一種阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備方法和應(yīng)用。具體地，對(duì)野生型的阿維菌素產(chǎn)生菌中的aveD基因進(jìn)行失活，可以獲得消除A組分，只產(chǎn)生B組分的菌株；對(duì)aveD基因和aveC基因同時(shí)失活，并在此基礎(chǔ)上回補(bǔ)aveC的同源基因（優(yōu)選梅嶺霉素生物合成基因簇中的meiC基因），獲得的突變體發(fā)酵產(chǎn)物中95wt%以上都為阿維菌素B2a。將產(chǎn)物阿維菌素B2a作為前體，可以直接用于大量合成高純度的阿維菌素B1a和伊維菌素。
【專利說(shuō)明】一種阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，本發(fā)明涉及一種阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]阿維菌素(Avermectin)是一種由革蘭氏陽(yáng)性菌除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius)產(chǎn)生的一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。阿維菌素是一種高效，無(wú)公害的生物農(nóng)藥，具有廣譜的殺蟲抗螨活性，并且阿維菌素對(duì)人畜毒副作用低，體內(nèi)殘留低，這些特點(diǎn)使得阿維菌素在家畜寄生蟲感染的治療和農(nóng)業(yè)病蟲害防治方面均有廣泛的應(yīng)用，是生產(chǎn)綠色食品的最佳用藥。
[0003]通常，在阿維菌素發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)生A組分(A Ia和A 2a等)和B組分(Bla和B2a等)(見圖1)，以Bla組分為最有效成份，而B2a組份通常用作合成另外一種生物農(nóng)藥伊維菌素的前體。以阿維菌素為前體半合成的衍生物依維菌素(Ivermectin)和多拉菌素(Doramectin)具有更高的應(yīng)用價(jià)值，前者將Bla的22為和23位雙鍵換為單鍵，后者則將Bla的25位的側(cè)鏈基團(tuán)換為環(huán)己基。
[0004]目前阿維菌素和伊維菌素生產(chǎn)上需要從天然發(fā)酵產(chǎn)物中加以提純，處理過(guò)程非常復(fù)雜，得率低，還需要使用甲苯等有毒溶劑。此外，尚沒(méi)有發(fā)酵產(chǎn)物只有B2a組分的菌株。
[0005]因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高產(chǎn)的發(fā)酵組份明確單一的阿維菌素產(chǎn)生菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是提供一種阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備方法和應(yīng)用。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種阿維菌素產(chǎn)生菌，所述的產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，阿維菌素B2a組分的相對(duì)含量滿足式1:
[0008]B/A ≥35%
[0009]式I
[0010]其中，
[0011]B為發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B2a組分的質(zhì)量；
[0012]A為發(fā)酵產(chǎn)物中所有阿維菌素組分總的質(zhì)量。
[0013]在另一優(yōu)選例中，B/A≥40%,更佳地≥50%,更佳地≥60%,更佳地≥70%,更佳地≥80%，更佳地≥ 90%，更佳地≥95%，最佳地≥ 99%。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的阿維菌素產(chǎn)生菌為鏈霉菌屬。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的阿維菌素產(chǎn)生菌為除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius)。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述產(chǎn)生菌的基因組中的aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達(dá)aveD基因、或不表達(dá)AveD蛋白、或表達(dá)的AveD蛋白無(wú)功能。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述AveD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。[0018]在另一優(yōu)選例中，所述產(chǎn)生菌的基因組中aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達(dá)aveC基因、或不表達(dá)AveC蛋白、或AveC蛋白無(wú)功能；并且，所述產(chǎn)生菌的基因組中含有或表達(dá)aveC的同源基因；或所述產(chǎn)生菌中表達(dá)AveC蛋白的同源蛋白。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述AveC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述aveC的同源基因選自下組:美貝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克馬丁(nemadectin)生物合成基因nemC,梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。
[0021]在另一優(yōu)選例中,所述的aveC的同源基因?yàn)槊穾X霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的milC基因來(lái)源于冰城鏈霉菌(Streptomycesbingchenggensis)。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的nemC基因來(lái)源于藍(lán)灰鏈霉菌(Streptomycescyaneogriseus)。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的meiC基因來(lái)源于南昌鏈霉菌Streptomycesnanchangensisο
[0025]在另一優(yōu)選例中，梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC編碼的蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO:3所示。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的阿維菌素產(chǎn)生菌是除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius) mVLlOO3,保藏編號(hào)為 GCMCC N0.6678。
[0027]在本發(fā)明的第二方面，提供了第一方面所述的阿維菌素產(chǎn)生菌的用途它被用做發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B2a組分的工程菌。
