專利名稱：一種凈化α－玉米赤霉醇的方法及其專用免疫親和色譜柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種凈化α-玉米赤霉醇的方法及其專用免疫親和吸附色譜柱。
背景技術(shù)：
隨著生命科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)生物體內(nèi)的物質(zhì)及其變化產(chǎn)生了越來越濃厚的興趣，而生物樣本的分析就成為探索和發(fā)現(xiàn)生命奧秘的必要手段。由于生物樣本成分復(fù)雜，待測(cè)物濃度較低，而且大多數(shù)取樣量很少，這就對(duì)分析方法的選擇性及靈敏度提出了更高的要求。將免疫親和色譜(IAC，immunoaffinity chromatography)應(yīng)用于殘留分析，其高度選擇性和高親和性無疑使凈化過程簡化。與GC，HPLC聯(lián)用可使免疫學(xué)技術(shù)和理化技術(shù)在選擇性、分離能力、速度和靈敏度方面得到互補(bǔ)，彌補(bǔ)了免疫分析法(如ELISA，RIA)直接測(cè)定樣品的諸多不足。目前，該方法在抗體、激素、多肽、酶、重組蛋白、受體病毒及小分子化合物的分析中被廣泛應(yīng)用。
α-玉米赤霉醇(α-Zearalanol，ZER)屬于雷羧酸內(nèi)酯類非甾體同化激素，曾作為生長促進(jìn)劑應(yīng)用于反芻動(dòng)物，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成作用。α-玉米赤霉醇具有弱雌激素作用，它在動(dòng)物組織中的殘留會(huì)影響人類健康，輕者引起人體性機(jī)能紊亂，重者影響第二性征的正常發(fā)育，在外部條件誘導(dǎo)下，這類物質(zhì)可能致癌。同時(shí)，α-玉米赤霉醇排出動(dòng)物體外后，還可經(jīng)飲水和食物造成二次污染和環(huán)境污染，我國已禁止其用于所有食品動(dòng)物，在所有食用組織不得檢出。
目前檢測(cè)α-玉米赤霉醇的方法主要有薄層色譜法(TLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液-質(zhì)聯(lián)機(jī)(LC-MS)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。這些方法的前處理利用液-液分配，常規(guī)的SPE柱凈化和分離，都在不同程度地存在著處理過程繁瑣、凈化效果差、有機(jī)溶劑浪費(fèi)多、所需時(shí)間長等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種凈化α-玉米赤霉醇的方法及其專用免疫親和吸附劑。
本發(fā)明所提供的凈化α-玉米赤霉醇的免疫親和吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的α-玉米赤霉醇單克隆抗體組成；所述α-玉米赤霉醇單克隆抗體是以α-玉米赤霉醇半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述α-玉米赤霉醇半抗原是將α-玉米赤霉醇與琥珀酸酐反應(yīng)得到ZER-7-半琥珀酸酯，即為α-玉米赤霉醇半抗原。
所述載體蛋白可為牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用載體蛋白。
α-玉米赤霉醇是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明將α-玉米赤霉醇與琥珀酸酐反應(yīng)，形成半抗原，這樣突出了α-玉米赤霉醇半抗原決定簇的特征結(jié)構(gòu)，然后再采用混合酸酐法將α-玉米赤霉醇半抗原與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)成免疫原，α-玉米赤霉醇半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對(duì)免疫不利，α-玉米赤霉醇與卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)的結(jié)合摩爾比分別為8∶1和10∶1。
所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠等，優(yōu)選為Sepharose 4B。
所述α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體優(yōu)選為α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體。
所述α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體優(yōu)選為α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體。
所述α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
所述免疫親和吸附劑可裝載入柱中制成免疫親和色譜柱，該免疫親和色譜柱也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
含有上述免疫親和吸附劑或免疫親和色譜柱的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述試劑盒中還包括洗脫液，所述洗脫液可為甲醇。
