品溶于3500ml乙酸乙酯（溶解液效價(jià)27250u/ml），升溫48℃，加入0.5%（W/V）活性碳18g，脫色25分鐘后，趁熱過濾，過濾液加6300ml去離子水，降溫至20℃，結(jié)晶析出，攪拌3.7h，過濾，減壓干燥，得到阿維菌素B1成品, 重量1038g，收率92.51%,阿維菌素B1a含量90.9%。
實(shí)施例4
取阿維菌素發(fā)酵液100L（效價(jià)1360 u/ml，總億1.36×108u），進(jìn)微孔濾膜，透析水加量按3.0倍，濃縮倍數(shù)按6.5倍，收集濃縮液61.5L（效價(jià)2160u/ml，總億1.33×108u），收率97.63%。
將以上濃縮液，轉(zhuǎn)移到浸提罐中，控制溫度24℃，加入復(fù)合溶媒（溶劑煤油：乙醇=2.8：7.0）400L，浸提5.5hr后，收集浸提液，尾液用氮?dú)鈮撼觯瑓R總浸提液，減壓薄膜蒸發(fā)濃縮至油狀液體，體積3.6L（效價(jià)36100 u/ml，總億1.30×108u），收率97.74%。
將準(zhǔn)備好的氧化鋁層析柱，加入以上油狀濃縮液，氮?dú)饧訅?.08MPa，用丁醇作流動(dòng)相，流速以0.60BV/h,解析阿維菌素濃縮液，收集阿維菌素B1段組份，減壓濃縮體積6.1L（效價(jià)18360u/ml，總億1.12×108u），收率86.15%。
將以上丁醇解析液轉(zhuǎn)移到20L反應(yīng)釜中，升溫至54℃，加入0.65%（W/V）活性碳40g，脫色27分鐘后，趁熱過濾，加入18L去離子水,降溫至21℃，結(jié)晶析出，攪拌3.4h，過濾，得到阿維菌素B1粗品，濕重1605g（水份28.5%，總億0.918×108u），收率81.96%。
將以上阿維菌素B1粗品溶于3340ml乙酸乙酯（溶解液效價(jià)27550u/ml），升溫49℃，加入0.4%（W/V）活性碳16g，脫色27分鐘后，趁熱過濾，過濾液加6350ml去離子水，降溫至21℃，結(jié)晶析出，攪拌3.9h，過濾，減壓干燥，得到阿維菌素B1成品, 重量995g，收率92.13%,阿維菌素B1a含量89.7%。
實(shí)施例5
取阿維菌素發(fā)酵液100L（效價(jià)1360 u/ml，總億1.36×108u），進(jìn)微孔濾膜，透析水加量按2.5倍，濃縮倍數(shù)按7倍，收集濃縮液50L（效價(jià)2680 u/ml，總億1.34×108u），收率98.53%。
將以上濃縮液，轉(zhuǎn)移到浸提罐中，控制溫度25℃，加入復(fù)合溶媒（溶劑煤油：乙醇=3.0：7.5）350L，浸提6hr后，收集浸提液，尾液用氮?dú)鈮撼觯瑓R總浸提液，減壓薄膜蒸發(fā)濃縮至油狀液體，體積4.2L（效價(jià)31500u/ml，總億1.32×108u），收率98.50%。
將準(zhǔn)備好的氧化鋁層析柱，加入以上油狀濃縮液，氮?dú)饧訅?.07MPa，用丁醇作流動(dòng)相，流速以0.65BV/h,解析阿維菌素濃縮液，收集阿維菌素B1段組份，減壓濃縮體積5.9L（效價(jià)19680u/ml，總億1.16×108u），收率87.88%。
將以上丁醇解析液轉(zhuǎn)移到20L反應(yīng)釜中，升溫至55℃，加入0.7%（W/V）活性碳41g，脫色30分鐘后，趁熱過濾，加入18L去離子水,降溫至22℃，結(jié)晶析出，攪拌3.5h，過濾，得到阿維菌素B1粗品，濕重1749g（水份30.62%，總億0.971×108u），收率83.68%。
將以上阿維菌素B1粗品溶于3460ml乙酸乙酯（溶解液效價(jià)27960u/ml），升溫50℃，加入0.5%（W/V）活性碳17g，脫色30分鐘后，趁熱過濾，過濾液加6920ml去離子水，降溫至22℃，結(jié)晶析出，攪拌4.0h，過濾，減壓干燥，得到阿維菌素B1成品, 重量1055g，收率92.54%,阿維菌素B1a含量90.1%。