[0028]在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備阿維菌素B2a組分的方法，包括步驟:
[0029](a)培養(yǎng)第一方面所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a的發(fā)酵產(chǎn)物；和
[0030](b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出所述的阿維菌素B2a組分。
[0031]在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)阿維菌素Bla組分的方法，包括步驟:
[0032](a)培養(yǎng)第一方面所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a組分的發(fā)酵產(chǎn)物；
[0033](b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出所述的阿維菌素B2a組分；和
[0034](c)將分離的阿維菌素B2a轉(zhuǎn)化為阿維菌素Bla組分。
[0035]在另一優(yōu)選例中，步驟(C)所述轉(zhuǎn)化是將B2a組分高溫水解，從而獲得Bla組分。
[0036]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種生產(chǎn)伊維菌素的方法，包括步驟:
[0037](a)培養(yǎng)第一方面所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a組分的發(fā)酵產(chǎn)物；
[0038](b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出所述的阿維菌素B2a組分；和
[0039](c)將分離的阿維菌素B2a組分轉(zhuǎn)化為伊維菌素。
[0040]在另一優(yōu)選例中，步驟(C)所述轉(zhuǎn)化是用三-正-丁基氫化錫對(duì)阿維菌素B2a進(jìn)行還原和脫保護(hù)，獲得伊維菌素。[0041]在本發(fā)明的第六方面，提供了一種制備阿維菌素產(chǎn)生菌的方法，包括步驟:
[0042](I)對(duì)生產(chǎn)伊維菌素的出發(fā)菌進(jìn)行aveD基因和或AveD蛋白的遺傳改造，從而獲得基因組中aveD基因失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達(dá)aveD基因、或不表達(dá)AveD蛋白、或表達(dá)的AveD蛋白無(wú)功能的阿維菌素產(chǎn)生菌；
[0043]并且，在所述生產(chǎn)伊維菌素的出發(fā)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，阿維菌素B2a組分的相對(duì)含量滿足式II:
[0044]B/A < 35%
[0045]式II[0046]其中，
[0047]B為發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B2a組分的質(zhì)量；
[0048]A為發(fā)酵產(chǎn)物中所有阿維菌素組分總的質(zhì)量。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟:
[0050](2)對(duì)步驟(1)獲得的菌株，對(duì)aveC基因和或AveC蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳改造，從而獲得基因組中aveC基因失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失、或不表達(dá)aveC基因、或不表達(dá)AveC蛋白、或表達(dá)的AveC蛋白無(wú)功能的阿維菌素產(chǎn)生菌；以及
[0051](3)對(duì)步驟⑵獲得的菌株，回補(bǔ)aveC的同源基因或AveC同源蛋白。
[0052]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種基因組合，所述的基因組合與出發(fā)(或原始)的生產(chǎn)伊維菌素的基因組合相比，具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0053](I)所述基因組合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達(dá)aveD基因；或
[0054](2)所述基因組合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達(dá)aveC基因；并且，含有或表達(dá)aveC的同源基因。
[0055]在本發(fā)明的第七方面，提供了一種載體，所述的載體上整合有第六方面所述的基因組合。
[0056]在本發(fā)明的第八方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有第七方面所述的載體，或所述的宿主細(xì)胞整合有第六方面所述的基因組合。
[0057]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0058]下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
[0059]圖1顯示了阿維菌素8個(gè)組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0060]圖2顯示了不同菌株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果；1為出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果；II為aveD失活的突變株mVLlOOl發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果，只產(chǎn)生阿維菌素B組分；III顯示，在mVLlOO I進(jìn)行aveC失活后突變株mVL1002的發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果，完全不產(chǎn)阿維Bla組分，僅產(chǎn)生微量的B2a組分；IV顯示，在mVL1002中異源回補(bǔ)meiC得到的突變株mVL1003發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果，只產(chǎn)生阿維菌素B2a單一組分?！揪唧w實(shí)施方式】[0061]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次提供了一種高產(chǎn)阿維菌素B2a組分的阿維菌素產(chǎn)生菌及其制備和應(yīng)用。具體地，對(duì)野生型的阿維菌素產(chǎn)生菌中的aveD基因進(jìn)行失活，可以獲得消除A組分，只產(chǎn)生B組分的菌株，從而大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)物中B2a組分的含量；aveD基因和aveC基因同時(shí)失活，并在此基礎(chǔ)上回補(bǔ)aveC的同源基因(梅嶺霉素生物合成基因簇中的meiC基因)，突變體發(fā)酵產(chǎn)物中95wt%以上都為阿維菌素B2a。將產(chǎn)物阿維菌素B2a作為合成前體，可以直接用于高純度阿維菌素Bla和伊維菌素的合成。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0062]術(shù)語(yǔ)
[0063]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“以上”和“以下”包括本數(shù)，例如，“90%以上“指> 90%，“0.2%以下”指≤0.2%。