所述試劑盒中還包括洗滌液、保存液；所述洗滌液為pH7.4，0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述0.01mol/L磷酸鹽緩沖液比例為1L中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g；所述保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
該免疫親和吸附劑基于免疫反應(yīng)和色譜反應(yīng)，適合從生物樣品(如肌肉、肝、肺、腎、血漿)中提純?chǔ)?玉米赤霉醇，便于殘留分析。在該免疫親和吸附劑中，抗體和溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯(lián)率是96.7±1.5％，動(dòng)態(tài)柱容量為2500-3000ng，在使用了15次后柱容量為總柱容量的46％左右，保存期為1年。
本發(fā)明所提供的提純?chǔ)?玉米赤霉醇的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理將動(dòng)物組織樣品以5g的量加入5mL甲醇，渦動(dòng)混勻，3500g離心10分鐘，收集上清液，置于-20℃1小時(shí)，過0.25μM微孔濾膜得到樣品溶液。
2)將步驟1)得到的樣品溶液過免疫親和色譜柱，然后用洗滌液洗滌，再用上述洗脫液洗脫，得到純化的α-玉米赤霉醇溶液。
本發(fā)明的免疫親和吸附劑具有高選擇性，使樣品前處理過程大大簡化，尤其適用于肌肉、肝和血漿中微量ZER的前處理，分析質(zhì)量得到改善。免疫親和吸附劑的高選擇性使得α-玉米赤霉醇分析方法的檢測(cè)限將主要取決于取樣量，這是單純理化手段難以達(dá)到的；本發(fā)明的免疫親和吸附劑對(duì)待測(cè)組分有很強(qiáng)的保留和濃縮能力，只要加樣量不超過柱容量，在實(shí)測(cè)樣品條件下免疫親和吸附劑對(duì)組分的保留能力幾乎不受樣品體積或組分濃度的影響。本發(fā)明的方法對(duì)組分凈化的同時(shí)還可提供定性信息。本發(fā)明的方法水相操作，操作簡單，凈化效果好，免疫親和色譜柱能重復(fù)使用，能節(jié)省大量的有機(jī)溶劑，降低分析成本和環(huán)境污染。本發(fā)明的提純方法結(jié)合色譜法高效檢測(cè)α-玉米赤霉醇的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測(cè)定技術(shù)直接測(cè)定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確差，或理化方法選擇性低等不足，體現(xiàn)了免疫學(xué)技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機(jī)制的互補(bǔ)性。


圖1為添加α-玉米赤霉醇的牛肌肉樣品凈化效果氣質(zhì)色譜2為α-玉米赤霉醇單克隆抗體免疫原的制備流程圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、提純?chǔ)?玉米赤霉醇的免疫色譜柱的制備1、α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體的制備半抗原的合成將α-玉米赤霉醇與琥珀酸酐反應(yīng)得到ZER-7-半琥珀酸酯，即為α-玉米赤霉醇半抗原。具體步驟如下所述1)取α-玉米赤霉醇520mg，琥珀酸酐480mg，溶于20ml吡啶中，在氮?dú)猸h(huán)境下加熱回流4小時(shí)。
2)步驟1)的反應(yīng)產(chǎn)物減壓蒸發(fā)，將殘留物溶于乙酸乙酯中，然后用0.5mol/L硫酸洗滌3次，棄去水相，得到有機(jī)相。
3)步驟2)得到的有機(jī)相用飽和碳酸鈉溶液萃取3次，保留水相，再用乙酸乙酯洗滌3次。
4)水相用4mol/L的HCl調(diào)pH至4.0，得到ZER-7-半琥珀酸酯沉淀，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，ZER-7-半琥珀酸酯即存在于有機(jī)相中。有機(jī)相用蒸餾水洗滌2次，用無水硫酸鈉干燥，氮?dú)獯蹈伞埩艄腆w溶于最小體積的氯仿中，加入石油醚，得到ZER-7-半琥珀酸酯沉淀即為α-玉米赤霉醇半抗原。
半抗原合成的反應(yīng)式為 免疫原的制備采用混合酸酐法，將α-玉米赤霉醇半抗原與蛋白質(zhì)載體牛血清蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)，制成BSA-ZER或OVA-ZER偶聯(lián)物，即免疫原。
具體步驟如下所述(免疫原制備流程圖如圖2所示)1)取ZER-7-半琥珀酸酯300mg，三正丁胺132mg，溶于20ml二噁烷中，溶液冷卻至10℃，邊攪拌邊加入氯甲酸異丁酯100mg，溶液冷卻至4℃，攪拌45min。
2)4℃條件下，取BSA 650mg，加入2.5ml 1mol/L氫氧化鈉，加入130ml二噁烷與水按1∶1比例配制的混合液，最終得到BSA溶液，將步驟1)中得到的反應(yīng)液體加入該BSA溶液中，4℃攪拌1小時(shí)后加入1ml 1mol/L氫氧化鈉，4℃攪拌4小時(shí)，蒸餾水透析12小時(shí)。
3)用1mol/L鹽酸將步驟2)得到的溶液調(diào)pH至2.0，即產(chǎn)生Z7BSA沉淀，將沉淀置于100ml蒸餾水中，用1M氫氧化鈉調(diào)pH至11.0，沉淀溶解。加入丙酮(4℃，300ml)，用1M鹽酸調(diào)pH至2.0，Z7BSA再次沉淀出來，收集，再重復(fù)丙酮沉淀過程3次。
4)將步驟3)得到的Z7BSA沉淀溶于300ml蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至11.0。2000g離心10min，棄沉淀，上清液對(duì)蒸餾水4℃透析48h，每6～8小時(shí)換一次透析液。透析后，加入0.01％硫柳汞，小瓶分裝，-20℃保存。