[0064]術(shù)語(yǔ)“不含/不產(chǎn)生阿維菌素A或Bla組分”或“基本上不含/不產(chǎn)生阿維菌素A或Bla組分”可互換使用，指發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素A或Bla組分的含量< 0.lwt%，較佳地(0.01wt%,更佳地≤ 0.005wt%(如 0wt%)。
[0065]菌株
[0066]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明出發(fā)菌株”、“本發(fā)明野生菌株”或“本發(fā)明出發(fā)微生物”可以互換使用，都是指除蟲鏈霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267。
[0067]本發(fā)明的出發(fā)菌株來(lái)自于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American typeculturecollection, ATCC)，編號(hào)為 ATCC31267。
[0068]用于本發(fā)明的出發(fā)菌株不僅包括除蟲鏈霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267，還包括其衍生菌株及其他生產(chǎn)阿維菌素的菌株。
[0069]菌種保藏
[0070]本發(fā)明的除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius) mVL1003,于 2012 年 10 月18日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCN0.6678。
[0071]引物
[0072]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“引物”指的是在與模板配對(duì)，在DNA聚合酶的作用下能以其為起點(diǎn)進(jìn)行合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈的寡居核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。
[0073]引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個(gè)特殊的序列互補(bǔ)。引物必須與模板上的一條鏈充分互補(bǔ)才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補(bǔ)。t匕如，在一個(gè)3’端與模板互補(bǔ)的引物的5’端加上一段與模板不互補(bǔ)的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補(bǔ)。只要有足夠長(zhǎng)的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補(bǔ)的引物也可以與模板形成引物-模板復(fù)合物，從而進(jìn)行擴(kuò)增。
[0074]構(gòu)建重組質(zhì)粒
[0075]根據(jù)本文所述的基因簇及其外部?jī)啥说暮塑账嵝蛄校尽炯夹g(shù)領(lǐng)域】人員可方便地用各種已知方法制得本發(fā)明的同源重組序列。這些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。[0076]所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
[0077]本發(fā)明還提供了一種穿梭質(zhì)粒載體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，穿梭質(zhì)粒載體可以為用作基因敲除的PKC1139和用作表達(dá)的PSET152質(zhì)粒。根據(jù)已知載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過(guò)限制性酶剪切與拼接，將本發(fā)明的序列插入合適的限制性位點(diǎn)，制得本發(fā)明的重組載體。
[0078]轉(zhuǎn)化
[0079]將含有所述編碼序列的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，包括但不限于:磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，堿金屬離子法。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。[0080]獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，復(fù)制本發(fā)明的基因序列。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0081]本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的編碼序列。所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選的是原核細(xì)胞，一個(gè)適用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞為宿主甲基化修飾缺失的大腸桿菌E.coliET12567。
[0082]同源重組
[0083]同源重組(Homologus Recombination)是指發(fā)生在姐妹染色單體(non-sisterchromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如原核生物細(xì)胞內(nèi)的RecA、RecB⑶、RecF,RecO, RecR等；以及真核生物細(xì)胞內(nèi)的Rad51、Mrell-Rad50等。同源重組反應(yīng)通常根據(jù)交叉分子或holiday結(jié)構(gòu)(Holiday JunctureStructure)。同源重組反應(yīng)嚴(yán)格依賴DNA分子之間的同源性。
[0084]同源重組可以用于基因敲除?；蚯贸募夹g(shù)路線如下:
[0085](I)構(gòu)建重組基因載體；
[0086](2)將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)；
[0087](3)用選擇培養(yǎng)基篩選已發(fā)生重組的細(xì)胞。
[0088]在哺乳動(dòng)物中，還包括步驟(4):將已發(fā)生重組的細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長(zhǎng)成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，還可以對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)。
[0089]制備本發(fā)明的阿維菌素產(chǎn)生菌
[0090]本發(fā)明提供了一種制備阿維菌素產(chǎn)生菌的方法，包括步驟:
[0091 ] (I)對(duì)生產(chǎn)伊維菌素的出發(fā)菌進(jìn)行aveD基因和或AveD蛋白的遺傳改造，從而獲得基因組中aveD基因失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達(dá)aveD基因、或不表達(dá)AveD蛋白、或表達(dá)的AveD蛋白無(wú)功能的阿維菌素產(chǎn)生菌；并且，在所述生產(chǎn)伊維菌素的出發(fā)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，阿維菌素B2a組分的相對(duì)含量滿足式II:
[0092]B/A < 35%
[0093]式II[0094]其中，
[0095]B為發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B2a組分的質(zhì)量；
[0096]A為發(fā)酵產(chǎn)物中所有阿維菌素組分總的質(zhì)量。
[0097]在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟:
[0098](2)對(duì)步驟(1)犾得的囷株，對(duì)aveC基因和或AveC蛋白進(jìn)打進(jìn)一步的遺傳改造，從而獲得基因組中aveC基因失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失、或不表達(dá)aveC基因、或不表達(dá)AveC蛋白、或表達(dá)的AveC蛋白無(wú)功能的阿維菌素產(chǎn)生菌；以及
[0099](3)對(duì)步驟⑵獲得的菌株，回補(bǔ)aveC的同源基因或AveC同源蛋白。
[0100]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，具體地，所述方法包括步驟:
[0101](I)構(gòu)建用于同源重組的載體，所述載體依次含有通過(guò)0_2000bp堿基相互連接的、分別含有位于aveD上游和下游的同源臂序列；
[0102](2)將步驟(1)的所述載體導(dǎo)入作為出發(fā)菌株，獲得導(dǎo)入載體的菌株，其中所述的出發(fā)菌株可發(fā)酵主要產(chǎn)生阿維菌素Ala，A2a，Bla，B2a組分；
[0103](3)從步驟(2)獲得的菌株中，篩選所述上游同源臂序列和下游同源臂序列與出發(fā)菌株的基因組發(fā)生了二次同源重組的菌株，從而獲得只產(chǎn)生Bla和B2a組分的阿維菌素產(chǎn)生菌；
[0104](4)構(gòu)建用于同源重組的載體，所述載體依次含有通過(guò)0_2000bp堿基相互連接的、分別含有位于aveC上游和下游的同源臂序列；
[0105](5)將步驟(4)的所述載體導(dǎo)入步驟(3)獲得的菌株，其中所述的步驟(3)獲得的菌株可發(fā)酵產(chǎn)生阿維菌素Bla，B2a組分；
[0106](6)從步驟(5)獲得的菌株中，篩選所述上游同源臂序列和下游同源臂序列與出發(fā)菌株的基因組發(fā)生了二次同源重組的菌株；
[0107](7)構(gòu)建用于表達(dá)aveC同源基因的載體，所述載體依次含有紅霉素啟動(dòng)子、完整的aveC同源基因片段；
[0108](8)將步驟(7)的所述載體導(dǎo)入步驟(6)獲得的菌株；獲得只產(chǎn)生B2a組分的阿維
菌素產(chǎn)生菌。
[0109]在另一優(yōu)選例中，步驟(7)所述aveC同源基因選自:美貝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克馬丁(nemadectin)生物合成基因nemC,梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。
[0110]在另一優(yōu)選例中，步驟(3)之后還包括步驟:驗(yàn)證阿維菌素產(chǎn)生菌aveD基因是否發(fā)生點(diǎn)突變。
[0111]在另一優(yōu)選例中，步驟(6)之后還包括步驟:驗(yàn)證阿維菌素產(chǎn)生菌aveC基因是否缺失。
[0112]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)、(4)所述同源臂序列是用PCR擴(kuò)增的方法獲得的。
[0113]在另一優(yōu)選例中，步驟(7)所述完整的aveC同源基因片段是用PCR擴(kuò)增的方法獲得的。[0114]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)、(4)所述同源臂序列的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，較佳地≥ 15000bp。
[0115]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)、(4)、(7)所述載體為穿梭質(zhì)粒，較佳地為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒。
[0116]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)、(4)、(7)所述載體還含有抗生素抗性基因，較佳地為阿伯拉霉素抗性基因。
[0117]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)、(5)、(8)所述的導(dǎo)入方法鏈霉菌DNA導(dǎo)入法，較佳的為接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入法。
[0118]在另一優(yōu)選例中，步驟(2)所述的出發(fā)菌株為鏈霉菌屬，較佳地為除蟲鏈霉菌。
[0119]基因組合
[0120]本發(fā)明還提供了一種基因組合，所述的基因組合與出發(fā)(或原始)的生產(chǎn)伊維菌素的基因組合相比，具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征:
[0121](I)所述基因組合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達(dá)aveD基因；或
[0122](2)所述基因組合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達(dá)aveC基因；并且，含有或表達(dá)aveC的同源基因。
[0123]本發(fā)明還提供了一種載體，所述的載體上整合有上述的基因組合。
[0124]本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有上述載體，或所述的宿主細(xì)胞整合有上述基因組合。
[0125]在另一優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞為枯草芽孢桿菌或鏈霉菌，較佳地為鏈霉菌，最佳的為除蟲鏈霉囷。
[0126]發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B2a
[0127]本發(fā)明的菌株可用于通過(guò)生物法制備阿維菌素B2a或其鹽或其衍生物。其中，所述的鹽包括(但并不限于):鹽酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽、醋酸鹽，檸檬酸鹽、其他有機(jī)羧酸鹽
坐寸ο
[0128]所述的阿維菌素B2a衍生物包括(但并不限于):伊維菌素、多拉菌素等。