動(dòng)物免疫采用BALA/C小鼠作為免疫動(dòng)物、以上述α-玉米赤霉醇半抗原與蛋白質(zhì)載體的偶聯(lián)物BSA-ZER偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為100μg/只(0.1ml)，加等體積的完全弗氏佐劑乳化，進(jìn)行首次免疫。兩周后，取同樣量免疫抗原加不完全弗氏佐劑，乳化，進(jìn)行第二次免疫。間隔兩周，進(jìn)行第三次免疫，方法同第二次免疫。再隔兩周，進(jìn)行第四次免疫，方法同第二次免疫。融合前3天再對(duì)BALB/C小鼠加強(qiáng)免疫一次，腹腔注射100μg抗原，不加佐劑。融合前摘眼球放血，獲得陽性血清，然后將小鼠拉頸脫臼處死，取脾臟。
細(xì)胞融合脾細(xì)胞按5∶1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
雜交瘤細(xì)胞克隆化采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，直到得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株-α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604。α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604已于2006年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)。
單克隆雜交瘤細(xì)胞的保存在液氮-20℃下保存，使用時(shí)37℃水浴快速解凍。
單克隆抗體大量生長及提純采用體內(nèi)誘生法，將BALB/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.16045×105-106個(gè)/只，7-10天后采集腹水。
2、單克隆抗體的純化采用辛酸-飽和硫酸銨法純化單克隆抗體。其具體步驟如下取上述方法腹腔注射α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCCNo.1604得到的腹水5mL，加入0.06mol/L、pH4.0的NaAc-HAc緩沖液10mL，攪拌均勻，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.2。在室溫下邊攪拌邊加入165μL辛酸，攪拌30min。在4℃6000g離心30min，取上清液，用1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.2。然后在4℃條件下，邊攪拌邊加入15mL飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨的最終質(zhì)量百分含量為50％，攪拌30min后，在4℃6000g離心30min，棄上清液，將沉淀懸浮于5.5mL0.01M pH7.2的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)中。將沉淀懸浮液邊攪拌邊加入4.5mL飽和硫酸銨溶液，此操作在4℃條件下完成。此時(shí)硫酸銨終濃度為45％，攪拌30min后，4℃6000g離心30min，棄上清液，將沉淀懸浮于1mL 0.01M pH7.2PBS中。將沉淀懸浮液裝入透析袋中，用0.01M pH7.2PBS透析，4～6小時(shí)換液-次，換液2～3次。測(cè)定單克隆抗體溶液在280nm和260nm處的OD值，結(jié)果表明得到純化的α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體。
3、免疫色譜柱(IAC)的制備基質(zhì)的準(zhǔn)備取溴化氰活化的Sepharose 4B干凍粉，在盛有1.0mmol 1-1HCl的G3漏斗中膨脹。
抗體IgG的準(zhǔn)備用0.1mol/L的NaHCO3溶液將純化的α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體稀釋，調(diào)溶液的pH值為8.4。
偶聯(lián)反應(yīng)將膨脹的溶膠用0.1mol/L的NaHCO3溶液平衡后，轉(zhuǎn)入上述用0.1mol/L的NaHCO3溶液將純化的α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCCNo.1604分泌的單克隆抗體溶液中，混合，4℃下緩慢攪拌20-24hr。40mLPBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉29.3g)洗去未偶聯(lián)抗體并測(cè)其偶聯(lián)率，偶聯(lián)率的檢測(cè)結(jié)果表明，α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體與溴化氰活化的Sepharose 4B的偶聯(lián)率是97.0±1.5％。
活化位點(diǎn)的封閉將上述偶聯(lián)后的凝膠轉(zhuǎn)入盛有0.1mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中，混合，4℃下緩慢攪拌2hr，以封閉未偶聯(lián)的活化位點(diǎn)。
洗滌凝膠用5倍體積的0.1mol/L、pH4.0醋酸鹽緩沖液和0.1mol/L、pH8.0Tris-HCl緩沖液交替沖洗3次。用0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡后，抽干的凝膠轉(zhuǎn)入0.01mol/L、pH7.4的含0.1％NaN3磷酸鹽緩沖液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN31g)中，4℃下存放備用。