[0129]本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B2a生產(chǎn)方法，除了生產(chǎn)菌不同之外，其他條件與現(xiàn)有技術(shù)中發(fā)酵生產(chǎn)的方法基本相同，例如對(duì)阿維菌素B粗品的純化工藝。本發(fā)明菌株的發(fā)酵條件與一般的鏈霉菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培養(yǎng)基中，在PH5.0-9.0 (較佳地PH7.0-7.5)和20-45°C (較佳地25_40°C )發(fā)酵。在本發(fā)明中，“菌絲體”、“發(fā)酵液”或“培養(yǎng)液”可通過(guò)在適合生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明菌株，使其生長(zhǎng)至一定的菌絲體濃度來(lái)獲得。用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)源沒(méi)有特別的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)公知的技術(shù)來(lái)選擇合適的碳源、氮源和其他營(yíng)養(yǎng)源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黃豆餅粉、肉膏、蛋白粉、麥皮、米糖、酵母粉、玉米漿、銨鹽以及其他有機(jī)物或無(wú)機(jī)含氮化合物。另外，培養(yǎng)基中還可適當(dāng)加入一些無(wú)機(jī)鹽類，如氯化鈉、磷酸鹽(如磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等)、硫酸錳、硫酸銨、硫酸鎂、碳酸鈣等金屬鹽。通?？刹捎酶鞣N已知的常規(guī)培養(yǎng)基，如LB瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、葡萄糖酵母膏瓊脂培養(yǎng)基和牛肉浸汁瓊脂培養(yǎng)基等對(duì)本菌株進(jìn)行斜面固體培養(yǎng)并4°C環(huán)境下進(jìn)行初步保藏。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)本發(fā)明菌株的培養(yǎng)基具有以下組成(％表示質(zhì)量/體積):黃豆餅粉2%，D-甘露醇2%，瓊脂2%。
[0130]然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不局限于本文中列舉的這些具體培養(yǎng)基配方。
[0131]培養(yǎng)本發(fā)明中的菌株的溫度、pH、氣液比、罐壓、轉(zhuǎn)速等條件沒(méi)有特別嚴(yán)格的限制，只要該條件適合該菌的生長(zhǎng)即可。在一些較佳的實(shí)施方案中，pH宜控制在6.5~8.0之間，培養(yǎng)溫度宜在25~40°C之間。應(yīng)理解，本發(fā)明的發(fā)酵可以是連續(xù)發(fā)酵，也可以是間歇式發(fā)酵。在本發(fā)明的一個(gè)較佳的實(shí)施方案中，通過(guò)以下方法培養(yǎng)得到發(fā)酵液和菌絲體:MS固體培養(yǎng)基(黃豆餅粉2%，D-甘露醇2%，瓊脂2%)上30°C培養(yǎng)7天。切下約Icm2的含孢子和菌絲的瓊脂塊接入一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米淀粉3%、豆柏粉0.8%、花生餅粉1%、酵母浸提物0.4%、淀粉酶4 μ /g淀粉)，30°C、200rpm培養(yǎng)48小時(shí)。按10%體積的接種量將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米淀粉14%，豆柏粉2%，酵母粉1%，鑰酸鈉0.22%，硫酸銨0.5%)，30°C、200rpm，培養(yǎng)8天。
[0132]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括:
[0133](I)用本發(fā)明方法進(jìn)行遺傳改造的菌株性能重現(xiàn)性好，經(jīng)改造的阿維菌素產(chǎn)生菌遺傳穩(wěn)定，不易突變，發(fā)酵產(chǎn)物中不再產(chǎn)生阿維菌素A和Bla組分，95wt%以上產(chǎn)物為阿維菌素 B2a ；
[0134](2)將產(chǎn)物阿維菌素B2a作為前體，可以合成高純度阿維菌素Bla和伊維菌素，極大地簡(jiǎn)化了伊維菌素的生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率，顯著降低了生產(chǎn)成本；
[0135](3)本發(fā)明經(jīng)基因工程修飾后的基因工程菌發(fā)酵組份明確單一，后提取工藝中不再利用甲苯等有毒溶 劑，極大地改善了勞動(dòng)條件和生產(chǎn)的安全性；減少了其他組份作為廢棄物被放棄導(dǎo)致的生物量的浪費(fèi)和由此導(dǎo)致的環(huán)境污染；
[0136](4)由于阿維菌素組份的純化，由此生產(chǎn)出來(lái)的生物農(nóng)藥含有低效結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)物的減少，施藥過(guò)程中能極大地延緩昆蟲耐藥性的產(chǎn)生。
[0137]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: ColdSpring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0138]實(shí)施例1
[0139]阿維菌素生物合成基因aveD失活(aveD點(diǎn)突變)菌株的構(gòu)建
[0140]1.構(gòu)建用于aveD點(diǎn)突變的重組質(zhì)粒
[0141]PCR克隆阿維菌素生物合成基因簇中aveD基因上游DNA片段的引物序列如下:
[0142]引物1:5’ -TAT GAA TTC CCT CGT CGA GGT GGC CGA G-3’(下劃線為 EcoRI 位點(diǎn))(SEQ ID NO:4)
[0143]引物2:5’ -TTA AAG CTT ACC GCA GCC GAC GTC CAG G-3’(下劃線為 HindIII)(SEQ ID NO:5)
[0144]PCR克隆阿維菌素生物合成基因簇中aveD基因下游DNA片段的引物序列如下:
[0145]引物3:5’ -TTA AAG CTT AAG CCG GCG GTG CGG CTC G-3’(下劃線為 HindIII)(SEQ ID NO:6)
[0146]引物4:5，-TTA TCT AGA TCC TCA CCC TTT CCC CCG GC-3，(下劃線為 XbaI) (SEQID NO:7)
[0147]以抽提的阿維菌素產(chǎn)生菌除蟲鏈霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267的總DNA為模板，分別用上述兩組特異性引物對(duì)阿維菌素生物合成基因aveD的上下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得基因簇上游的2.0kb的擴(kuò)增片段與下游的1.Skb的擴(kuò)增片段。將這兩個(gè)片段分別進(jìn)行EcoR1-HindIII和HindII1-XbaI酶切后，連入市售的pKC1139 ( —種溫度敏感的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，US5，955，319)的EcoR1-XbaI位點(diǎn)，從而獲得aveD點(diǎn)突變的重組質(zhì)粒pVLlOOl。將aveD保守DxGxGxG區(qū)域中的第79位甘氨酸(Gly)突變?yōu)榱涟彼?Leu)，同時(shí)將第78位的絲氨酸(Ser)突變?yōu)橘嚢彼?Lys)，從而形成HindIII位點(diǎn)。
[0148]將重組質(zhì)粒pVLlOOl轉(zhuǎn)化常規(guī)的大腸桿菌E.coli DH5 α，挑取單克隆菌落于LB培養(yǎng)液(含有阿伯拉霉素抗生素100 μ g/mi)中培養(yǎng)過(guò)夜，至菌液較濃。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證后，進(jìn)行商業(yè)測(cè)序，結(jié)果證明，重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。
[0149]2.aveD點(diǎn)突變突變株mVLlOOl的構(gòu)建和篩選 [0150]將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pVLlOOl轉(zhuǎn)化入常規(guī)的甲基化修飾缺失的大腸桿菌E.coli ET12567 (參見US7，326，782和US7，105,491)，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法，將質(zhì)粒pVLlOOl導(dǎo)入阿維菌素產(chǎn)生菌 Streptomyces avermectiniusATCC31267 中。
[0151]選出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，將接合子置于37°C生長(zhǎng)，使質(zhì)粒pVLlOOl中的aveD基因上游或下游片段與染色體上的同源片段發(fā)生一次同源重組，然后將37°C生長(zhǎng)良好的結(jié)合子接入不含任何抗生素的TSB液體培養(yǎng)基(培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)中，在30°C下培養(yǎng)兩天后取少量菌液重新接種入無(wú)抗生素的TSB液體培養(yǎng)基中，如此重復(fù)2輪之后，將菌液在MS固體培養(yǎng)基上劃線，挑選喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落。
[0152]由于在無(wú)抗生素條件下培養(yǎng)，導(dǎo)入鏈霉菌的質(zhì)粒中約3-5%會(huì)與基因組發(fā)生二次同源重組，從而喪失阿伯拉霉素抗性。對(duì)于選出的喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落，抽提DNA，用PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切的方法確定基因型。
[0153]使用的引物為:
[0154]引物5:5，-CCC CGC CGT CCA TCC TCT G_3，(SEQ ID NO:8)；
[0155]引物6:5’ -TAC CGC GGC CGC ACT CAC G_3’ (SEQ ID NO:9)；
[0156]野生型的2.0lkb PCR產(chǎn)物不能被HindIII酶切，而正確的aveD點(diǎn)突變突變株的
2.0lkb PCR產(chǎn)物能被HindIII酶切成0.59kb和1.42kb，經(jīng)PCR產(chǎn)物酶切和測(cè)序鑒定，發(fā)明人成功構(gòu)建了正確aveD基因點(diǎn)突變的基因工程改造菌株，命名為mVLlOOl。
[0157]實(shí)施例2
[0158]阿維菌素生物合成基因aveC aveD雙突變菌株的構(gòu)建
[0159]1.構(gòu)建aveC同框敲除的質(zhì)粒
[0160]PCR克隆阿維菌素生物合成基因簇中aveC基因上游DNA片段的引物序列如下:
[0161]引物7:5’ -TTA GAA TTC CAT CAC GCT GCT GGA CTT CG-3’(下劃線為 EcoRI 位點(diǎn))(SEQ ID NO:10)
[0162]引物8:5’ -ACG CCT GCA GGG CCA GAA ACA G-3’ (下劃線為 PstI) (SEQ ID NO:
11)
[0163]PCR克隆阿維菌素生物合成基因簇中aveC基因下游DNA片段的引物序列如下:
[0164]引物9:5’-TAT CTG CAG GTG AAT GCC GTG ATG TTC CTC-3’(下劃線為 PstI)(SEQ ID NO:12)
[0165]引物10:5’-TAT TCT AGA TGC TCT CCT CCA CCA CAT CCT C_3’(下劃線為 XbaI)(SEQ ID NO:13)
[0166]以抽提的阿維菌素產(chǎn)生菌除蟲鏈霉菌StreptomycesavermectiniusATCC31267的總DNA為模板，分別用上述兩組特異性引物對(duì)阿維菌素生物合成基因aveC的上下游序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得基因簇上游的1.87kb的擴(kuò)增片段與下游的1.9kb的擴(kuò)增片段。將這兩個(gè)片段分別進(jìn)行EcoR1-PstI和Pst1-XbaI酶切后，連入pKC1139 ( —種溫度敏感的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，US5，955，319)的EcoR1-XbaI位點(diǎn)，從而獲得aveC同框敲除的重組質(zhì)粒pVL1002。其中aveC同框缺失756bp。
[0167]將重組質(zhì)粒pVL1002轉(zhuǎn)化常規(guī)的大腸桿菌E.coli DH5 α，挑取單克隆菌落于LB培養(yǎng)液(含有阿伯拉霉素抗生素100 μ g/mi)中培養(yǎng)過(guò)夜，至菌液較濃。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證后，進(jìn)行商業(yè)測(cè)序，結(jié)果證明，重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。
[0168]2.aveC同框敲除突變株mVL1002的構(gòu)建和篩選
[0169]將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pVL1002轉(zhuǎn)化入常規(guī)的甲基化修飾缺失的大腸桿菌E.coliET12567 (可參見US7，326，782和US7,105,491)，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法，將質(zhì)粒pVL1002導(dǎo)入按照實(shí)施例1構(gòu)建的aveD點(diǎn)突變的菌株mVLlOOl中。選出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，將接合子置于37°C生長(zhǎng)，使質(zhì)粒PVL1002中的aveC基因上游或下游片段與染色體上的同源片段發(fā)生一次同源重組，然后將37°C生長(zhǎng)良好的結(jié)合子接入不含任何抗生素的TSB液體培養(yǎng)基(購(gòu)自Sigma-Aldrich公司)中，在30°C下培養(yǎng)兩天后取少量菌液重新接種入無(wú)抗生素的TSB液體培養(yǎng)基中，如此重復(fù)2輪之后，將菌液在MS固體培養(yǎng)基上劃線，挑選喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落。
[0170]由于在無(wú)抗生素條件下培養(yǎng)，導(dǎo)入鏈霉菌的質(zhì)粒中約3-5%會(huì)與基因組發(fā)生二次同源重組，從而喪失阿伯拉霉素抗性。對(duì)于選出的喪失阿伯拉霉素抗性的單菌落，抽提DNA，用PCR的方法確定基因型。
[0171]引物11:5’ -CCC CGC CGT CCA TCC TCT G_3’ (SEQ ID NO:14)；
[0172]引物12:5’ -TAC CGC GGC CGC ACT CAC G_3’ (SEQ ID NO:15)；
[0173]出發(fā)菌株aveD點(diǎn)突變的突變株得到1.19kb PCR產(chǎn)物，而正確的aveCaveD雙突變菌株得到0.43kb PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定，發(fā)明人成功構(gòu)建了正確aveCaveD基因雙突變的基因工程改造菌株，命名為mVL1002。
[0174]實(shí)施例3
[0175]meiC異源回補(bǔ)菌株的構(gòu)建