裝柱將偶聯(lián)有α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體的免疫吸附劑轉(zhuǎn)入到含G3濾板的層析柱里，制成偶聯(lián)有α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱(IAC柱)。
5、IAC柱容量的確定將步驟4制備的偶聯(lián)有α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCCNo.1604分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱，用10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)洗柱，輕輕上下晃動(dòng)IAC柱，趕走柱里的氣泡，再以10ml 0.01mol/L、pH7.4的PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)平衡。將含有100ng·ml-1α-玉米赤霉醇的PBS-甲醇溶液(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，200mL甲醇)連續(xù)加到IAC柱，自然重力下流出。當(dāng)柱達(dá)到飽和后(流出液中α-玉米赤霉醇和加樣液濃度相同)，用10ml PBS(1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g)、15ml水洗滌IAC柱，再用4ml 30％(體積百分含量)的甲醇水溶液洗滌，除去干擾雜質(zhì)。最后用4ml甲醇將α-玉米赤霉醇洗脫，自然重力下流出，收集，吹干，加入0.05ml的雙-三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFA)試劑，渦動(dòng)，60℃衍生化15min，進(jìn)行GC/MS測(cè)定。計(jì)算出動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量。動(dòng)態(tài)柱容量(dynamic column capacity)是指每毫升免疫吸附劑(或柱床體積)對(duì)待測(cè)物的最大吸收值。絕對(duì)柱容量(specific column capacity)是指每毫克固定抗體對(duì)待測(cè)物的最大結(jié)合容量。結(jié)果表明偶聯(lián)有α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱的動(dòng)態(tài)柱容量和絕對(duì)柱容量分別為2810ng/mL，401ng/mg。
實(shí)施例2、偶聯(lián)有鼠單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒的制備及其對(duì)α-玉米赤霉醇的凈化效果1、凈化α-玉米赤霉醇的試劑盒的制備主要由盒體，免疫色譜柱(IAC柱)，標(biāo)準(zhǔn)α-玉米赤霉醇試劑、洗滌液，洗脫液，保存液，海綿托架所組成，海綿托架上設(shè)有孔和凹槽。海綿托架的凹槽內(nèi)有裝有標(biāo)準(zhǔn)α-玉米赤霉醇試劑、洗滌液，洗脫液，保存液的試劑瓶，海綿托架7的孔內(nèi)裝有IAC柱。其中免疫色譜柱為實(shí)施例1制備的偶聯(lián)有α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱。
洗滌液為磷酸鹽緩沖液(0.01M，pH7.4)，配制方法為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g。
洗脫液為色譜級(jí)的甲醇。
保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
將含有偶聯(lián)有α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱的試劑盒分別放在4℃，有效期為12個(gè)月。
2、α-玉米赤霉醇的凈化效果實(shí)驗(yàn)IAC提取原理是，將特異性抗體α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體和惰性基質(zhì)偶聯(lián)，制備免疫吸附劑，裝柱。當(dāng)含α-玉米赤霉醇的混合物流過IAC柱時(shí)，固定抗體選擇性地結(jié)合α-玉米赤霉醇，其它不被識(shí)別的樣品雜質(zhì)則不受阻礙地流出IAC柱，經(jīng)洗滌后，將抗原-抗體復(fù)合物解離洗脫，α-玉米赤霉醇得到凈化或分離。IAC柱經(jīng)再生處理后可重復(fù)使用。
檢測(cè)樣品的處理取牛肌肉樣品(取自未接觸過α-玉米赤霉醇的牛)各5g于50ml塑料離心管中，每個(gè)樣本按2.5μg/kg濃度的α-玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加，再加入5mL甲醇，渦動(dòng)1min，3500g 10min，將上清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)干凈的離心管中，重復(fù)提取，合并上清液。放入-20℃冰柜1hr，過0.25μM微孔濾膜。取過膜溶液5mL與20mL上述試劑盒中的洗滌液混勻，備用。