[0176]1.構(gòu)建meiC異源回補(bǔ)的質(zhì)粒
[0177]PCR克隆梅嶺霉素生物合成基因meiC的引物序列如下:
[0178]引物13:5’-TAT GGA TCC CTG CGC AAT AGG CTC ACC AC-3’(下劃線為 BamHI 位點(diǎn))(SEQ ID NO:16)
[0179]引物14:5’ -TAT TCT AGA CGG GAG GTG TCT ACA AGT GC-3’ (下劃線為 XbaI 位點(diǎn))(SEQ ID NO:17)
[0180]以抽提的梅嶺霉素產(chǎn)生菌南昌鏈霉菌Streptomyces nanchangensis的總DNA為模板，用上述一對(duì)特異性引物對(duì)梅嶺霉素生物合成基因meiC的進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1.7kb包含完整meiC基因片段的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行BamH-XbaI酶切后，連入常規(guī)市售的含有紅霉素啟動(dòng)的pSET152( —種整合型的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，可參見USl，171，583)的BamH-XbaI位點(diǎn)，從而獲得用于meiC異源回補(bǔ)的重組質(zhì)粒pVL1003。
[0181]將重組質(zhì)粒pVL1003轉(zhuǎn)化常規(guī)的大腸桿菌E.coli DH5 α，挑取單克隆菌落于LB培養(yǎng)液(含有阿伯拉霉素抗生素100 μ g/mi)中培養(yǎng)過(guò)夜，至菌液較濃。提取重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗(yàn)證后，測(cè)序結(jié)果證明，重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。
[0182]2.meiC異源回補(bǔ)菌株mVL1003的構(gòu)建和篩選
[0183]將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pVL1003轉(zhuǎn)化入常規(guī)的甲基化修飾缺失的大腸桿菌E.coliET12567 (參見US7，326，782和US7，105,491)，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法，將質(zhì)粒pVL1003導(dǎo)入按照實(shí)施例2構(gòu)建的aveCaveD雙突變的菌株mVLlOOl中。選出具有阿伯拉霉素抗性的接合子，將接合子置于30°C生長(zhǎng)，即獲得meiC異源回補(bǔ)的基因工程菌株，命名為mVL1003。
[0184]除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius) mVL1003,于 2012 年 10 月 18 日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)(中國(guó)北京市)，保藏號(hào)為CGMCC N0.6678。
[0185]實(shí)施例4
[0186]重組菌株的發(fā)酵及檢測(cè)
[0187]1.種子活化及培養(yǎng)
[0188]將_80°C保存 的重組菌株mVLlOOl、mVL1002和mVL1003的孢子涂布在MS固體培養(yǎng)基(黃豆餅粉2%，D-甘露醇2%，瓊脂2%)上，30°C培養(yǎng)7天。切下約Icm2的含孢子和菌絲的瓊脂塊接入一級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米淀粉3%、豆柏粉0.8%、花生餅粉1%、酵母浸提物0.4%、淀粉酶4 μ /g淀粉)，30°C、200rpm培養(yǎng)48小時(shí)，獲得用于下一步實(shí)驗(yàn)的種子培養(yǎng)液。
[0189]2.擴(kuò)大培養(yǎng)
[0190]按10%體積的接種量將種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米淀粉14%，豆柏粉2%，酵母粉1%，鑰酸鈉0.22%，硫酸銨0.5%)，30°C、200rpm，培養(yǎng)8天。收獲發(fā)酵液，得到含有阿維菌素B2a的粗產(chǎn)物。低溫保存，用于產(chǎn)量檢測(cè)。
[0191]3.發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)
[0192]檢測(cè)產(chǎn)物準(zhǔn)備:發(fā)酵液加入4倍體積的甲醇浸泡，超聲15分鐘，離心取上清，將甲醇稀釋3倍以后用于HPLC和LC-MS檢測(cè)。
[0193]HPLC和LC-MS分析檢測(cè)條件:
[0194]儀器:Agilent1100HPLC 系統(tǒng)；
[0195]柱子=AgilentZORBAX SB-C18 柱(4.6x250mm)；
[0196]檢測(cè)波長(zhǎng):UV=245nm;
[0197]流速:lml/min;
[0198]流動(dòng)相:Α=Η20;B=甲醇；
[0199]采用85%B/15% A恒梯度洗脫條件為，洗脫時(shí)間為20min。
[0200]結(jié)果:不同菌株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果如圖2所示。
[0201]I為出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果，產(chǎn)生阿維菌素8個(gè)組分，其中B2a組分約占總組分的30%。
[0202]II為aveD點(diǎn)突變的突變株mVLlOOl發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果，只產(chǎn)生阿維菌素B組分，其中B2a組分約占總組分的42%。
[0203]III為在mVLlOO I進(jìn)行aveC敲除后突變株mVL1002的發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果，完全不產(chǎn)阿維Bla組分，僅產(chǎn)生微量的B2a組分。
[0204]IV為在mVL1002中異源回補(bǔ)meiC得到的突變株mVL1003發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析結(jié)果，只產(chǎn)生阿維菌素B2a單一組分，其中B2a組分約占總組分的95%以上。
[0205]結(jié)果表明，發(fā)明人通過(guò)對(duì)野生型除蟲鏈霉菌進(jìn)行基因工程改造，獲得菌種的發(fā)酵產(chǎn)物95wt%以上為阿維菌素B2a組份，不再產(chǎn)生阿維菌素A組分和Bla組分。
[0206]實(shí)施例5
[0207]阿維菌素B2a組份活性檢測(cè)
[0208]測(cè)試方法:對(duì)棉蚜殺蟲活性實(shí)驗(yàn):取干凈新鮮的瓜葉I小片，用小號(hào)毛筆將大小、體色一致的棉姆蟲(A phis gossypii Glover)挑選30條于其上,將葉片連試蟲一起浸入藥液中2s后取出，立即用吸水紙將棉蚜蟲周圍多余的藥液吸凈，將葉片放入50ml的塑料杯中，杯口用紗布以橡皮筋套緊以防蚜蟲逃逸，將試蟲放入(27±1) 1:相對(duì)濕度85%的恢復(fù)室中，16h后檢查結(jié)果。死亡標(biāo)準(zhǔn)為，以小號(hào)毛筆輕輕觸動(dòng)蟲體，試蟲不動(dòng)且無(wú)任何反應(yīng)者視為死亡，以死蟲數(shù)占總蟲數(shù)的百分?jǐn)?shù)為死亡率。同時(shí)設(shè)清水對(duì)照，以清水對(duì)照按Abbott公式計(jì)算校正死亡率。每藥劑設(shè)0.50、1.50和2.50mg/L三個(gè)質(zhì)量濃度，各質(zhì)量濃度下重復(fù)2~3次。
[0209]結(jié)果表明:本發(fā)明制備的阿維菌素B2a具有良好的生物活性。
[0210]實(shí)施例6
[0211]阿維菌素B2a組份作為前體轉(zhuǎn)化為其他的化合物的實(shí)驗(yàn)
[0212]阿維菌素B2a組分合成活性更優(yōu)的Bla組分的方法:通過(guò)叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙酰氯對(duì)B2a 4”和5位-OH基進(jìn)行選擇性的烷基化保護(hù)，用0_4_甲基苯基氯甲酸酯對(duì)23位-OH基進(jìn)行烷基化，將得到的烷基化產(chǎn)物在1，2，4-三氯苯中200°C水解I小時(shí)，得到C22-C23位成雙鍵的化合物。用P-甲苯磺酸處理后得到4”和5位雙羥基乙?；揎椀难苌铮詈蠹状尖c-甲醇(0.2M，60分鐘，18°C)處理得到活性更優(yōu)的Bla組分。
[0213]阿維菌素B2a組分合成伊維菌素的方法:通過(guò)叔丁基二甲基甲硅烷氧基乙酰氯對(duì)B2a 4”和5位-OH基進(jìn)行選擇性的烷基化保護(hù)，用0_4_甲基苯基氯甲酸酯對(duì)23位-OH基進(jìn)行烷基化，將得到中間體以甲苯為溶劑，偶氮二異丁腈作為催化劑進(jìn)行I小時(shí)回流反應(yīng)，得到C23位脫氧的產(chǎn)物，通過(guò)薄層色譜分離后立即在甲醇中用P-TSOH X H20處理得到4”和5位雙羥基乙酸酯修飾的C23位脫氧衍生物，最后用甲醇鈉-甲醇(0.2M，60分鐘，18°C )處理得到伊維菌素。
[0214]結(jié)果表明:本發(fā)明制備的阿維菌素B2a可以成功進(jìn)行后續(xù)的轉(zhuǎn)化合成。
[0215]在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種阿維菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述的產(chǎn)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，阿維菌素B2a組分的相對(duì)含量滿足式1:
B/A ≥ 35% 式I 其中， B為發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B2a組分的質(zhì)量； A為發(fā)酵產(chǎn)物中所有阿維菌素組分總的質(zhì)量。
2.如權(quán)利要求1所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述產(chǎn)生菌的基因組中的aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達(dá)aveD基因、或不表達(dá)AveD蛋白、或表達(dá)的AveD蛋白無(wú)功能。
3.如權(quán)利要求2所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述產(chǎn)生菌的基因組中aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達(dá)aveC基因、或不表達(dá)AveC蛋白、或AveC蛋白無(wú)功能；并且， 所述產(chǎn)生菌的基因組中含有或表達(dá)aveC的同源基因；或所述產(chǎn)生菌中表達(dá)AveC蛋白的同源蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，所述aveC的同源基因選自下組:美貝霉素(Milbemycin)生物合成基因milC、奈克馬丁(nemadectin)生物合成基因nemC,梅嶺霉素(meilingmycin)生物合成基因meiC。
5.如權(quán)利要求1所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，其特征在于，它是除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermectinius)mVL1003，保藏編號(hào)為 CGMCC N0.6678。
6.權(quán)利要求1中所述的阿維菌素產(chǎn)生菌的用途，其特征在于，它被用做發(fā)酵生產(chǎn)阿維菌素B2a組分的工程菌。
7.一種制備阿維菌素B2a組分的方法，其特征在于，包括步驟: (a)培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a的發(fā)酵產(chǎn)物；和 (b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出所述的阿維菌素B2a組分。
8.—種生產(chǎn)阿維菌素Bla組分的方法，其特征在于，包括步驟: (a)培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a組分的發(fā)酵產(chǎn)物； (b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出所述的阿維菌素B2a組分；和 (C)將分離的阿維菌素B2a轉(zhuǎn)化為阿維菌素Bla組分。
9.一種生產(chǎn)伊維菌素的方法，其特征在于，包括步驟: (a)培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的阿維菌素產(chǎn)生菌，從而獲得含有阿維菌素B2a組分的發(fā)酵產(chǎn)物； (b)從發(fā)酵產(chǎn)物中分離出所述的阿維菌素B2a組分；和 (C)將分離的阿維菌素B2a組分轉(zhuǎn)化為伊維菌素。
10.一種制備阿維菌素產(chǎn)生菌的方法，其特征在于，包括步驟: (I)對(duì)生產(chǎn)伊維菌素的出發(fā)菌進(jìn)行aveD基因和或AveD蛋白的遺傳改造，從而獲得基因組中aveD基因失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達(dá)aveD基因、或不表達(dá)AveD蛋白、或表達(dá)的AveD蛋白無(wú)功能的阿維菌素產(chǎn)生菌； 并且，在所述生產(chǎn)伊維菌素的出發(fā)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中，阿維菌素B2a組分的相對(duì)含量滿足式II:
B/A < 35% 式II 其中， B為發(fā)酵產(chǎn)物中阿維菌素B2a組分的質(zhì)量； A為發(fā)酵產(chǎn)物中所有阿維菌素組分總的質(zhì)量。
11.一種基因組合，其特征在于，所述的基因組合與出發(fā)(或原始)的生產(chǎn)伊維菌素的基因組合相比，具有選自下組的一個(gè)或多個(gè)特征: (1)所述基因組合中，aveD基因被失活、或aveD基因功能喪失、或aveD基因缺失、或不表達(dá)aveD基因；或 (2)所述基因組合中，aveC基因被失活、或aveC基因功能喪失、或aveC基因缺失；或不表達(dá)aveC基因；并且，含有或表達(dá)aveC的同源基因。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK103834605SQ201210477320
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月21日
【發(fā)明者】劉 文, 趙群飛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所湖州生物制造創(chuàng)新中心