將偶聯(lián)有α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱平衡到室溫，用10ml上述試劑盒中的洗滌液沖洗，然后將上述的樣品溶液過柱，用15ml水洗滌，然后再加入4ml 30％(體積百分含量)的甲醇水溶液洗滌，目的是為了除去非特異性吸附的雜質(zhì)。用4ml洗脫液洗脫，在50℃N2氣流下吹干，然后加入50μl衍生化試劑BSTFA，渦動(dòng)，60℃衍生化15分鐘，然后進(jìn)行GC/MS分析，測(cè)定α-玉米赤霉醇的含量，標(biāo)準(zhǔn)品為α-玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)品。IAC柱用20ml的保存液平衡保存在4℃冰箱里備用。測(cè)定結(jié)果表明，用IAC進(jìn)行樣品凈化，不干擾藥物色譜峰，能夠完全分離，說明制備的IAC非特異性吸附極小。其中偶聯(lián)有α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2 CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體的免疫色譜柱對(duì)于添加2.5μg/kg濃度的α-玉米赤霉醇牛肌肉樣品中的凈化效果如圖1所示，圖1中1為α-玉米赤霉醇峰，A為添加2.5μg/kg濃度的α-玉米赤霉醇的牛肌肉樣品，B為2.0μg/kg濃度的α-玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)品。
權(quán)利要求
1.一種凈化α-玉米赤霉醇的免疫親和吸附劑，是由固相載體和與其偶聯(lián)的α-玉米赤霉醇單克隆抗體組成；所述α-玉米赤霉醇單克隆抗體是以α-玉米赤霉醇半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；所述α-玉米赤霉醇半抗原是將α-玉米赤霉醇與琥珀酸酐反應(yīng)得到的ZER-7-半琥珀酸酯，即為α-玉米赤霉醇半抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述固相載體為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠，優(yōu)選為Sepharose 4B；所述α-玉米赤霉醇單克隆抗體為α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的吸附劑，其特征在于所述α-玉米赤霉醇鼠單克隆抗體為α-玉米赤霉醇的單克隆雜交瘤細(xì)胞株A-1-2CGMCC No.1604分泌的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
5.裝載有權(quán)利要求1-4中任一所述的免疫親和吸附劑的免疫親和色譜柱。
6.含有權(quán)利要求1-4中任一所述的免疫親和吸附劑的試劑盒或含有權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜柱的試劑盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗脫液，所述洗脫液為甲醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述試劑盒，其特征在于所述試劑盒中還包括洗滌液、保存液；所述洗滌液為pH7.4，0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述0.01mol/L磷酸鹽緩沖液為1L中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g的溶液；所述保存液為1L溶液中含有磷酸二氫鉀0.27g，12水合磷酸氫二鈉2.86g，氯化鉀0.2g，氯化鈉8.8g，NaN30.2g，pH7.4。
9.一種提純?chǔ)?玉米赤霉醇的方法，包括以下步驟1)樣品的前處理將動(dòng)物組織樣品以5g的量加入5mL甲醇，渦動(dòng)混勻，3500g離心10分鐘，收集上清液，置于-20℃ 1hr，過0.25μM微孔濾膜得到樣品溶液；2)將步驟1)得到的樣品溶液過權(quán)利要求5所述的免疫親和色譜柱，然后用權(quán)利要求8所述的洗滌液洗滌，再用權(quán)利要求7所述的洗脫液洗脫，得到純化的α-玉米赤霉醇溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物組織樣品包括肌肉、肝、肺、腎和血漿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種凈化α－玉米赤霉醇的方法及其專用免疫親和色譜柱。該色譜柱的填料是凈化α－玉米赤霉醇的免疫親和吸附劑，該免疫親和吸附劑是由固相載體和與其偶聯(lián)的α－玉米赤霉醇單克隆抗體組成；所述α－玉米赤霉醇單克隆抗體是以α－玉米赤霉醇與載體蛋白的偶聯(lián)物為免疫原得到的；本發(fā)明的提純方法結(jié)合色譜法高效檢測(cè)α－玉米赤霉醇的含量，彌補(bǔ)了單純免疫測(cè)定技術(shù)直接測(cè)定樣本的信息量太少、定量準(zhǔn)確差，或理化方法選擇性低等不足，體現(xiàn)了免疫學(xué)技術(shù)和常規(guī)理化技術(shù)在分析機(jī)制的互補(bǔ)性。
文檔編號(hào)G01N33/547GK1808119SQ20061000724
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2006年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月15日
發(fā)明者沈建忠, 史為民, 張偉, 何方洋, 王鶴佳 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)